孫鵬宋遠(yuǎn)周曉晶

肝細(xì)胞肝癌中極性蛋白AF-6mRNA的表達(dá)及對(duì)侵襲的影響分析

孫鵬1宋遠(yuǎn)1周曉晶2

目的 探討肝細(xì)胞肝癌中極性蛋白AF-6mRNA的表達(dá)及其對(duì)侵襲的影響。方法 采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)的方法，對(duì)28對(duì)癌細(xì)胞、ANLT及不同細(xì)胞系中的AF-6mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，分析AF-6mRNA對(duì)侵襲的影響。結(jié)果 26例肝細(xì)胞肝癌中AF-6mRNA呈現(xiàn)低表達(dá)，發(fā)生率為92.9%；肝癌細(xì)胞株中AF-6mRNA表達(dá)低于正常桿細(xì)胞株（P＜0.05）；低侵襲轉(zhuǎn)移能力細(xì)胞系中AF-6mRNA表達(dá)高于高侵襲轉(zhuǎn)移能力細(xì)胞系（P＜0.05）。結(jié)論 肝細(xì)胞肝癌中AF-6mRNA低表達(dá)可能與高侵襲能力有關(guān)。

肝細(xì)胞肝癌；AF-6mRNA；侵襲

肝細(xì)胞癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率較高，會(huì)影響患者預(yù)后。當(dāng)前，臨床上尚未尋找到有效的方法，對(duì)術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移進(jìn)行控制[1]。AF-6是一種極性蛋白，為細(xì)胞緊密連接的成分[2]。有研究認(rèn)為，在胰腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移中，AF-6mRNA發(fā)揮著重要的作用[3]。但臨床上針對(duì)其在肝細(xì)胞肝癌中的表達(dá)及侵襲轉(zhuǎn)移中影響的研究仍較少[4]?；诖耍狙芯繖z測(cè)了癌細(xì)胞、ANLT及不同細(xì)胞系中的AF-6mRNA表達(dá)水平，分析其對(duì)侵襲轉(zhuǎn)移的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2015年6月～2016年6月本院收治的28對(duì)肝細(xì)胞肝癌患者的肝癌組織及癌旁組織標(biāo)本。28例標(biāo)本中，男20例，女8例；患者平均年齡（45.3±2.4）歲，平均腫塊大小（3.1±0.9）cm。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑 購自上海生命技術(shù)科學(xué)院的正常肝細(xì)胞株L02、肝癌HepG2、HCCLM3等；購自羅氏公司的Faststart Universal SYBRGreen Master瑞士試劑盒；購自Gibco公司的Taq DNA聚合酶等。

1.2.2 培養(yǎng)細(xì)胞系 分別復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代并凍存人肝L02細(xì)胞及肝癌HepG2、HCCLM3等。

1.2.3 提取肝癌組織標(biāo)本及細(xì)胞株總RNA 將1.0 ml裂解液溶入研磨好的新鮮肝癌及ANLT標(biāo)本中，以移液器進(jìn)行吹打；將0.2 ml氯仿溶入，進(jìn)行15 s劇烈震蕩，靜置3 min。做10 000 r離心處理，持續(xù)15 min。在新管中轉(zhuǎn)移上層水相，溶入0.5 ml異丙醇沉淀RNA，靜置10 min；做10 000 r離心處理，持續(xù)10 min，將上清液移去，將100 μl無RNA酶水溶入，充分溶解后，置入零下80℃冰箱中保存。

1.2.4 定量PCR檢測(cè) 按照GeneBank數(shù)據(jù)庫中人AF-6基因的序列，內(nèi)參為人GAPDH，交由上海生工生物技術(shù)公司合成，嚴(yán)格按照試劑盒使用說明書進(jìn)行操作。PCR反應(yīng)：95℃預(yù)變性，持續(xù)10 min；95℃變性，持續(xù)15 s；60℃退火，持續(xù)60 s；72℃延伸，持續(xù)30 s，持續(xù)40個(gè)循環(huán)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

以SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)滿足正態(tài)且方差齊性時(shí)，以獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；數(shù)據(jù)滿足正態(tài)但方差不齊時(shí)，以校正t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AF-6mRNA在肝癌組織中的表達(dá)

本組28對(duì)組織標(biāo)本中，26例肝細(xì)胞肝癌中AF-6mRNA呈現(xiàn)低表達(dá)，發(fā)生率為92.9%。

2.2 不同細(xì)胞株中AF-6mRNA表達(dá)水平

設(shè)正常肝細(xì)胞株L02相對(duì)表達(dá)量為1。肝癌HepG2、HCCLM3、MHCC97-H的AF-6mRNA表達(dá)分別為（0.6±0.1）、（0.2±0.1）、（0.3±0.1），均低于正常桿細(xì)胞株，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué) 意 義（t=25.298、50.596、44.272，P=0.000、0.000、0.000）；低侵襲轉(zhuǎn)移能力細(xì)胞系肝癌HepG2中AF-6mRNA表達(dá)高于高侵襲轉(zhuǎn)移能力細(xì)胞系HCCLM3、MHCC97-H，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=17.889、13.416，P=0.000、0.000）。

