王亞楠,王曉斐,牛琳琳,雷 壯,張海棠,王自良,*

(1.河南科技學院動物科技學院,河南新鄉(xiāng) 453003;2.動物病毒病防控與藥殘分析河南省高校重點學科開放實驗室,河南新鄉(xiāng) 453003;3.河南科技學院新科學院,河南新鄉(xiāng) 453003)

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黃曲霉毒素B1半抗原分子設(shè)計與抗原合成及抗體特性研究進展

王亞楠1,2,王曉斐3,牛琳琳1,2,雷 壯1,2,張海棠1,2,王自良1,2,*

(1.河南科技學院動物科技學院,河南新鄉(xiāng) 453003;2.動物病毒病防控與藥殘分析河南省高校重點學科開放實驗室,河南新鄉(xiāng) 453003;3.河南科技學院新科學院,河南新鄉(xiāng) 453003)

本文綜述了國內(nèi)外半抗原分子設(shè)計方法、基本要求、應(yīng)遵循原則、抗原合成方法等方面的研究進展,尤其是對黃曲霉毒素B1(AFB1)半抗原分子設(shè)計與抗原合成及抗體特性進行了詳盡闡述,旨在為AFB1制備AFB1及其他小分子半抗原高質(zhì)量的抗體提供新的方法和思路。

黃曲霉毒素B1,半抗原分子設(shè)計,抗原合成,抗體特性

黃曲霉毒素(aflatoxins,AF)是由黃曲霉(Aspergillusflavu)和寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)經(jīng)過聚酮途徑所產(chǎn)生的含有二呋喃環(huán)和氧雜萘鄰酮結(jié)構(gòu)相似的一組有毒次生代謝產(chǎn)物,主要污染玉米、大米等糧食作物和花生、棉籽、堅果等油料作物及其制品[1]。目前已發(fā)現(xiàn)AF有20種,自然條件下產(chǎn)生的AF主要包括B1、B2、G1、G24種[2]。AF對人體健康具有致癌性、致突變性、致畸形性和致免疫抑制性等毒性作用,尤其是AFB1毒性最強,是氰化鉀的10倍,砒霜的68倍,被國際癌癥研究組織(IARC)確定為I類致癌物[3]。由于AFB1毒性較大,污染廣泛,在AF總量中所占比例較高(50%以上),世界上大多數(shù)國家對食品中AFB1殘留限量標準都做出了明確的規(guī)定[4],我國現(xiàn)行的《GB 2761-2011 食品中真菌毒素限量》標準嚴格規(guī)定了AFB1的限量標準[5]。

食品中AFB1分析方法主要有理化分析和免疫分析兩種,目前各國主要采用理化分析方法,包括高效薄層色譜法(HPTLC)[6]、高效液相色譜法(HPLC)[7]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC/MS-MS)[8]、熒光分光光度法(FS)[9]、微柱篩選法(MCS)[10]、傅立葉變換紅外光譜(FTIR)[11]等。但由于受儀器設(shè)備、技術(shù)人員、樣品處理、操作場地、經(jīng)濟成本等方面的制約,理化分析方法的應(yīng)用受到了限制[12]。免疫分析方法由于具有選擇性強、靈敏度高、快速簡便、樣品篩檢量大、可現(xiàn)場操作等優(yōu)勢,已成為AFB1檢測研究的熱點課題[13]。由于AFB1是小分子化合物,不具有免疫原性,無法直接誘導機體等產(chǎn)生特異性抗體,只有通過半抗原分子結(jié)構(gòu)改造,再與大分子蛋白質(zhì)載體結(jié)合合成抗原,通過T細胞表位誘導激活B細胞,由B細胞成熟為漿細胞分泌產(chǎn)生特異性抗體,而高靈敏度、高特異性抗體的產(chǎn)生依賴于半抗原分子設(shè)計和抗原合成[14]。本文對AFB1半抗原分子設(shè)計與抗原合成及抗體特性研究進展進行了綜述,旨在為食品AFB1污染殘留更加靈敏、特異的免疫學檢測方法建立提供參考。

