郭長(zhǎng)江,趙 文,石振廣,魏 杰,魯宏申,劉建魁

(1.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院,遼寧省水生生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧大連116023;2.云南阿穆?tīng)桏\魚(yú)集團(tuán)有限公司,云南昆明650228;3.北京鱘龍種業(yè)有限公司,北京101400)

達(dá)氏鰉養(yǎng)殖群體的胚胎發(fā)育研究

郭長(zhǎng)江1,趙 文1,石振廣2、3,魏 杰1,魯宏申2、3,劉建魁2、3

(1.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院,遼寧省水生生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧大連116023;2.云南阿穆?tīng)桏\魚(yú)集團(tuán)有限公司,云南昆明650228;3.北京鱘龍種業(yè)有限公司,北京101400)

為了解達(dá)氏鰉Huso dauricus養(yǎng)殖群體的胚胎發(fā)育過(guò)程,采用人工半干法受精獲取受精卵,研究了在水溫為(16.0±0.2)℃條件下達(dá)氏鰉養(yǎng)殖群體的胚胎發(fā)育過(guò)程及其特征。結(jié)果表明:達(dá)氏鰉成熟卵呈圓球形,為黃褐色或灰褐色,不透明,平均卵徑為3.19 mm,屬沉性黏性卵;達(dá)氏鰉受精卵歷時(shí)136 h孵化出膜,所需總積溫為2148～2592℃·h;達(dá)氏鰉受精卵的卵裂方式為特殊的輻射狀卵裂;原腸中期時(shí)動(dòng)物極細(xì)胞覆蓋胚胎2/3,心跳期心臟呈“c”型,尾末端到達(dá)間腦或中腦時(shí)大量仔魚(yú)出膜;根據(jù)胚胎發(fā)育過(guò)程的形態(tài)特征,可將達(dá)氏鰉胚胎分為受精卵、卵裂、囊胚、原腸、神經(jīng)胚、器官形成、心跳和出膜期8個(gè)發(fā)育階段,共36個(gè)時(shí)期。研究表明,達(dá)氏鰉胚胎發(fā)育過(guò)程中所需積溫略高于鱘科其他魚(yú)類。

達(dá)氏鰉;胚胎發(fā)育;發(fā)育分期;形態(tài)特征

達(dá)氏鰉Huso dauricus隸屬于脊索動(dòng)物門(mén)Chordata、硬骨魚(yú)綱Osteichthyes、輻鰭亞綱Actinopterygii、軟骨硬鱗總目Chondrostei、鱘形目Acipenseriformes、鱘亞科Acipenseryini、鰉屬Huso,又名黑龍江鰉,是鱘科魚(yú)類中個(gè)體最大的一種。在20世紀(jì)初期,達(dá)氏鰉地理分布廣,數(shù)量較少,常見(jiàn)于中國(guó)黑龍江干流、松花江、烏蘇里江和興凱湖等水域[1]。21世紀(jì)以來(lái),由于環(huán)境污染和人工捕撈等原因,達(dá)氏鰉的自然分布水域變得非常狹窄,目前,達(dá)氏鰉野生種群幾乎只棲息在黑龍江干流,其他水域均已近絕跡。

達(dá)氏鰉的經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高,魚(yú)卵、魚(yú)肉、內(nèi)臟、魚(yú)皮等均有相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和實(shí)用價(jià)值。用其魚(yú)卵加工的魚(yú)子醬,被譽(yù)為“黑色黃金”,主要銷售市場(chǎng)為東亞及歐美地區(qū)。達(dá)氏鰉成魚(yú)個(gè)體碩大(體質(zhì)量可達(dá)1000 kg以上),性成熟晚(一般在14～20齡),分布數(shù)量較少。其卵巢屬于裸卵巢,排卵時(shí)卵全部排入腹腔內(nèi),雌魚(yú)的懷卵量通常在(25～400)萬(wàn)粒不等,人工繁殖期間,雌魚(yú)對(duì)水溫的要求較高,取卵時(shí)機(jī)較難把控。因此,達(dá)氏鰉的人工繁殖難度較大。早在20世紀(jì)50年代,俄羅斯學(xué)者金茲堡等[2]就對(duì)閃光鱘Acipenser stellatus、史氏鱘A.schrenckii、歐洲鰉Huso huso等鱘科魚(yú)類胚胎發(fā)育進(jìn)行了詳細(xì)研究,對(duì)今后的此類研究具有重要指導(dǎo)作用。目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)達(dá)氏鰉的繁殖生物學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)、營(yíng)養(yǎng)成分分析和剝制標(biāo)本技術(shù)的相關(guān)研究較多[3-8],但尚未見(jiàn)有關(guān)達(dá)氏鰉胚胎發(fā)育的詳細(xì)報(bào)道。本試驗(yàn)中,對(duì)養(yǎng)殖達(dá)氏鰉胚胎發(fā)育過(guò)程進(jìn)行了觀察記錄,并對(duì)其特點(diǎn)進(jìn)行分析,旨在為提高達(dá)氏鰉人工繁殖率,推進(jìn)其健康養(yǎng)殖、資源增殖和保護(hù)提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用達(dá)氏鰉親魚(yú)取自云南阿穆?tīng)桏\魚(yú)集團(tuán)有限公司河北省邯鄲市涉縣鱘魚(yú)養(yǎng)殖生態(tài)基地,每年的5—7月份是達(dá)氏鰉的繁殖季節(jié),在此期間,選擇全人工繁殖的16齡達(dá)氏鰉雌魚(yú)4尾,體質(zhì)量為104～206 kg,14～16齡雄性8尾,體質(zhì)量為36～74 kg。平均水溫為17.6℃。