3 討論

僅有部分早期確診的肝癌患者能及時(shí)進(jìn)行手術(shù)治療，延長生存時(shí)間，但整體上病死率仍居高不下[5]。影響肝癌患者預(yù)后的關(guān)鍵，

是較高的術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率。這就需要尋找肝細(xì)胞肝癌患者術(shù)后潛在復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移分子機(jī)制。

AF-6為極性蛋白，在維持細(xì)胞發(fā)育、修復(fù)損傷、保持組織完整性中發(fā)揮著重要的作用，且在卵巢癌、乳腺癌、白血病等多種癌癥中存在異常表達(dá)[6]。有研究認(rèn)為，在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過程中，極性蛋白的異常表達(dá)及錯(cuò)誤定位具有重要意義[7]。但是，臨床上仍缺乏對(duì)肝細(xì)胞肝癌中AF-6mRNA表達(dá)及其對(duì)侵襲影響的研究[8]。

本研究中，26例肝細(xì)胞肝癌中AF-6mRNA呈現(xiàn)低表達(dá)。提示在肝癌的發(fā)生與發(fā)展過程中，AF-6mRNA可能發(fā)揮著一定的作用。此外，肝癌HepG2、HCCLM3、MHCC97-H肝癌細(xì)胞株中AF-6mRNA表達(dá)低于正常桿細(xì)胞株（P＜0.05）。而且，低侵襲轉(zhuǎn)移能力細(xì)胞系肝癌HepG2中AF-6mRNA表達(dá)高于高侵襲轉(zhuǎn)移能力細(xì)胞系HCCLM3、MHCC97-H（P＜0.05）。由此可知，AF-6mRNA表達(dá)的變化可能與肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移有一定的相關(guān)性。此外，在肝細(xì)胞肝癌組織及細(xì)胞中，AF-6mRNA呈現(xiàn)低表達(dá)。因此AF-6mRNA表達(dá)的變化可能與肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，提示AF-6可能會(huì)抑制肝細(xì)胞肝癌侵襲轉(zhuǎn)移。

綜上所述，肝細(xì)胞肝癌中AF-6mRNA低表達(dá)可能與高侵襲能力有關(guān)，今后可能發(fā)展成為分子、基因水平治療肝細(xì)胞肝癌的潛在靶點(diǎn)，需引起高度關(guān)注。

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[2] 陳志平. MiR-573/apoM/Bcl2A1途徑對(duì)肝細(xì)胞凋亡和肝癌形成影響及其機(jī)制研究[D]. 廣州：南方醫(yī)科大學(xué)，2015：34-35.

[3] 李慶軍. miR-10b通過抑制CADM1表達(dá)促進(jìn)人肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究[D]. 西安：第四軍醫(yī)大學(xué)，2013：15-16.

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Expression of Polar Protein AF-6mRNA in Hepatocellular Carcinoma and Its Effect on Invasion

SUN Peng1SONG Yuan1ZHOU Xiaojing21Department of Gastroenterology, Jilin Provincial People’s Hospital, Changchun Jilin 130021, China, 2 Department of Biochemistry and Molecular Biology, Basic Medical College, Changchun University of Chinese Medicine, Changchun Jilin 130017, China

Objective To investigate the expression of AF-6mRNA protein and its effect on the invasion of hepatocellular carcinoma. Methods Using real-time quantitative PCR detection method, the expression levels of AF-6mRNA in 28 pairs of cancer cells, ANLT and cell lines were detected, and the influence of AF-6mRNA on the invasion was analyzed. Results 26 cases of AF-6mRNA showed low expression in hepatocellular carcinoma, the incidence rate was 92.9%, the rod was significantly lower than the normal cell line AF-6mRNA expression in hepatocellular carcinoma cell line (P＜0.05), was obviously higher than that of invasion and metastasis of AF-6mRNA cells expressing ability in cell lines with low metastasis (P＜0.05). Conclusion Low expression of AF-6mRNA in hepatocellular carcinoma may be related to high invasive ability.

Hepatocellular carcinoma, AF-6Mrna, Attack

R735

A

1674-9308（2016）33-0237-02

10.3969/j.issn.1674-9308.2016.33.137

吉林省衛(wèi)生計(jì)生科研計(jì)劃課題（20152084）

基金項(xiàng)目：吉林省衛(wèi)生計(jì)生自籌經(jīng)費(fèi)課題（2015s2c06）

1 吉林省人民醫(yī)院消化內(nèi)科，吉林 長春 130021；2 長春中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，吉林 長春 130017

周曉晶，E-mail：589632478@qq.com