趙志剛,李晉南,徐奇友,羅 亮,王常安,王連生,都 雪,王 海

(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所,黑龍江哈爾濱150070)

不同馴化溫度對施氏鱘幼魚肝臟線粒體代謝的影響

趙志剛,李晉南,徐奇友,羅 亮,王常安,王連生,都 雪,王 海

(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所,黑龍江哈爾濱150070)

為研究不同馴化溫度對體質(zhì)量為(6.26±0.21)g的施氏鱘Acipenser schrenckiiBrandt幼魚肝臟線粒體代謝的影響,將試驗分為8個溫度馴化組,分別設(shè)16、19、22、25℃4個恒溫組,以及(16±2)、(19± 2)、(22±2)、(25±2)℃4個變溫組,馴化6周后取樣,分別測定各馴化組施氏鱘幼魚肝臟組織線粒體的蛋白含量、呼吸率和細胞色素C氧化酶(CCO)活性。結(jié)果表明:施氏鱘肝臟組織線粒體蛋白含量在各馴化組間均無顯著性差異(P＞0.05);魚體肝臟組織線粒體狀態(tài)3呼吸率和狀態(tài)4呼吸率均隨著馴化溫度的升高顯著增加(P＜0.05),在16℃和19℃馴化組中,恒溫處理和變溫處理間均無顯著差異(P＞0.05),而在22℃和25℃馴化組中,變溫馴化組的線粒體狀態(tài)3呼吸率和狀態(tài)4呼吸率均顯著高于恒溫馴化組(P＜0.05);魚體肝臟組織線粒體的呼吸控制率(RCR)隨馴化溫度的升高呈顯著降低的趨勢(P＜0.05),在各溫度馴化組中,線粒體的RCR在恒溫和變溫處理間均無顯著性差異(P＞0.05);魚體肝臟組織線粒體CCO活性隨著馴化溫度的升高顯著增加(P＜0.05),但酶活性在恒溫和變溫處理間均無顯著性差異(P＞0.05)。研究表明,20～27℃的變溫馴化能夠顯著誘導(dǎo)施氏鱘線粒體呼吸率升高。

施氏鱘;恒溫;變溫;線粒體;代謝

線粒體是動物機體細胞內(nèi)利用氧并產(chǎn)生能量(ATP)的主要場所[1-2]。研究表明,動物機體組織線粒體中的電子傳遞鏈及氧化磷酸化過程的代謝模式是高度保守的,對于環(huán)境變化的任何適應(yīng)性反應(yīng)都應(yīng)當是對其量值的調(diào)節(jié),而不是對其代謝途徑或模式的更新[3-4]。當環(huán)境溫度條件發(fā)生改變時,線粒體生產(chǎn)ATP的速率將隨之調(diào)控,以保持動物機體生理功能的相對穩(wěn)定[4]。因此,線粒體代謝途徑隨環(huán)境因子變化的調(diào)節(jié)能力就決定了該物種在環(huán)境變化中的適應(yīng)性[5]。魚類作為變溫動物,由于缺乏穩(wěn)定體溫的調(diào)節(jié)機制,其機體線粒體功能對環(huán)境溫度的變化會更為敏感[6]。

施氏鱘Acipenser schrenckiiBrandt是中國重要的大型名貴經(jīng)濟魚類,用其卵制成的魚子醬有“黑色黃金”之稱,具有極高的經(jīng)濟價值[7-8]。施氏鱘自然分布于黑龍江水系,生存水溫為1～30℃,人工養(yǎng)殖條件下,在17～26℃范圍內(nèi)均能正常攝食和生長[9]。自然界中施氏鱘生存的水溫是周期性變化的,如晝夜變化、季節(jié)變化等。目前,關(guān)于不同溫度條件下鱘科魚類組織線粒體代謝方面的研究尚未見報道。本試驗中,在不同恒溫和變溫馴化條件下,研究了施氏鱘幼魚肝臟線粒體代謝的變化情況,旨在為探索施氏鱘的代謝調(diào)節(jié)機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用施氏鱘幼魚取自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院鱘魚繁育中心,體質(zhì)量為(6.26±0.21)g,將幼魚運回后在室內(nèi)循環(huán)水族箱內(nèi)暫養(yǎng)2周。暫養(yǎng)用水為曝氣自來水,期間飽食投喂鱘魚商品魚苗種配合飼料,每天換水1/3,水溫控制在(20±1)℃。