1.2 方法

1.2.1 成熟度鑒定 從外觀上觀察,雌魚(yú)腹部膨脹、生殖孔紅潤(rùn)外翻時(shí),用取卵器取出的達(dá)氏鰉卵子呈黃褐色或灰褐色,有光澤,具彈性,此時(shí)性腺處于Ⅳ期末期,正值鰉魚(yú)的最佳產(chǎn)卵期[9]。在連續(xù)變倍體視顯微鏡(COIC-ZSA302)下觀察約1000粒此時(shí)期的卵,測(cè)得卵徑為3.00～3.38 mm,在動(dòng)物極可觀察到1～3個(gè)暗色的色素環(huán)和位于極端的光亮極性斑點(diǎn)。雄魚(yú)腹部狹長(zhǎng),生殖孔緊閉不外翻,皮膚黏滑,輕壓腹部即能流出乳白色精液。取一滴滴入清水,呈同心圈狀且快速下沉散開(kāi),鏡檢發(fā)現(xiàn)精子呈直線運(yùn)動(dòng),活力較強(qiáng),成熟度較高。將精液移入干燥的玻璃容器中,在2～4℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 人工催產(chǎn)和孵化 催產(chǎn)采用胸鰭基部二次注射法[10],通過(guò)注射LRH-A2進(jìn)行人工催熟。具體方法是第一次注射總量的10％～20％,第二次注射剩余劑量,兩針相隔10 h左右。注射后將雌、雄魚(yú)分開(kāi),以防止魚(yú)卵在池中受精。用擠壓結(jié)合手術(shù)法取卵,用半干受精法進(jìn)行人工受精。受精卵用200 g/L的滑石粉溶液脫黏,再用清水清洗消毒后轉(zhuǎn)入尤先科孵化器。孵化水溫為(16.0±0.2)℃,溶解氧為8.64～8.81 mg/L,pH為6.8～7.3。

1.2.3 胚胎發(fā)育過(guò)程觀察 在連續(xù)變倍體視顯微鏡下觀察受精卵孵化期內(nèi)的外部形態(tài)變化。第一次為卵裂發(fā)生前期,每15～30 min觀察1次;從第一次卵裂開(kāi)始至囊胚期末期,每1～3 h觀察1次;原腸期之后基本保持每3～6 h觀察1次,直至仔魚(yú)孵出。每次觀察取樣均在30粒以上。發(fā)育時(shí)間的確定按照至少有50％的受精卵到達(dá)該時(shí)期的時(shí)間來(lái)計(jì)算。用游標(biāo)卡尺測(cè)量卵長(zhǎng)徑,用CanonA 4000IS照相機(jī)拍照并用Photoshop CS5編排照片。根據(jù)達(dá)氏鰉胚胎發(fā)育過(guò)程及形態(tài)特點(diǎn),并參照其他學(xué)者的工作[11-12],對(duì)達(dá)氏鰉胚胎發(fā)育進(jìn)行分期。

2 結(jié)果與分析

達(dá)氏鰉從受精卵到孵出仔魚(yú)歷經(jīng)136～160 h,水溫為15.8～16.2℃。達(dá)氏鰉的胚胎發(fā)育過(guò)程共分8個(gè)階段,即合子(受精卵)期、卵裂期、囊胚期、原腸胚期、神經(jīng)胚期、器官形成期、心跳期和出膜期。根據(jù)每個(gè)階段的發(fā)生順序和形態(tài)特征,又細(xì)分為36個(gè)時(shí)期,各個(gè)時(shí)期發(fā)育的主要特征和所需時(shí)間詳見(jiàn)表1、圖1和圖2。

2.1 受精卵

與其他大部分鱘科魚(yú)類相比,達(dá)氏鰉的成熟卵相對(duì)較大,呈圓球形,卵子呈黃褐色或灰褐色,有光澤,具彈性。未受精的卵卵徑為3.00～3.38 mm,受精15 min之后的卵,最外面的膠膜開(kāi)始膨脹,變得渾圓透亮,在體視顯微鏡(×0.7)下就能清楚地看到膜的成層結(jié)構(gòu)。卵表面是比較厚的膠膜,具有黏著性,可附著池塘水中的泥沙,緊貼在卵上的是內(nèi)卵膜,在內(nèi)卵膜和膠膜之間的是外卵膜。但剛受精的卵依然側(cè)臥水底,動(dòng)物極有明亮的極性斑,動(dòng)物極上環(huán)繞著1～3個(gè)暗色的同心圈,這些特點(diǎn)與未受精卵一致(圖1-A)。受精后15～20 min,大部分受精卵在膜內(nèi)開(kāi)始轉(zhuǎn)動(dòng),動(dòng)物極轉(zhuǎn)向上方,植物極富含卵黃,因而轉(zhuǎn)到下方,轉(zhuǎn)動(dòng)緩慢的逐漸進(jìn)行,最終受精卵的動(dòng)物極向上,植物極向下(圖1-B)。受精后40 min,原生質(zhì)和卵膜吸水膨脹,細(xì)胞質(zhì)從植物極流向動(dòng)物極,使得動(dòng)物極逐漸變成扁圓弧,與卵膜間出現(xiàn)了間隙即卵周隙。同時(shí),動(dòng)物極明亮的極斑消失(圖1-C)。受精后2.5 h,色素堆積在動(dòng)物極,胚盤(pán)隆起不明顯,呈新月帶狀(圖1-D),此時(shí)卵徑為3.45～3.65mm。