1 半抗原分子設(shè)計方法、基本要求與遵循原則

半抗原免疫分析(hapten immunoassay,HIA)是以抗原與對應(yīng)抗體的特異性識別和可逆性結(jié)合反應(yīng)為基本原理的分析方法,迄今已在農(nóng)藥[15]、獸藥[16]、生物毒素[17]、重金屬離子[18]、特殊化合物[19]等食品污染殘留檢測方面發(fā)揮了重要作用。HIA的研究內(nèi)容主要包括半抗原分子設(shè)計和抗原合成、靈敏性和特異性抗體制備與鑒定、免疫分析方法建立與驗證三部分,其中半抗原分子設(shè)計和抗原合成是基礎(chǔ),靈敏性和特異性抗體制備是核心,免疫分析方法建立是目的[20]。

1.1 半抗原分子設(shè)計方法

半抗原分子設(shè)計方法的研究內(nèi)容包括半抗原分子結(jié)構(gòu)與潛在免疫特性分析、活性位點的選擇、活性基團的引入、連接臂的選擇等。

半抗原分子結(jié)構(gòu)與潛在免疫特性分析。半抗原潛在免疫特性的高低與半抗原分子結(jié)構(gòu)的復雜性呈正相關(guān),其復雜性是指半抗原分子結(jié)構(gòu)中是否含有苯環(huán)及數(shù)目、雜環(huán)及數(shù)目、分支結(jié)構(gòu)及數(shù)目,通常結(jié)構(gòu)較復雜的半抗原易于誘導動物產(chǎn)生抗體,而結(jié)構(gòu)過于簡單的半抗原較難誘導動物產(chǎn)生抗體[21-22]。Szurdoki等[23]研究表明,半抗原分子結(jié)構(gòu)中具有苯環(huán)則制備抗體的成功率為1/3,而不含苯環(huán)的成功率僅為1/11。因此,對半抗原分子結(jié)構(gòu)(如分子大小、構(gòu)型、極性、電子云密度、特征結(jié)構(gòu)等)與潛在免疫特性(如活性位點、活性基團、前體物及代謝物、異構(gòu)體等)分析非常重要,目前主要通過網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫和各種文獻進行信息收集與分析,HaptenDB[24]數(shù)據(jù)庫有1087種半抗原、25種載體蛋白及2021種條目供選擇,查閱網(wǎng)站為http://www.imtech.res.in/raghava/haptendb/及http://bioinformatics.uams.edu/raghava/haptendb/(Mirror site);http://cdb.ics.uci.edu網(wǎng)站[25]可查閱4.1×106種商品化的化合物及8.2×106種同分異構(gòu)體;http://bioinformatics.charite.de/superhapten網(wǎng)站[26]可查閱7500種半抗原及其25000種類似物。

活性位點的選擇。一般情況下,小分子半抗原中含有多個可供選擇的活性位點,正確選擇活性位點對合成高質(zhì)量的小分子半抗原至關(guān)重要,直接影響著產(chǎn)生抗體的效價、親和性和特異性[27]。因為不同的活性位點會導致分子中電子分布的改變,從而使小分子半抗原的電化學性質(zhì)改變,進而改變其免疫活性,影響產(chǎn)生抗體的效價和親和性[28];由于不同的活性位點會導致分子的空間結(jié)構(gòu)不同,從而暴露的抗原決定簇也不同,進而影響產(chǎn)生抗體的特異性[29];再者,選擇活性位點時,應(yīng)遠離半抗原的特征結(jié)構(gòu)部分,使半抗原的特征分子結(jié)構(gòu)部分充分暴露而得以充分識別,避免破壞特征結(jié)構(gòu)部分或載體蛋白對特征結(jié)構(gòu)部分產(chǎn)生屏蔽作用,所制備的抗體不能識別半抗原。因此,對于具有多個活性位點的小分子半抗原,可嘗試利用多個位點分別合成多種人工抗原,然后通過比較篩選出最好的人工抗原用于抗體制備。