線粒體提取試劑盒購自南京建成生物有限公司。線粒體蛋白含量測定試劑盒(BCA蛋白定量試劑盒)購自北京艾德萊生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 溫度設(shè)計 試驗設(shè)16、19、22、25℃4個恒溫組,以及(16±2)、(19±2)、(22±2)、(25± 2)℃4個變溫組,共8個溫度組。變溫組的溫度通過可編程智能溫度控制儀進行控制,即在06:00從最低溫開始逐漸升溫,到13:00上升到最高溫度,13:00～18:00保持在最高溫度;從18:00后開始逐漸降溫,到次日01:00逐漸降到最低溫度,從01:00～06:00保持最低溫度,以24 h為單位進行循環(huán)。

1.2.2 溫度馴化 暫養(yǎng)結(jié)束后,選擇規(guī)格整齊且健康的試驗魚轉(zhuǎn)移至不同處理組循環(huán)水玻璃缸中進行溫度馴化,放養(yǎng)密度為每缸20尾。每天以1℃的變化速率升溫或降溫,達到馴化溫度后,在各溫度條件下馴化6周。馴化用水為曝氣自來水。馴化期間每天換水1/3以上,每天于08:30、13:00和17:00飽食投喂鱘商品魚苗種配合飼料,定期清除殘餌和糞便。整個馴化期間,各處理組溶解氧均保持在5.5 mg/L以上,光照周期為12 L∶12 D。馴化結(jié)束后,試驗魚停食48 h,以保證各處理組魚體完全處于空腹狀態(tài)。然后從每個處理組隨機取6尾魚,用MS-222麻醉劑麻醉后,在冰盤上迅速解剖,摘取完整肝臟,在液氮中速凍后放入超低溫冰箱(-80℃)中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 組織線粒體的制備 準確稱取100～200 mg凍存的肝臟樣品,用生理鹽水沖洗干凈,濾紙吸干。剪碎后將組織放入一個置于冰上的離心管中,加入1.5 mL預(yù)冷的裂解液,冰浴過程中用間隙嚴密的研杵研磨組織20次(相差顯微鏡下檢查未裂解細胞應(yīng)在50％左右即可)。將勻漿液轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的離心管中,在800g條件下離心5 min。另取一個新的預(yù)冷離心管,在其中預(yù)先加入0.5 mL溶液A,將離心后的上清液0.5 mL沿管壁加入含有溶液A的離心管中,覆蓋于溶液A的上層,再在15 000g條件下離心10 min,離心后的沉淀則為線粒體。在沉淀中加入0.2 mL漂洗液重新懸浮線粒體沉淀,在15 000g條件下離心10min,棄上清液。用50～100μL儲存液或合適的緩沖液重懸線粒體沉淀,立即使用或在-70℃下保存。以上操作均在(0～4)℃條件下進行。

1.2.4 組織線粒體呼吸率及細胞色素C氧化酶活性的測定 通過液相氧電極(Hansatech公司)分別在16、19、22、25℃下測定對應(yīng)溫度下各處理組樣品肝臟組織線粒體呼吸率及細胞色素C氧化酶(CCO)的活性,每個處理組的樣本量為6。具體測定方法見文獻[5]。

每個線粒體樣品均重復(fù)測定2～3次,線粒體呼吸率及CCO活性均采用單位線粒體蛋白含量的耗氧率表示。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗結(jié)果均用平均值±標準差(mean±S.D.)表示。試驗數(shù)據(jù)用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析,分別對各處理組的試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差(One-Way ANOVA)分析和Duncan’s多重比較,顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 線粒體蛋白含量

從圖1可見,魚體肝臟組織的線粒體蛋白含量為7.80～10.22 mg/g,且各溫度處理組間均無顯著性差異(P＞0.05)。

圖1 不同溫度馴化組施氏鱘幼魚肝臟組織線粒體蛋白含量Fig.1 M itochondrial protein contents in liver of juvenile Amur sturgeonAcipenser schrenckiiacclimatized at different tem perature

2.2 線粒體呼吸率

從圖2、圖3可見:魚體肝臟組織線粒體狀態(tài)3呼吸率和狀態(tài)4呼吸率表現(xiàn)出相同的變化趨勢,兩者的呼吸率均隨馴化溫度的不斷升高顯著增加(P＜0.05);在16℃和19℃馴化組中,恒溫或變溫處理間均無顯著性差異(P＞0.05),而在22℃和25℃馴化組中,變溫馴化組的線粒體狀態(tài)3呼吸率和狀態(tài)4呼吸率均顯著高于恒溫馴化組(P＜0.05)。

從圖4可見:魚體肝臟組織線粒體的呼吸控制率(RCR)隨馴化溫度的升高呈顯著降低的趨勢(P＜0.05);各溫度馴化組中,恒溫和變溫處理組間無顯著性差異(P＞0.05);恒溫或變溫處理條件下,22、25℃馴化組間CRC無顯著性差異(P＞0.05),但均顯著低于16、19℃組(P＜0.05)。