2.2 卵裂

受精后3.5 h受精卵開(kāi)始第一次卵裂,在動(dòng)物極出現(xiàn)淺白色的狹窄分裂溝,分裂溝顏色逐漸加深,并沿著動(dòng)物極與胚盤(pán)垂直向兩側(cè)擴(kuò)展,直至擴(kuò)展到卵細(xì)胞的赤道,細(xì)胞開(kāi)始進(jìn)入第二次卵裂?？梢?jiàn)動(dòng)物極被分裂成兩個(gè)大小相等的細(xì)胞(圖1-E)。受精后4.5 h出現(xiàn)第二次卵裂,仍為經(jīng)裂,且垂直于第一次分裂溝(圖1-F)。俄羅斯學(xué)者金茲堡等[2]發(fā)現(xiàn),第二次卵裂溝約在從受精卵到第一次出現(xiàn)卵裂時(shí)間的1/3時(shí)間內(nèi)(本試驗(yàn)中第二次卵裂溝出現(xiàn)的時(shí)間距第一次卵裂溝出現(xiàn)相隔1 h)出現(xiàn)。然后,經(jīng)過(guò)幾乎同樣的時(shí)間間隔(發(fā)育溫度恒定的條件下),繼續(xù)進(jìn)行第三次、第四次和第五次卵裂。受精后5.5 h出現(xiàn)第三次卵裂,仍是經(jīng)裂,分裂為8個(gè)相差不大的細(xì)胞,分裂溝呈“Ж”形(圖1-G-1),此時(shí),第一次卵裂的分裂溝在植物極完全閉合(圖1-G-2)。觀察發(fā)現(xiàn),第三次卵裂的分裂溝位置因受精卵的形狀、大小不同而不同。例如,一般的圓形卵分裂溝通常經(jīng)過(guò)圓心沿著半徑輻射排列,大多數(shù)的長(zhǎng)形卵與第一次分裂溝平行或者成一個(gè)小拐角,分割出長(zhǎng)形或者圓形的細(xì)胞。受精后6.5 h出現(xiàn)第四次卵裂,卵裂是緯裂,分裂溝的位置為水平或輻射方向,在動(dòng)物極形成16個(gè)大小不等、形狀不規(guī)則的細(xì)胞(圖1-H)。此時(shí),第二次卵裂的分裂溝均延伸到了赤道下方,有一部分在植物極已經(jīng)閉合。受精后7.5 h出現(xiàn)第五次卵裂,胚胎被分成32個(gè)大小不等的細(xì)胞,隨著卵裂繼續(xù)進(jìn)行,植物極卵細(xì)胞的分裂程度加深。第二次分裂溝已在植物極閉合,植物極被分裂為4部分(圖1-I)。受精后8.5 h開(kāi)始第六次卵裂,卵裂的細(xì)胞呈細(xì)小不規(guī)則狀,在高倍鏡下觀察其排列疏散,植物極也分裂出較小的細(xì)胞,分裂溝嵌入植物極已將其完全分開(kāi),在動(dòng)物極中心出現(xiàn)較深的色素區(qū),隨著分裂的加劇,色素區(qū)面積逐漸擴(kuò)大(圖1-J)。同其他鱘科魚(yú)類一樣,鰉魚(yú)受精卵卵裂屬于完全卵裂[13]。受精后9.5 h為多裂期,動(dòng)物極繼續(xù)分裂成更小的細(xì)胞,植物極細(xì)胞分裂加速,但細(xì)胞體積仍大于動(dòng)物極細(xì)胞(圖1-K-1、K-2)。動(dòng)物極中心出現(xiàn)較深色素并逐漸向四周擴(kuò)展。

表1 達(dá)氏鰉胚胎發(fā)育各時(shí)期特征Tab.1 Characteristics of em bryonic development of Siberian huso sturgeonHuso dauricusat various periods

2.3 囊胚

受精后11.5 h,胚胎進(jìn)入囊胚早期。隨著卵裂不斷進(jìn)行,卵裂細(xì)胞越來(lái)越小,細(xì)胞間開(kāi)始有組織液積蓄,胚胎出現(xiàn)囊胚腔。此時(shí)動(dòng)物極中心色素越來(lái)越深。周圍環(huán)繞著較淺亮的色素帶,細(xì)胞越來(lái)越細(xì)小,細(xì)胞之間的界限開(kāi)始模糊。相比之下,植物極色素仍很深,細(xì)胞之間界限較明顯(圖1-L)。

受精后15 h,胚胎進(jìn)入囊胚中期。分裂腔逐漸擴(kuò)大。細(xì)胞繼續(xù)變小,且動(dòng)物極細(xì)胞核分裂不同步,使得整個(gè)受精卵的細(xì)胞之間有明顯的間隙,并表現(xiàn)出卵裂的不等性(圖1-M)。

受精后18 h,胚胎進(jìn)入囊胚晚期。動(dòng)物極色素淺亮,細(xì)胞細(xì)小模糊,已分不清界限,下延至赤道。植物極細(xì)胞進(jìn)一步減小。在較小的動(dòng)物極細(xì)胞和較大的植物極細(xì)胞之間,有一中等大小的細(xì)胞區(qū)域,稱為邊緣帶。動(dòng)物極處的囊胚隆起,向下擴(kuò)張,產(chǎn)生下包作用,并逐漸形成透亮的囊胚腔(圖1-N)。