活性基團的引入。活性基團的引入主要包括五個路徑,一是利用半抗原自身分子結(jié)構(gòu)中含有可供偶聯(lián)利用的活性功能基團,如氨基(-NH2)、羧基(-COOH)、羥基(-OH)、羰基(-CO-)、巰基(-SH)等,不同的功能基團可選擇不同的偶聯(lián)方法,與載體蛋白偶聯(lián)制備抗原;二是利用半抗原分子結(jié)構(gòu)上已有的非活性基團,通過改造產(chǎn)生相應(yīng)的活性功能基團,如硝基(-NO2)還原引入-NH2、醛基(-CHO)肟化引入-COOH等,王自良等[30]在設(shè)計苯巴比妥(Phenobarbital,PB)半抗原時,將PB分子上的對位-NO2還原為對位-NH2,之后通過重氮化反應(yīng)將PB與載體蛋白偶聯(lián)合成抗原,制備出了高效價、敏感、特異的抗體;三是根據(jù)小分子化合物結(jié)構(gòu)上存在的活性位點,通過化學反應(yīng)引入活性功能基團;四是選擇小分子化合物的前體物或代謝物作為半抗原,Liu等[31]在選擇呋喃唑酮(Furazolidone)半抗原時,使用其代謝產(chǎn)物3-氨基-2-惡唑烷酮(3-amino-2-oxazolidone,AOZ)作為半抗原;五是重新合成半抗原,Sun等[32]在制備克百威(Carbofuran)抗體時,以呋喃酚為起始原料,經(jīng)光氣酰氯化,再與4-氨基丁酸反應(yīng),制備了帶有羧基的半抗原。

連接臂的選擇。半抗原分子設(shè)計時,常在特征結(jié)構(gòu)和載體蛋白之間引入一定長度的連接分子即連接臂,連接臂的選擇包括連接臂的長度與結(jié)構(gòu)的確定。關(guān)于連接臂長度的確定,Tuomola等[33]和Jung等[34]研究提出,連接臂的最適長度為3～6個碳原子,連接臂太短不利于半抗原的充分暴露,而連接臂太長又會因疏水作用而造成烷基鏈的折疊,導致半抗原分子被載體蛋白所掩蓋,不利于抗原遞呈細胞(antigen-presenting cell,APC)對其的識別,但這一結(jié)論有待進一步證實[35]。關(guān)于連接臂結(jié)構(gòu)的確定,Bruun等[36]和Kolosova等[37]研究認為,連接臂以含末端活性基團的鏈環(huán)烴為宜,不應(yīng)含有其它高免疫活性的結(jié)構(gòu)如芳環(huán)、共軛雙鍵或雜環(huán)等,以減少所產(chǎn)生的抗體對連接臂的過度識別而降低對目標分子的識別能力。

1.2 半抗原分子設(shè)計應(yīng)滿足的基本要求

不管采用任何路徑,在半抗原分子設(shè)計時,均應(yīng)符合以下四點基本要求,一是與待測靶標物在分子結(jié)構(gòu)、空間構(gòu)象、電子分布和疏水性上應(yīng)盡可能相似,以便于機體對特征結(jié)構(gòu)進行識別[38];二是半抗原與載體蛋白之間引入的間隔臂應(yīng)是具有一定長度的碳鏈,且間隔臂自身不誘導機體產(chǎn)生“橋抗體”[39];三是改造后的半抗原分子末端需有可直接與載體蛋白偶聯(lián)的活性基團,且活性基團的存在對待測靶標物分子的電子分布沒有影響;四是半抗原與載體偶聯(lián)后仍應(yīng)保留待測物分子的基本特征結(jié)構(gòu)[40]。

1.3 半抗原分子設(shè)計應(yīng)遵循原則

在進行半抗原分子設(shè)計時,應(yīng)遵循四點原則,一是由于抗原的免疫原性與半抗原分子空間結(jié)構(gòu)的復雜程度呈正相關(guān),應(yīng)引入不飽和的立體結(jié)構(gòu),增加結(jié)構(gòu)復雜性,進而增強免疫原性[41];二是引入間隔臂位置應(yīng)遠離半抗原的特征結(jié)構(gòu),盡量避免對特異性抗原決定簇的干擾,提高抗體的親和性和特異性[42];三是引入間隔臂長度應(yīng)適宜,間隔臂太短,則載體的空間位阻影響機體的免疫系統(tǒng)對半抗原特征結(jié)構(gòu)的識別;間隔臂太長,則可能因氫鍵、疏水作用或其它作用力使半抗原發(fā)生折疊而不被機體的免疫系統(tǒng)識別[43]。四是引入反應(yīng)條件應(yīng)溫和,簡單易行,改造產(chǎn)物產(chǎn)率高,且易分離純化。

