蘇世偉,郭順堂,*,張 超,張 婷,梁 明

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院,北京 100083;2.無(wú)限極(中國(guó))有限公司,廣東廣州 510665)

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食源性生物活性肽指紋圖譜的含義與構(gòu)建

蘇世偉1,郭順堂1,*,張 超2,張 婷2,梁 明2

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院,北京 100083;2.無(wú)限極(中國(guó))有限公司,廣東廣州 510665)

食源性生物活性肽具有顯著的生理功能,成為世界范圍內(nèi)研究和開發(fā)的熱點(diǎn)。隨著生物活性肽產(chǎn)品的增多,建立針對(duì)特定種類肽的鑒定方法日益重要。本文在已有的關(guān)于食源性生物活性肽的研究基礎(chǔ)上,借鑒中藥的指紋圖譜技術(shù),對(duì)建立用于鑒別生物活性肽的指紋圖譜的含義和構(gòu)建方法進(jìn)行了探討。肽指紋圖譜的建立可為肽產(chǎn)品行業(yè)的生產(chǎn)管理和真?zhèn)舞b定工作提參考。

食源性肽,生物活性,指紋圖譜

生物活性肽是指具有特殊生理活性的、可影響生物體機(jī)能和健康狀況的肽類物質(zhì)[1],而食源性生物活性肽是指食物蛋白經(jīng)水解后形成的寡肽、多肽及具有復(fù)雜線性、環(huán)形結(jié)構(gòu)肽類的總稱[2],如酪蛋白磷酸肽、大豆抗氧化肽、乳源降血壓肽等。其中酶解法安全性高、工藝簡(jiǎn)單、成本低,適于肽產(chǎn)品的大量生產(chǎn)[3]。近年來(lái),國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)生物活性肽的種類、結(jié)構(gòu)、性質(zhì)及制備方法進(jìn)行了深入的研究,包括具有免疫調(diào)節(jié)、增強(qiáng)骨密度、降血壓、降血脂、抗氧化、改善腸道菌群等功能的肽類[4]。目前,已有多種生物活性肽產(chǎn)品上市,如核桃多肽飲料[5]、大豆多肽運(yùn)動(dòng)飲料[6]、雞皮膠原蛋白肽[7]等。

然而,隨著生物活性肽市場(chǎng)需求量的增加,肽產(chǎn)品的真?zhèn)魏凸δ苄Ч蔀橄M(fèi)者關(guān)注的問(wèn)題。但是,肽產(chǎn)品是由多種肽段組成的非均一性混合物,其生理活性受肽段的分子量、氨基酸組成、聚合結(jié)構(gòu)等多因素影響[8],因此,僅根據(jù)肽的一種性質(zhì)或特征難以對(duì)不同種類、功能或不同廠家生產(chǎn)的生物活性肽做出鑒別。

指紋圖譜技術(shù)是借助于現(xiàn)代分析技術(shù)手段對(duì)某一產(chǎn)品中能夠顯示其品種、產(chǎn)地及組成體系特征的穩(wěn)定性成分進(jìn)行分析和評(píng)價(jià)的一種綜合性鑒別方法,能夠鑒別產(chǎn)品真實(shí)性和評(píng)價(jià)質(zhì)量一致性[9],例如,中藥指紋圖譜學(xué)可鑒別中藥種類、原料、物質(zhì)作用基礎(chǔ)[10];葡萄酒指紋圖譜可用于鑒別葡萄酒的品種、產(chǎn)地、酒齡等[11]。

本文借鑒中藥和酒類指紋圖譜的概念和技術(shù),結(jié)合生物活性肽的自身特點(diǎn),對(duì)生物活性肽指紋圖譜的含義和構(gòu)建方法進(jìn)行了探討,其目的是為肽生產(chǎn)行業(yè)表征肽產(chǎn)品的功能和質(zhì)量,進(jìn)行生產(chǎn)管理和開展鑒偽工作提供參考。