2.4 原腸胚

受精后21 h,胚胎進(jìn)入原腸初期。外胚層細(xì)胞開(kāi)始向植物極外包,在胚胎未來(lái)的背面,靠近赤道水平處出現(xiàn)一條暗色條紋(圖1-O)。受精后23 h,胚胎進(jìn)入原腸早期。此時(shí)在暗色條紋的地方形成一個(gè)狹窄且較淺的縫隙,即胚孔,胚層從該處內(nèi)卷,待暗色條帶處的細(xì)胞卷入囊胚腔后,邊緣帶的細(xì)胞也開(kāi)始內(nèi)卷,形成胚孔的背唇,所有新形成的細(xì)胞也依次靠近胚孔,隨后從胚孔進(jìn)入胚胎內(nèi)部。胚孔裂隙也隨之向兩側(cè)慢慢擴(kuò)大。所有卷入內(nèi)部的細(xì)胞向上(動(dòng)物極)推進(jìn),以前處于囊胚外壁動(dòng)物極的細(xì)胞明顯向植物極下包。在體視顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),隨著胚孔裂隙的加長(zhǎng),明亮細(xì)胞和暗色細(xì)胞的界限向植物極移動(dòng)(圖1-P),此時(shí)的囊胚腔逐漸擴(kuò)大,腔壁變薄,植物極頂端細(xì)胞分裂細(xì)小。受精后29 h,胚胎進(jìn)入原腸中期。動(dòng)物極的細(xì)胞繼續(xù)內(nèi)卷、外包,在胚孔處形成側(cè)唇和腹唇。外胚層細(xì)胞通過(guò)胚孔繼續(xù)內(nèi)陷上移,隨著胚孔裂隙向兩側(cè)慢慢擴(kuò)大,逐漸形成一環(huán)形帶,閉合后形成胚環(huán),此時(shí)胚環(huán)下移至胚胎的2/3處(圖1-Q)。受精后33 h,胚胎發(fā)育至大卵黃栓期。動(dòng)物極細(xì)胞繼續(xù)向植物極擴(kuò)展,胚胎內(nèi)部分化出細(xì)窄的原腸腔;植物極細(xì)胞色素積累,兩極界限明顯。此時(shí)的胚環(huán)約覆蓋了胚胎的80％,相比之下,植物極暗色細(xì)胞好像一個(gè)栓,塞入了明亮的植物極,因此也稱為卵黃栓(圖1-R)。受精后38 h,胚胎發(fā)育至小卵黃栓期。卵黃栓的體積越來(lái)越小,除了植物極仍有一個(gè)很小的卵黃栓,胚胎大部分被動(dòng)物極明亮的細(xì)胞覆蓋。原腸腔基本形成(圖1-S),此時(shí)從植物極可以看到原腸腔。

2.5 神經(jīng)胚

受精后43 h,該階段為原腸胚形成末期。胚孔邊緣側(cè)唇彼此靠近,呈隙狀。卵黃栓逐漸消失,直到完全沒(méi)入胚胎內(nèi)部。此時(shí)原腸腔形成,胚胎在膜內(nèi)轉(zhuǎn)動(dòng),背面朝上,稱為隙狀胚孔期(圖1-T)。受精后46 h,胚胎背部、原腸胚頂部外胚層加厚形成板狀結(jié)構(gòu),起初板狀結(jié)構(gòu)扁平并不清晰,待輪廓清晰后可見(jiàn)神經(jīng)板前端寬大,前腦、間腦和中腦的原基均位于此。神經(jīng)板中部外緣輪廓增厚,形成神經(jīng)褶。神經(jīng)溝起始于隙狀胚孔,向前延伸,終止于神經(jīng)板最寬處,中腦原基位于此處(圖1-U)。受精后47 h,進(jìn)入寬神經(jīng)板期。該時(shí)期最明顯的特征是神經(jīng)板和神經(jīng)褶增厚,形似馬蹄狀,神經(jīng)板結(jié)構(gòu)上下伸長(zhǎng),形成內(nèi)外兩部分,神經(jīng)溝清晰(圖1-V)。受精后49 h,神經(jīng)溝逐漸深陷,神經(jīng)褶邊緣升高、增厚、逐漸靠攏(圖2-A)。受精后51 h,神經(jīng)板下陷,變窄,軀體部神經(jīng)管逐漸閉合。與此同時(shí),順著神經(jīng)板兩側(cè),不遠(yuǎn)處出現(xiàn)兩條淺色條紋,且逐漸加長(zhǎng),即胚胎排泄系統(tǒng)原基(圖2-B)。受精后52 h,胚胎進(jìn)入神經(jīng)管閉合期。此時(shí),軀體部和頭部左右的神經(jīng)褶閉合,形成神經(jīng)管(圖2-C)。胚胎的外胚層形成神經(jīng)管和體被上皮。頭部逐漸擴(kuò)大加長(zhǎng),形成前腦泡、中腦泡和后腦泡。腦的原基深陷在神經(jīng)管頭部,排泄系統(tǒng)原基顯著增長(zhǎng),在軀體上可見(jiàn)橫向平行排列的肌節(jié)?？汕逦^察到頭和尾的分化,整個(gè)胚胎體仍呈圓形。

圖1 達(dá)氏鰉養(yǎng)殖群體的胚胎發(fā)育(0.25～47 h)Fig.1 Embryonic development of cultured Siberian buso sturgeon inHuso dauricus(0.25-47 h)