2 抗原合成方法

抗原合成方法的研究包括載體的選擇、偶聯(lián)方法的選擇、反應(yīng)條件的選擇和偶聯(lián)率的選擇等。

2.1 載體的選擇

小分子半抗原與載體偶聯(lián)合成人工抗原,通過載體效應(yīng)誘導機體免疫應(yīng)答,產(chǎn)生針對小分子半抗原的特異性抗體[44]。用于小分子半抗原免疫檢測的人工抗原包括免疫抗原和包被抗原兩種,在合成人工抗原選擇載體時,應(yīng)考慮兩個方面,一是載體的種類,常用的載體有蛋白質(zhì)和聚合物兩類,載體蛋白鑰孔血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)、牛血清蛋白(bovine serum albumin,BSA)、卵清蛋白(ovalbumin,OVA)、人血清蛋白(human serum albumin,HSA)、兔血清白蛋白(rabbit serum albumin,RSA)等,其中KLH免疫活性最好,但價格昂貴;BSA性質(zhì)穩(wěn)定,價廉易得,免疫活性較好,應(yīng)用最為普遍。聚合物包括多肽聚合物和大分子聚合物,常見的多肽聚合物有多聚賴氨酸、二軟脂酰賴氨酸、多聚谷氨酸和多聚氨基酸等,大分子聚合物有羧甲基纖維素、聚乙烯比咯烷酮等,但在人工抗原合成的實際工作中,載體的選擇仍以蛋白質(zhì)為主,聚合物應(yīng)用較少[45]。二是免疫抗原和包被抗原應(yīng)使用不同的載體,且盡可能引入不同的連接臂,以提高抗原抗體反應(yīng)的靈敏性和特異性。

2.2 偶聯(lián)方法的選擇

根據(jù)半抗原的分子結(jié)構(gòu)上具有的活性基團性質(zhì)或通過活性位點引入的活性基團性質(zhì),采用不同的化學反應(yīng)方法實現(xiàn)與載體蛋白分子的氨基或其他基團的偶聯(lián)合成抗原[46]。半抗原分子結(jié)構(gòu)上存在或引入的活性基團主要包括氨基(-NH2)、羧基(-COOH)、羥基(-OH)、羰基(-CO-)、巰基(-SH)等,常用的偶聯(lián)方法見表1。

2.3 偶聯(lián)條件的選擇

偶聯(lián)過程其實質(zhì)就是半抗原化合物、偶聯(lián)劑、載體蛋白在一定條件下的化學反應(yīng)過程,主要考慮三個方面的反應(yīng)條件,一是參與反應(yīng)各物質(zhì)的初始摩爾濃度;二是反應(yīng)的溶液體系及pH要求,若半抗原化合物溶于水,偶聯(lián)反應(yīng)可在水相中進行;若半抗原化合物難溶或不溶于水,偶聯(lián)反應(yīng)應(yīng)在水、有機溶劑混合的有機相中進行,此時應(yīng)選擇既能使半抗原溶解又保持載體蛋白呈可溶狀態(tài),并對載體蛋白的生物活性沒有影響的有機溶劑,如吡啶、1,4-二氧六環(huán)、丙酮、二甲基甲酰胺;三是偶聯(lián)反應(yīng)的溫度和時間要求。

2.4 偶聯(lián)率的選擇

偶聯(lián)率是影響人工抗原免疫效果的重要因素之一,適宜的偶聯(lián)率有助于提高抗體的親和力和特異性,但不同半抗原化合物的最佳偶聯(lián)率目前學界尚未定論。過去一些學者曾經(jīng)認為偶聯(lián)率越大越好,但Gefen等[68]和Peterson等[69]的研究結(jié)果表明,較大的偶聯(lián)率并不能得到預期的免疫效果,原因在于載體上覆蓋過多的半抗原時,不利于載體與淋巴細胞的結(jié)合,減弱載體效應(yīng),半抗原與載體蛋白最佳偶聯(lián)率應(yīng)為(10～20)∶1。Singh等[70]在制備農(nóng)藥莠去津(atrazine)抗體時研究發(fā)現(xiàn),偶聯(lián)率為15∶1時抗體的效價和特異性最高,而不是20∶1和40∶1,認為低偶聯(lián)率的人工抗原引起的免疫反應(yīng)較慢,但可獲得親和力高、特異性強的抗體。因此,為取得比較理想的免疫效果,應(yīng)根據(jù)不同半抗原的特征結(jié)構(gòu)通過篩選確定最佳偶聯(lián)率。