1 生物活性肽指紋圖譜的含義

蛋白質(zhì)組學(xué)中的肽指紋圖譜技術(shù)是指蛋白質(zhì)被酶解或化學(xué)降解后肽段的分離分析技術(shù)[12],主要用于確定蛋白質(zhì)的序列、鑒定蛋白質(zhì)及分析蛋白質(zhì)的完整性和準(zhǔn)確性[12-14]。

與蛋白質(zhì)的肽指紋圖譜不同,生物活性肽雖然也是蛋白質(zhì)水解物,但生物活性肽的指紋圖譜不僅要包含蛋白質(zhì)組學(xué)中的肽序列等內(nèi)容,還應(yīng)包括生理活性特征、基本性質(zhì),這樣才能鑒別肽產(chǎn)品的真實(shí)性、評(píng)價(jià)質(zhì)量一致性和產(chǎn)品穩(wěn)定性?；谏锘钚噪牡慕M成、性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和功能的復(fù)雜性,需借助于化學(xué)分析、光譜和色譜等多種技術(shù)進(jìn)行分析,獲得肽的物理化學(xué)和生物活性指紋特征。由于肽的生物活性與分子量分布、氨基酸組成、疏水性等多項(xiàng)因素決定[8],因此肽指紋圖譜需綜合多個(gè)方面的指標(biāo),包括原料特征、分子量分布、氨基酸組成、理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)特征、功能活性等,從而可較充分地反映出生物活性肽混合體系的整體狀況,實(shí)現(xiàn)對(duì)生物活性肽的原料區(qū)分、品質(zhì)保證和工藝監(jiān)測(cè)。

2 生物活性肽指紋圖譜的構(gòu)建

2.1 構(gòu)建生物活性肽指紋圖譜要遵從的原則

2.1.1 原料要求 構(gòu)建生物活性肽指紋圖譜的目的是用于成分復(fù)雜、有效成分多樣的肽產(chǎn)品活性鑒別,保證產(chǎn)品批次間質(zhì)量的穩(wěn)定性,所以要求廠家必須固定原料的品種、產(chǎn)地、采收季節(jié)、貯藏條件和生產(chǎn)工藝。

2.1.2 檢測(cè)指標(biāo)要求 生物活性肽的成分復(fù)雜,不僅有大量的分子量不同、性質(zhì)各異的肽段,還有一些氨基酸、酚類、有機(jī)酸類萜類、生物堿類等成分。例如,Cudennec等[15]從褐蝦蛋白水解物中得到的促進(jìn)縮膽囊素釋放的活性肽組分(1000 u

另外,一種肽段或肽類混合物可能有多種生物活性,如Meisel等[19]從牛奶蛋白水解物得到的六肽(TTMPLW)既有ACE抑制效果又有增強(qiáng)免疫力的作用;Srinivas等[20]酶解α-酪蛋白得到的肽類混合物同時(shí)有抗氧化、螯合Zn2+和抗菌的功效。同時(shí),肽在貯存過(guò)程中會(huì)發(fā)生聚集[21],其性質(zhì)也可能繼而發(fā)生變化。肽的生物活性也受生產(chǎn)工藝的控制,例如由于不同的蛋白酶有不同的酶切位點(diǎn)[22],因而會(huì)得到不同的肽段;通過(guò)不同的離子親和層析技術(shù)可得到具有不同金屬親和能力的肽段[23]?？傊?生物活性肽的性質(zhì)不穩(wěn)定性及其活性受工藝影響的特定也決定了生物活性肽指紋圖譜的建立必須整合多個(gè)具有專屬性、重復(fù)性和可行性的指標(biāo)。從復(fù)雜的數(shù)據(jù)中最大限度的提取信息,利于進(jìn)一步揭示物質(zhì)的隱含性質(zhì)[24]。