注:標有不同小寫字母者表示組間有顯著性差異(P＜0.05),標有相同小寫字母者表示組間無顯著性差異(P＞0.05),下同Note:The means with different letters are significant differences at the 0.05 probability level,and the means with the same letters are not significant differences,et sequentia圖2 不同溫度馴化組施氏鱘肝臟組織線粒體狀態(tài)3呼吸率Fig.2 M itochondrial state3 respiration rates in liver of juvenile Amur sturgeonAcipenser schrenckiiacclimatized at different temperature

圖3 不同溫度馴化組施氏鱘肝臟組織線粒體狀態(tài)4呼吸率Fig.3 M itochondrial state4 respiration rates in liver of juvenile Amur sturgeonAcipenser schrenckiiacclimatized at different temperature

圖4 不同溫度馴化組施氏鱘肝臟組織線粒體的呼吸控制率Fig.4 RCR values ofm itochondrial respiration in liver of juvenile Amur sturgeonAcipenser schrenckiiacclimatized at different temperature

2.3 線粒體細胞色素C氧化酶活性

從圖5可見:魚體肝臟組織線粒體細胞色素C氧化酶活性隨馴化溫度的升高顯著增加(P＜0.05);各溫度馴化組中,酶活性在恒溫和變溫處理間均無顯著性差異(P＞0.05)。

圖5 不同溫度馴化組施氏鱘肝臟組織線粒體CCO活性Fig.5 M itochondrial cytochrome C oxidase activity in liver of juvenile Amur sturgeonAcipenser schrenckiiacclimatized at different tem perature

3 討論

3.1 溫度對線粒體蛋白含量及呼吸率的影響

通常用線粒體蛋白含量來表征組織細胞的線粒體含量[10-11]。研究表明,一些魚類經(jīng)過溫度馴化后其組織線粒體的數(shù)量會發(fā)生改變,如經(jīng)過低溫馴化的歐洲鯽Carassius auratus和條紋狼鱸Morone saxatilis,其肌肉線粒體的數(shù)量會明顯升高[12-13],而對南方鲇SilurusmeridionalisChen的研究發(fā)現(xiàn),其肝臟、腎臟和心臟組織中線粒體數(shù)量在不同溫度馴化組間并無明顯差異[5]。本研究結(jié)果顯示,施氏鱘幼魚肝臟組織的線粒體蛋白含量在不同的恒溫組和變溫組間均無顯著性差異(圖1),表明不同的溫度馴化對施氏鱘肝臟組織線粒體數(shù)量的增殖不產(chǎn)生誘導(dǎo)作用,同時也進一步表明,溫度馴化誘導(dǎo)魚體組織線粒體數(shù)量在不同魚類中可能存在種間差異。

Estabrook[14]根據(jù)線粒體呼吸控制率和磷氧比,將動物機體細胞線粒體呼吸率的測定過程分為4個狀態(tài),其中,狀態(tài)3的呼吸率通常代表線粒體的最高代謝水平,而狀態(tài)4的呼吸率則能夠反映組織線粒體內(nèi)膜通透性的大小。狀態(tài)3與狀態(tài)4呼吸率的比值通常被定義為線粒體的呼吸控制率(RCR),該指標可評價線粒體功能狀態(tài)及氧化磷酸化的偶聯(lián)程度[6,15-16]。線粒體的能量代謝過程本質(zhì)上是一系列復(fù)雜酶促反應(yīng)的結(jié)果,一定程度的升溫可促進酶促反應(yīng)速率,進而增加其呼吸率。隨著馴化溫度的升高,施氏鱘魚體肝臟組織線粒體狀態(tài)3和狀態(tài)4呼吸率均顯著增加(圖2和圖3)。一些研究發(fā)現(xiàn),南極魚Notothenia neglecta、南方鲇等魚體組織線粒體狀態(tài)3和狀態(tài)4呼吸率在一定溫度范圍內(nèi)也與本試驗表現(xiàn)出相同的變化趨勢[17-18]。本試驗結(jié)果顯示,在16℃和19℃馴化組中,恒溫和變溫處理間均無顯著性差異,而在22℃和25℃馴化組中,變溫馴化組的線粒體狀態(tài)3和狀態(tài)4呼吸率均顯著高于恒溫馴化組(圖2和圖3),表明與恒溫馴化相比,較低溫度下的變溫馴化(14～21℃)不足以誘導(dǎo)施氏鱘魚體肝臟線粒體呼吸率發(fā)生變化,而較高溫度下的變溫馴化(20～27℃)則能夠顯著誘導(dǎo)其線粒體呼吸率升高。該結(jié)果也進一步表明,施氏鱘肝臟線粒體對較高溫度下的變溫(20～27℃)更為敏感。魚類體溫的變化取決于周圍水環(huán)境溫度的變化,水溫的變化可直接影響魚體內(nèi)的各種生理功能[19]。有學(xué)者認為,溫度變化能夠改變機體組織線粒體中一些生物活性分子的敏感度[6]。線粒體在發(fā)揮功能過程中,ADP作為反應(yīng)底物對氧化磷酸化過程有重要的調(diào)節(jié)作用[20],其對溫度的變化極為敏感,對虹鱒肌肉線粒體的研究也證明了這一點[21]。