3 AFB1半抗原分子設(shè)計與抗原合成及抗體特性

AFB1屬多環(huán)不飽和雙呋喃香豆素內(nèi)酯類化合物,含有一個與基本毒性有關(guān)的雙呋喃環(huán)結(jié)構(gòu)和致癌性有關(guān)的氧雜萘鄰酮結(jié)構(gòu)(見圖1),根據(jù)其分子結(jié)構(gòu)上存在的活性基團和活性位點,AFB1半抗原分子設(shè)計與抗原合成方法主要有肟化活潑酯法、氨甲基化法、混合酸酐法、環(huán)氧化物法、半縮醛法、烯醇醚衍生物法等。人工抗原制備所選用的載體蛋白主要是牛血清白蛋白(BSA)、鑰孔戚血藍蛋白(KLH)兩種等。

圖1 AFB1分子結(jié)構(gòu)式Fig.1 Molecular structure of AFB1

表1 制備小分子半抗原人工抗原常用的偶聯(lián)方法Table 1 Common coupling methods for preparation of artificial antigen of small molecule antigen

續(xù)表

3.1 肟化活潑酯法

AFB1的環(huán)戊烯酮環(huán)上存在有羰基活性基團(1位),以甲醇水溶液為溶劑,以吡啶為催化劑,以羧甲基羥胺半鹽酸鹽(CMO)為半抗原肟化劑,在加熱回流條件下,AFB1的羰基與CMO的氨基縮合形成N-O-甲基羧酸(-COOH),使AFB1肟化為AFB1O。之后采用活潑酯法合成人工抗原,使用雙功能偶聯(lián)劑1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺(EDC)在水溶液中或使用是N,N″-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)在有機溶液中將AFB1O中的-COOH與載體蛋白的-NH2以單酰胺鍵(-CONH-)的形式實現(xiàn)偶聯(lián),合成路線見圖2。該方法Chu等[71]于1977年建立,AFB1O的產(chǎn)率為73%～83%,之后Kolosova等[72]和Cervino等[73]對該方法進行了完善,AFB1O的產(chǎn)率提高到90%以上,獲得了抗AFB1高效價、敏感、特異的抗體。孫清等[74]和謝琿等[75]采用該方法分別獲得了代表性雜交瘤細胞株2A4和3B9,制備出了高質(zhì)量的mAb,尤其是2A4株mAb對AFB1的半數(shù)抑制濃度(IC50)為0.066 μg/mL,與其他AF無交叉反應(yīng)。Zhang等[76]對該方法進一步優(yōu)化,篩選出了靈敏性高、識別譜廣的雜交瘤細胞株1C11,所分泌的mAb對AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的IC50分別可達1.2、1.3、2.2、18.0 pg/mg。

圖2 肟化活潑酯法合成AFB1人工抗原路線Fig.2 Synthesis scheme of AFB1-BSA artificial antigen by oximation and active ester method

3.2 氨甲基化法

AFB1的環(huán)戊烯酮環(huán)上有兩個α-活潑氫(2位),在微酸性條件下(pH4.0),以28%乙醇水溶液為反應(yīng)體系,α-活潑氫、甲醛及載體蛋白氨基酸上的氨基三者可以發(fā)生氨甲基化反應(yīng),又稱曼尼希(Mannich)反應(yīng),以Mannich堿的形式實現(xiàn)AFB1與載體蛋白的偶聯(lián),合成路線見圖3。該方法韋耀鵬等[77]于1992年建立,步驟簡單,操作方便,但產(chǎn)物產(chǎn)率不高。Fuentes等[78]和Zhou等[79]進一步完善實驗方案,研究結(jié)果表明,載體蛋白經(jīng)陽離子化處理后,可顯著提高抗原的免疫活性,在合成人工抗原時,首先用偶聯(lián)劑EDC將載體蛋白BSA進行陽離子化(cBSA),再利用Mannich反應(yīng)制備人工抗原AFB1-cBSA。Urusov等[80]的實驗結(jié)果表明,AFB1-cBSA免疫動物后取得了較好的免疫效果,對AFB1多克隆抗體(pAb)敏感性較高,IC50為1.6 ng/mL,但其特異性需要進一步提高。