2.6 器官形成

受精后54 h,胚胎發(fā)育至眼泡形成期。胚胎頭部繼續(xù)發(fā)育,腦容積變大。前腦泡形成兩個(gè)側(cè)突起即眼的原基,隨著黑色素的積累,發(fā)育成眼器官。孵化腺原基接近腦的正前方,呈半月形狀,在中腦泡的兩側(cè)可見(jiàn)上突呈弧形的淺色弧,這是頜弧原基,體節(jié)明顯(圖2-D)。

受精后60 h,整個(gè)胚胎稍有隆起,高出球面。腦前端半月形的孵化腺明亮可見(jiàn)。位于孵化腺下緣的垂體原基凹陷,第一對(duì)咽弧原基基本形成,第二對(duì)咽弧原基從中腦泡兩側(cè)發(fā)出。側(cè)板到達(dá)胚胎腹部的前端,并在頭部前方慢慢接近聯(lián)合。從該時(shí)期切片觀察,排泄系統(tǒng)原基位于神經(jīng)褶兩側(cè),前部上曲增厚,后部順勢(shì)延伸,在高倍鏡下可見(jiàn)腎小管原基向外側(cè)突起。胚體后端逐漸增大,形成扁平的尾原基。整個(gè)胚球逐漸變成橢圓形(圖2-E-1、E-2)。

受精后67 h,胚胎發(fā)育至尾芽分離期。胚體繼續(xù)向上隆起。側(cè)板在頭部從接近到完全聯(lián)合。在側(cè)板聯(lián)合的地方形成心臟的原基。沿著前腦泡兩側(cè)可見(jiàn)上皮中形成的一對(duì)凹陷——嗅窩(圖2-F-1)。同時(shí),在中腦泡兩側(cè)第三對(duì)新月形的弧開(kāi)始形成,即軟骨性腮弧原基。后腦泡內(nèi)擴(kuò)大為延腦室,沿著后腦泡兩側(cè)形成一對(duì)聽(tīng)泡,它們是體被上皮的一對(duì)囊狀突起。排泄原基從身體中部一直延伸到尾端,前端迅速分節(jié),形成腎管。收集管形成典型的彎曲,在心臟開(kāi)始跳動(dòng)之前,前面6條腎管一端開(kāi)口于體腔內(nèi),另一端開(kāi)口于總的收集管,向胚體后延伸成輸出管。中胚層繼續(xù)分節(jié),體節(jié)從軀干前部向后擴(kuò)展至尾部,新生的體節(jié)在早生的體節(jié)后面。尾芽突出,呈棒狀(圖2-F-2)。受精后73 h,位于頭部前下方的心臟開(kāi)始呈短管狀,頭部已開(kāi)始稍有抬起,第三對(duì)腮弧明顯形成(圖2-G-1)。尾芽變窄、變長(zhǎng),略與卵黃囊分離(圖2-G-2)。受精后78 h,心管變長(zhǎng)并略有彎曲。頭部明顯抬高,卵徑明顯增大。眼泡接近體被上皮的地方形成晶體原基。收集管的輸出管開(kāi)口于泄殖腔(圖2-H),泄殖腔是體被上皮的一個(gè)囊狀凹陷。在眼囊后方腦的第三膨大部分的兩側(cè)出現(xiàn)一對(duì)橢圓形聽(tīng)板。受精后87 h,頭部繼續(xù)隆起。心臟從略有彎曲的長(zhǎng)心管期過(guò)渡到“c”形,心臟搏動(dòng)微弱,為30～36次/min,尾部增大變彎曲,剝開(kāi)卵膠膜可看見(jiàn)約有3/5的尾部離開(kāi)卵黃囊,卵黃囊上開(kāi)始布有微血管網(wǎng)。胚胎可以在卵內(nèi)扭動(dòng)。眼的晶體明顯,眼泡內(nèi)可見(jiàn)少量的黑色素沉著,聽(tīng)板顏色加深(圖2-I)。受精后93 h,尾末端接近心臟,胚胎進(jìn)入肌肉效應(yīng)期。心跳為40～47次/min,頭尾均可在胚胎內(nèi)做小幅度的擺動(dòng)。嗅窩顏色加深,聽(tīng)板內(nèi)陷形成聽(tīng)泡,尾部繼續(xù)伸長(zhǎng),出現(xiàn)鰭?cǎi)?尾尖部分仍呈棒狀(圖2-J-1、J-2)。

圖2 達(dá)氏鰉養(yǎng)殖群體的胚胎發(fā)育(49～160 h)Fig.2 Embryonic development of cultured Siberian huso sturgeonHuso dauricus(49-160 h)

2.7 心跳

受精后101 h,尾的末端到達(dá)心臟,胚胎進(jìn)入心跳期,胚胎可做大幅度擺動(dòng)。孵化腺原基位于頭部下表面,心臟位于其下方,呈波浪狀并有節(jié)律搏動(dòng),逐漸從60次/min加快到100次/min。聽(tīng)泡增大,壁變薄。尾部繼續(xù)增長(zhǎng),鰭?cǎi)廾黠@變寬,尾的末端由棒狀變得扁平(圖2-K)。