3.2 溫度對線粒體呼吸控制率及細胞色素C氧酶活性的影響

本試驗結(jié)果顯示,在各溫度馴化組中,施氏鱘肝臟組織線粒體的RCR值在恒溫和變溫處理間均無顯著性差異(圖4),表明與恒溫相比,變溫馴化對施氏鱘魚體肝臟線粒體功能中的氧化磷酸化的偶聯(lián)程度不產(chǎn)生顯著影響。CCO是線粒體中的關(guān)鍵代謝酶[6]。本試驗中,施氏鱘肝臟組織線粒體CCO活性隨著馴化溫度的升高顯著增加,但在各溫度馴化組中,酶活性在恒溫處理和變溫處理間均無顯著性差異(圖5)。該結(jié)果表明,在本試驗溫度范圍內(nèi),變溫馴化不能誘導(dǎo)施氏鱘肝臟組織線粒體CCO活性發(fā)生變化。一些廣溫性魚類經(jīng)過適當?shù)牡蜏伛Z化后會提高某些關(guān)鍵代謝酶的活性,通過這種方式增強其代謝能力來適應(yīng)低溫環(huán)境[22-23]。也有研究發(fā)現(xiàn),溫度馴化并不能引起線粒體關(guān)鍵代謝酶活性的改變[24-25]。對南方鲇的研究表明,其心臟、腎臟和肝臟組織線粒體的CCO活性在溫度馴化過程中變化顯著,而腦和白肌中的差異并不顯著[18]。因此,不同溫度條件馴化對魚體組織線粒體關(guān)鍵代謝酶的活性變化影響,不僅存在種間差異,而且還可能存在組織差異。

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Effects of different acclimation tem perature on m itochondrial metabolism in liver of juvenile Amur sturgeonAcipenser schrenckiiBrandt

ZHAO Zhi-gang,LIJin-nan,XU Qi-you,LUO Liang,WANG Chang-an, WANG Lian-sheng,DU Xue,WANG Hai
(Heilongjiang River Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Harbin 150070,China)

The aim of this study is to investigate the effects of different acclimation temperature on mitochondrial metabolism in liver of juvenile Amur sturgeonAcipenser schrenckiiBrandtwith body weight of(6.26±0.21)g.The mitochondrial protein contents,mitochondrial respiration rates and mitochondrial cytochrome C oxidase activity (CCO)weremeasured in liver of the fish acclimated at constant temperature of16,19,22 and 25℃and four variable temperature(16±2),(19±2),(22±2)and(25±2)℃for 6 weeks.The results showed that there were no significant differences in mitochondrial protein contents in the fish between acclimation groups(P＞0.05).However,themitochondrial state 3 and state 4 respiration rateswere found to be increased significantly with increases in acclimation temperature(P＜0.05),without significant differences in acclimation groups of 16℃and 19℃(P＞0.05),even though therewere significanthighermitochondrial respiration rates in variable temperature groups than those in constant temperature groups in acclimation groups of22℃and 25℃(P＜0.05).The RCR values ofmitochondrial respiration in liver were declined significantly with increases in acclimation temperature(P＜0.05), without significant differences between constant temperature groups and variable temperature groups in all acclimation temperature(P＞0.05).With increases in acclimation temperature,themitochondrial CCO activitieswere increased significantly(P＜0.05),without significant differences between constant temperature groups and variable temperature groups(P＞0.05).The findings indicate that variable temperature acclimation from 20℃to 27℃can lead to significantly induce increases in mitochondrial respiration rates in liver of juvenile Amur sturgeon.

Acipenser schrenckiiBrandt;constant temperature;variable temperature;mitochondrion;metabolism

S917.4

A

10.16535/j.cnki.dlhyxb.2016.06.004

2095-1388(2016)06-0607-05

2016-06-22

國家自然科學(xué)基金資助項目(31302204);黑龍江省自然科學(xué)基金資助項目(QC2015041)

趙志剛(1982—),男,博士,助理研究員。E-mail:zhaozhigang@hrfri.ac.cn