圖3 氨甲基化法合成AFB1人工抗原路線Fig.3 Synthesis scheme of AFB1-BSA artificial antigen by aminomethylation method

3.3 混合酸酐法

AFB1經(jīng)代謝形成AFB2a與AFQ1,在AFB2a的雙呋喃環(huán)結(jié)構(gòu)上存在一個羥基(-OH)活性基團(2位),在AFQ1的環(huán)戊烯酮環(huán)結(jié)構(gòu)上同樣存在一個-OH活性基團,首先,以四氫呋喃為溶劑,與酸酐反應(yīng)形成半酯化合物AFB2a-HS,之后,以四氫呋喃為溶劑,在三正丁胺和氯甲酸異丁酯作用下,以單酰胺鍵的形式實現(xiàn)與載體蛋白的偶聯(lián),合成路線見圖4、圖5。Lau等[81]1981年建立了AFB2a-BSA合成方法,隨后該課題組成員Gaur等[82]進行了完善,研究結(jié)果表明,AFB2a-BSA為抗原制備的抗體可100%識別AFB1。Fan等[83]1984年首先合成AFQ1-BSA人工抗原,制備出兔源pAb,并建立了間接競爭ELISA檢測方法,對AFB1的IC50為2.95 ng/mL,檢測限為2 ng/mL,與其他化合物交叉反應(yīng)均大于1000 ng/mL。

圖4 混合酸酐法法合成AFB2a-BSA人工抗原路線Fig.4 Synthesis scheme of AFB2a-BSA artificial antigen by mixed anhydride method

圖5 混合酸酐法合成AFQ1-BSA人工抗原路線Fig.5 Synthesis scheme of AFQ1-BSA artificial antigen by mixed anhydride method

3.4 半縮醛法

AFB2a為是AFB1的代謝產(chǎn)物,又是AFB1的半縮醛形式,以丙酮為溶劑,在H2SO4作用下AFB1可轉(zhuǎn)化為AFB2a,AFB2a的醛基(-CHO-)與載體蛋白的氨基(-NH2)生成不穩(wěn)定的希夫氏堿(schiff-base),在還原劑硼氫化鈉(NaBH4)的還原作用下,酰胺鍵雙鍵(-C=N-)被還原成單鍵(-C-N-),生成穩(wěn)定的AFB2a-Protein復合物,合成路線見圖6。Ashoor等[84]1975年建立了該方法,Kononenko等[85]運用該方法制備免疫抗原,免疫動物后獲得的pAb與AFB1、AFB2的交叉反應(yīng)率均為100%,與AFG1、AFG2的0.4%。肖智等[86]運用該方法制備了雜交瘤細胞3A12,所分泌的單克隆抗體(mAb)對AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的交叉反應(yīng)率分別為100%、7.8%、22.2%和0.6%,對AFB1的IC50為6.1 ng/mL,檢測限為0.6 ng/mL。

圖6 半縮醛法合成AFB1-BSA人工抗原路線Fig.6 Synthesis scheme of AFB1-BSA artificial antigen by hemiacetal method

圖7 烯醇醚衍生物法合成AFB1-BSA人工抗原路線Fig.7 Synthesis scheme of AFB1-BSA artificial antigen by enol ether derivative method

3.5 烯醇醚衍生物法

AFB1與AFG1的雙呋喃環(huán)結(jié)構(gòu)上存在活性位點,即雙呋喃環(huán)中外側(cè)呋喃環(huán)氧原子臨位位點,利用該位點,通過添加乙醇酸(Glycolic Acid,GA)連接臂,獲得了一種新的黃曲霉毒素烯醇醚衍生物AFB1-Glycolic Acid(AFB1-GA)和AFG1-Glycolic Acid(AFG1-GA),利用衍生物的羧基與載體蛋白偶聯(lián)制備完全抗原,合成路線見圖7、圖8。Cervino等[87]于2007年建立了該方法,反應(yīng)簡單,操作簡便,但對反應(yīng)試劑純度及反應(yīng)條件要求較高,所制備的pAb和mAb與其他AF化合物存在較強的交叉反應(yīng),抗體的特異性有待進一步提高。