2.8 出膜

受精后114 h,尾末端到達(dá)頭部。尾動(dòng)脈可見(jiàn)血液流動(dòng),卵黃囊背部和胚體之間有大量黑色素細(xì)胞顆粒出現(xiàn),脊柱下可見(jiàn)黑色的腎臟,并可見(jiàn)黑色攝食栓下的肛門(mén)原基。尾部鰭?cǎi)拮儗?覆蓋住心臟(圖2-L-1)。胚胎經(jīng)常在卵膜內(nèi)轉(zhuǎn)動(dòng)并彎向側(cè)面,通過(guò)轉(zhuǎn)動(dòng)身體,胚胎可以攪動(dòng)卵膜內(nèi)液體沖撞卵膜,有助于順利出膜。此時(shí)人工剝?nèi)ヂ涯?可觀察到胚胎全長(zhǎng)為9 mm,卵黃囊約占1/3體長(zhǎng)(圖2-L-2),因?yàn)槁腰S囊較為沉重,胚胎只能像指針一樣擺動(dòng),原地游泳,隨著時(shí)間延長(zhǎng),胚胎可以搖晃著前行,但還不能做真正意義上的游動(dòng)。受精后127 h,尾的末端略過(guò)頭部,已有部分仔魚(yú)的尾尖到達(dá)端腦,此時(shí)為出膜前期。胚胎和卵膜間隙明顯擴(kuò)大,魚(yú)體側(cè)盤(pán)在卵黃囊上。卵黃囊上血管明顯,心臟移到孵化腺正下方(圖2-M),心跳為90～110次/min。尾部鰭?cǎi)薷鼘?胚胎可在卵內(nèi)自由轉(zhuǎn)動(dòng),釋放出來(lái)的胚胎可在水中自由游動(dòng)。受精后136～160 h為仔魚(yú)出膜期。通常把多于30尾仔魚(yú)出膜看作出膜期的開(kāi)始。出膜前,達(dá)氏鰉胚胎尾部末端到達(dá)間腦或中腦,黑色素顆粒分散在卵黃囊腹部下側(cè)。大部分仔魚(yú)從頭部破膜而出,然后尾部不斷搖動(dòng),將胚體推出膜外。也有部分仔魚(yú)尾部先出膜,這樣的仔魚(yú)完全出膜不容易,它便帶著包裹著頭部的卵膜游泳,如果此時(shí)無(wú)法人工破膜,則這段時(shí)間需要保持水體的清潔,因?yàn)樘自谧恤~(yú)頭上的卵膜能吸附積聚在水中的大量雜塵,時(shí)間過(guò)久可影響仔魚(yú)在膜內(nèi)呼吸,使其窒息。從第一批仔魚(yú)出膜開(kāi)始,歷經(jīng)約24 h,仔魚(yú)全部出膜。剛孵出的仔魚(yú)全長(zhǎng)為10.0～11.2 mm(圖2-N)。

3 討論

3.1 達(dá)氏鰉胚胎發(fā)育特征及其比較

達(dá)氏鰉受精卵為沉性黏性卵,在第一次卵裂之前卵徑為3.5～3.8 mm。就現(xiàn)有的資料分析[11-14],該時(shí)期達(dá)氏鰉的受精卵卵徑僅比中華鱘Acipenser sinensis和匙吻鱘Polyodon spathula小,相對(duì)鱘科其他魚(yú)類則較大。達(dá)氏鰉卵膜外層的膠膜較厚,且具有很強(qiáng)的黏著性,推測(cè)這是因?yàn)檫_(dá)氏鰉野生種溯河洄游,通常將受精卵產(chǎn)于水流湍急的河道中,其受精卵外較厚的膠膜和黏性有助于受精卵在沙石上固定,有雜物沖擊時(shí)起到保護(hù)作用。

達(dá)氏鰉和鱘科其他魚(yú)類一樣,卵裂均為輻射狀卵裂,屬于完全卵裂,這與大部分冷水硬骨魚(yú)類[15-16]的盤(pán)狀卵裂不同。但是由于達(dá)氏鰉卵的大部分卵黃集中在植物極,植物極的細(xì)胞比動(dòng)物極大很多,所以分裂不均等。達(dá)氏鰉受精卵前三次卵裂均為經(jīng)裂,第四次則為緯裂,這種卵裂方式和中國(guó)大鯢Andrias davidianus早期卵裂過(guò)程極其相似[17],早在兩億三千萬(wàn)年前的三疊紀(jì),兩棲動(dòng)物繼魚(yú)類后出現(xiàn)在地球上,并占據(jù)了生物鏈的主要地位,而鱘鰉魚(yú)恰好也出現(xiàn)在這個(gè)時(shí)期,根據(jù)平行進(jìn)化理論[18],推測(cè)出達(dá)氏鰉卵裂方式和兩棲動(dòng)物十分相似,由此可知,達(dá)氏鰉卵裂的分裂方式介于兩棲類和魚(yú)類之間,屬于過(guò)渡態(tài)原始卵裂。