圖8 烯醇醚衍生物法合成AFG1-BSA人工抗原路線Fig.8 Synthesis scheme of AFG1-BSAartificial antigen by enol ether derivative method

3.6 環(huán)氧化物法

該方法是以二氯甲烷為溶劑,AFB1雙呋喃環(huán)雙鍵被過氧化物氧化形成AFB1環(huán)氧化物(4位、5位),AFB1環(huán)氧化物可與載體蛋白的一級胺發(fā)生反應(yīng)形成二級胺,在反應(yīng)過程中,環(huán)被打開,在環(huán)氧化合物上形成一個β-羥基,以單酰胺的形式與載體蛋白偶聯(lián),這是AFB1致癌過程中的主要反應(yīng)[88],也是合成AFB1抗原的途徑之一,合成路線見圖9。Martin等[89]于1977年報道該方法,Groopman等[90]進行了改進,制備出mAb雜交瘤細胞株2B11,抗體亞類為IgM,能較好識別AFB1、AFB2,所建立得免疫吸附測定柱層析系統(tǒng)對AFB1的檢測限達到5 ng/mL。但由于反應(yīng)需要較高的堿性環(huán)境(pH11～12),且AFB1環(huán)氧化物活性較高,易于和水及氧化劑形成副產(chǎn)物而影響產(chǎn)率,該方法目前已不常用。

圖9 環(huán)氧化物法合成AFB1-BSA人工抗原路線Fig.9 Synthesis scheme of AFG1-BSA artificial antigen by epoxide reaction method

4 展望

近年來,國內(nèi)外學者國對半抗原分子設(shè)計及人工抗原合成進行了大量的實踐探索,總結(jié)了一些規(guī)律和方法,但就AFB1半抗原分子設(shè)計與抗原合成而言,仍停留在經(jīng)驗設(shè)計層面,多采用試錯法(trial-and-error assays)進行,最終是通過動物實驗來驗證半抗原分子設(shè)計與抗原合成的合理性,存在較大的盲目性和偶然性。隨著免疫學、計算科學、量子化學、分子動力學等學科理論的發(fā)展,以及分子模擬技術(shù)、計算機輔助技術(shù)、網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫分析技術(shù)等在半抗原分子設(shè)計與抗原合成中的應(yīng)用,以半抗原分子結(jié)構(gòu)復雜程度與潛在免疫特性分析、活性位點的選擇、活性基團的引入和連接臂的選擇為主要研究內(nèi)容的半抗原分子設(shè)計與抗原合成理論逐漸豐富與完善,可實現(xiàn)半抗原分子設(shè)計與抗原合成的可控性、預見性,必將推動我國食品小分子污染物免疫檢測方法的快速發(fā)展。

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Research progress in hapten molecule design and immunogen synthesis and antibody characteristics of aflatoxin B1

WANG Ya-nan1,2,WANG Xiao-fei3,NIU Lin-lin1,2,LEI Zhuang1,2,ZHANG Hai-tang1,2,WANG Zi-liang1,2,*

(1.The Animal Science and technology College,Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang 453003,China; 2.Animal Viral Disease Control and Residual Analysis Henan Higher Education Key Discipline Open Laboratory,Xinxiang 453003,China; 3.School of Xinke,Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang 453003,China)

To provide new methods and ideas of preparation of high quality antibodies for aflatoxin B1(AFB1)and other small molecule hapten,the domestic and foreign research progress on molecular design method,the basic requirements,principles to be followed and antigen synthesis methods were reviewed in this paper,in particular,the AFB1hapten molecule design,antigen synthesis and antibody characteristics were described in detail.

aflatoxin B1;hapten molecule design;antigen synthesis;antibody characteristics

2016-07-08

王亞楠(1989-), 女, 碩士研究生, 研究方向:食品安全免疫檢測,E-mail:792176339@qq.com。

*通訊作者:王自良(1966-), 男, 博士, 教授, 研究方向:免疫學與抗體工程,E-mail:wangziliang66@126.com。

“十二五”國家科技支撐計劃項目(2014BAD13B05)。

TS201.1

A

1002-0306(2016)23-0367-10

10.13386/j.issn1002-0306.2016.23.061