達(dá)氏鰉的受精卵以橢圓形甚至長(zhǎng)圓形居多,與圓形受精卵相比,其細(xì)胞質(zhì)和卵黃分布并不均勻,這也導(dǎo)致在卵裂過(guò)程中,每個(gè)受精卵分裂溝的位置并不完全一致,但是前兩次卵裂的分裂溝基本與卵長(zhǎng)軸垂直。有學(xué)者研究表明,即便在卵長(zhǎng)軸和短軸長(zhǎng)度相差10％的情況下,第一次卵裂的分裂溝仍垂直于卵長(zhǎng)軸[19]。本試驗(yàn)中觀察到的大部分受精卵都符合這種情況。然而第三次卵裂的分裂溝方向便有差異,本試驗(yàn)中觀察到,大部分長(zhǎng)圓形的受精卵在進(jìn)行第三次卵裂的時(shí)候,分裂溝距離第一次卵裂的分裂溝很遠(yuǎn),甚至與其相平行。本試驗(yàn)中還觀察到第三次卵裂的8個(gè)細(xì)胞體積相差不大,這與達(dá)氏鰉受精卵較大、卵黃和細(xì)胞質(zhì)較多且在動(dòng)物極分布較其他鱘魚(yú)豐富有關(guān)。本試驗(yàn)中,存在這種分裂狀態(tài)的受精卵均可以孵化出正常仔魚(yú)。通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn),在第五次卵裂時(shí),若第二次分裂溝尚未在植物極出現(xiàn),或卵裂分裂溝錯(cuò)亂,此類型受精卵往往不能發(fā)育到原腸胚期,即便能孵化出仔魚(yú),畸形胚胎比率也會(huì)較高,因此,在實(shí)際孵化時(shí)應(yīng)及時(shí)挑除該類型卵。

在原腸早期,達(dá)氏鰉的受精卵便形成胚孔,隨著動(dòng)物極的外胚層細(xì)胞卷入胚孔進(jìn)行內(nèi)陷上移,胚孔部位形成背唇、側(cè)唇和腹唇(圖2-O、P、Q),通常把胚環(huán)的形成作為受精卵進(jìn)入原腸中期的顯著特征之一[2]。達(dá)氏鰉胚胎在原腸中期時(shí),動(dòng)物極細(xì)胞約覆蓋胚胎的2/3,而處于同一時(shí)期的史氏鱘和中華鱘,其動(dòng)物極細(xì)胞覆蓋胚胎表面約3/4,要快于達(dá)氏鰉。從胚環(huán)的形成時(shí)期看,同為冷水魚(yú)種的秦嶺細(xì)鱗鮭Brachymystax lenok tsinlingensis在原腸早期形成胚環(huán)[15],哲羅魚(yú)Hucho taimen和細(xì)鱗魚(yú)Brachymystax lenok的雜交種則在囊胚晚期就已形成胚環(huán)[20]。胚環(huán)的形成意味著神經(jīng)胚階段即將到來(lái),在神經(jīng)胚期胚胎進(jìn)行組織器官分化。通過(guò)比較可知,達(dá)氏鰉的胚胎發(fā)育速度較其他冷水魚(yú)慢。

神經(jīng)胚階段是胚胎強(qiáng)烈進(jìn)行分化的過(guò)程。大多數(shù)淡水魚(yú)的胚胎在胚環(huán)下包胚胎的80％時(shí)便進(jìn)入神經(jīng)胚期[21-23],而達(dá)氏鰉只有當(dāng)胚環(huán)完全覆蓋胚胎(即原腸腔形成)后才會(huì)進(jìn)入神經(jīng)胚期,這樣大大減少了因原腸尚未健全或神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育不完善而產(chǎn)生的畸形胚胎,說(shuō)明了達(dá)氏鰉系統(tǒng)分化的完整性和完善性。

受精后87 h,達(dá)氏鰉眼泡內(nèi)便可見(jiàn)少量黑色素沉積,此時(shí)尾部末端未接近心臟;與此同時(shí),達(dá)氏鰉胚胎出現(xiàn)微弱心跳,此時(shí)發(fā)育的有效積溫達(dá)到1392℃·h,心臟呈“c”形。與之不同的是,小體鱘A.ruthenus的眼泡內(nèi)出現(xiàn)色素時(shí),其尾部末端已接近心臟[24],受精后68 h出現(xiàn)微弱的心跳;西伯利亞鱘A.cipenserbaerii眼囊出現(xiàn)色素時(shí),尾末端已越過(guò)心臟到達(dá)頭部[25];閃光鱘在長(zhǎng)心管期心臟就發(fā)生了微弱的搏動(dòng)[26];而歐洲鰉要等到心臟呈明顯的“S”形彎曲才產(chǎn)生搏動(dòng)。傑特拉弗等[19]指出,以上這些差別不會(huì)隨著溫度的變化提前或者延后,是物種先天特征和本身的屬性。

鱘科魚(yú)類產(chǎn)卵水溫為6～25℃,產(chǎn)卵季節(jié)幾乎覆蓋了一年四季[27]。閃光鱘和西伯利亞鱘相對(duì)達(dá)氏鰉體形要小得多,喜溫性,卵孵化需要較高的積溫,呼吸代謝強(qiáng)烈,因此,其心跳出現(xiàn)搏動(dòng)的時(shí)間較早;歐洲鰉與達(dá)氏鰉體形相似,甚至要比達(dá)氏鰉大,自然環(huán)境下產(chǎn)卵最適溫度為9～17℃[28],較達(dá)氏鰉最適孵化溫度(14～18℃)偏低,代謝相對(duì)緩慢,故達(dá)氏鰉和歐洲鰉出現(xiàn)心跳的時(shí)間較晚,并且心律開(kāi)始較慢?？傮w來(lái)看,經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的進(jìn)化,鱘科魚(yú)類胚胎發(fā)育階段保持著較高的相似性。

鱘科魚(yú)類出膜期最明顯的特征是尾末端到達(dá)的位置,甚至可以由此判斷出魚(yú)的種類。本試驗(yàn)中觀察到,達(dá)氏鰉仔魚(yú)出膜前,胚胎尾部末端已到達(dá)間腦或中腦,出膜后的體長(zhǎng)為10.0～11.2 mm。通過(guò)整理數(shù)據(jù)(表2)可見(jiàn):鱘科魚(yú)類在出膜期,胚胎尾部末端所到達(dá)位置與出膜仔魚(yú)體長(zhǎng)成正比。

表2 鱘科魚(yú)類出膜期仔魚(yú)尾末端到達(dá)位置和平均體長(zhǎng)的比較Tab.2 Com parison of position of caudal end and average body length of new ly hatched larvae in fishes in Acipenseridae

物種的發(fā)育受個(gè)體本身和生存環(huán)境的綜合影響,剛孵出的達(dá)氏鰉個(gè)體較大,開(kāi)口時(shí)間較晚,胚后發(fā)育時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng),這些差異從某種程度上反映出仔魚(yú)對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性及占據(jù)生態(tài)位的能力較強(qiáng),有成長(zhǎng)為較大個(gè)體的潛力。

3.2 鱘科魚(yú)類胚胎發(fā)育時(shí)間、積溫與分期的比較

鱘科魚(yú)類胚胎發(fā)育時(shí)間與積溫的比較列于表3。從表3可知,鱘科魚(yú)類中達(dá)氏鰉胚胎發(fā)育時(shí)間最長(zhǎng),積溫較高。在魚(yú)類的胚胎發(fā)育過(guò)程中,適宜的水溫是主要的生態(tài)條件之一。溫度升高可使胚胎的代謝加快,呼吸作用增強(qiáng),發(fā)育速度提高,但過(guò)高的溫度也會(huì)導(dǎo)致水中溶氧降低,引起胚胎死亡。鱘魚(yú)正常孵化水溫一般為14～25℃。在不同學(xué)者對(duì)鱘科不同魚(yú)類的胚胎發(fā)育研究中發(fā)現(xiàn),隨孵化溫度的升高,胚胎正常孵化率逐漸增高,最適溫度下胚胎孵化率最高。

表3 鱘科魚(yú)類胚胎發(fā)育情況的比較Tab.3 Comparison of embryo development in fishes in Acipenseridae

對(duì)達(dá)氏鰉胚胎發(fā)育進(jìn)行研究可知:在平均水溫為15.9℃的流水中,正常孵化率為74.3％,而在平均水溫為19.2℃的靜水中,正常孵出率高達(dá)85.8％,出膜時(shí)間要比流水中早約24 h,且仔魚(yú)體質(zhì)更加健康;在水溫為10～12℃時(shí),胚胎發(fā)育到原腸胚中期前就已停止,升高水溫后只有少部分能發(fā)育至器官形成期,繼續(xù)發(fā)育下去的胚胎心跳期會(huì)延遲,仔魚(yú)不健康,幾乎無(wú)仔魚(yú)能正常破膜而出;當(dāng)水溫超過(guò)25℃時(shí),所有胚胎均無(wú)法形成胚孔,在小卵黃栓期全部死亡。推斷溫度的改變使胚胎孵化酶受到抑制,進(jìn)而破壞了整個(gè)發(fā)育機(jī)制。

達(dá)氏鰉胚胎發(fā)育過(guò)程中所需積溫略高于鱘科其他魚(yú)類,故在養(yǎng)殖模式下可適當(dāng)提升孵化水溫,縮短孵化時(shí)間,短期內(nèi)達(dá)到孵化總積溫。

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Embryonic development of cultured Siberian huso sturgeonHuso dauricus

GUO Chang-jiang1,ZHAOWen1,SHIZhen-guang2,3,WEIJie1,LU Hong-shen2,3,LIU Jian-kui2,3
(1.Key Laboratory of Hydrobiology in Liaoning Province,College of Fisheries and Life Science,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China; 2.Yunnan Amur Sturgeon Group Limited Company,Kunming 650228,China;3.Beijing Sturgeon Dragon Seed Industry Group Limited Company, Beijing 101400,China)

The embryonic developmentwas observed in cultured population of Siberian huso sturgeonHuso dauricus,which was induced to spawn by hormone injection,atwater temperature of(16.0±0.2)℃to understand the embryonic development procedure of Siberian huso sturgeon.Itwas found that Siberian huso sturgeon had spherical mature eggs in shape,and yellowish-brown or taupe in color and was non-transparent dermal-adhesive,with mean egg diameter of3.19 mm.The fertilized eggs showed special radial cell division in cleavage stage,with average effective cumulative temperature of 2148-2592℃·h and hatched in 136 hours.Animal pole cells occupied two thirds of the whole embryos in volume in mid-gastrula stage,with“c”-shaped heart in heart beating stage. Most of the freshly hatched fry had caudal end extending to the diencephalon.The embryonic development of Siberian huso sturgeon was divided into 8 continuous stages including fertilized egg,cell division,blastula,gastrula, neurula,organogenesis,heartbeating and hatching stage,amounting to 36 substages based on themorphology.The findings indicated that there was slightly higher cumulative temperature in Siberian huso sturgeon than that in other sturgeons during embryonic development.

Huso dauricus;embryonic development;development stage;morphological characteristics

Q132;S917

A

10.16535/j.cnki.dlhyxb.2016.06.001

2095-1388(2016)06-0589-09

2016-03-20

遼寧省海洋與漁業(yè)廳科研項(xiàng)目(200920);橫向聯(lián)合項(xiàng)目“達(dá)氏鰉基礎(chǔ)生物學(xué)研究”(2012-2014)

郭長(zhǎng)江(1989—),男,科研助理。E-mail:407055886@qq.com

趙文(1963—),男,教授,博士生導(dǎo)師。E-mail:zhaowen@dlou.edu.cn