2.1.3 檢測(cè)部門要求 生物活性肽指紋圖譜的應(yīng)用與研究不能局限于研究與質(zhì)檢部門,而應(yīng)與生產(chǎn)、流通等部門相互協(xié)調(diào),共同參與,才可保證圖譜的專屬性、重復(fù)性及實(shí)用性,使得生物活性肽指紋圖譜真正成為其質(zhì)量評(píng)價(jià)的一種有效方法。

2.1.4 檢測(cè)方法和條件要求 指紋圖譜的實(shí)驗(yàn)方法和條件的確定是研究檢測(cè)方法過(guò)程中最重要、最關(guān)鍵的內(nèi)容,不論選擇何種技術(shù),均應(yīng)結(jié)合實(shí)際,選擇的原則必須具有良好的重現(xiàn)性和可行性。

2.2 生物活性肽指紋圖譜的構(gòu)建

生物活性肽的類型和功能活性由兩方面決定——蛋白原料和生產(chǎn)工藝[25]。因此,為了全面了解一種生物活性肽,便于日后的真?zhèn)舞b別工作,需對(duì)肽的蛋白原料、生產(chǎn)工藝和生物活性3個(gè)方面進(jìn)行研究,即建立的生物活性肽指紋圖譜需包括3個(gè)層次的“子指紋圖譜”:判別肽原料蛋白的指紋圖譜、肽生產(chǎn)工藝指紋圖譜、肽生物活性指紋圖譜。

2.2.1 “判別肽原料蛋白的指紋圖譜”的構(gòu)建 食源性生物活性肽的原料來(lái)源廣泛,包括植物蛋白、動(dòng)物蛋白、動(dòng)植物副產(chǎn)物等,不同原料蛋白的成本、性質(zhì)、氨基酸組成和序列不同。生物活性肽是存在于蛋白質(zhì)中的特殊片段,與其原料蛋白的氨基酸組成和序列密切相關(guān)。活性肽在酶解后被釋放出來(lái),顯示不同的功能活性[18,26-27]。因此,固定的蛋白原料是保證肽產(chǎn)品質(zhì)量的前提,當(dāng)確定了制備生物活性肽的原料蛋白后,其種類則被進(jìn)一步確認(rèn),有利于下一步的分析和鑒別,所以要建立肽原料蛋白區(qū)分指紋圖譜。

肽原料蛋白區(qū)分指紋圖譜的建立可通過(guò)分析特征性次生代謝產(chǎn)物、特征氣味和HPLC-MS2測(cè)序追溯原料蛋白三種途徑實(shí)現(xiàn)。一些蛋白尤其是植物蛋白含有特殊的次生代謝產(chǎn)物,如菜籽蛋白中有菜籽堿,花生蛋白中含有白藜蘆醇,核桃蛋白中有酚類物質(zhì)、大豆蛋白中有異黃酮等。由這些蛋白制備的肽也可能含有相應(yīng)的特征次生代謝產(chǎn)物,因此對(duì)于這類生物活性肽,可根據(jù)通過(guò)其本身帶有的特征性次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行區(qū)分。一些蛋白可能結(jié)合有特殊風(fēng)味,如牛血清白蛋白會(huì)結(jié)合有醛類、酮類等風(fēng)味物質(zhì)[28],這些物質(zhì)在蛋白酶解中被釋放而可被檢測(cè);而一些蛋白在酶解過(guò)程中可能生成特征性風(fēng)味物質(zhì),例如小麥蛋白在酶解過(guò)程中發(fā)生美拉德反應(yīng)而產(chǎn)生肉味[29]。因此,可以通過(guò)氣相色譜根據(jù)氣味特征對(duì)生物活性肽區(qū)分以明確其原料來(lái)源。若無(wú)特殊的標(biāo)志性物質(zhì),則可通過(guò)HPLC-MS2測(cè)序追溯原料蛋白。

2.2.2 “肽生產(chǎn)工藝指紋圖譜”的構(gòu)建 蛋白原料特征和生產(chǎn)工藝共同決定肽的類型和活性[30],所以當(dāng)原料蛋白確定后,肽的性質(zhì)(如分子量分布、兩親性、疏水性、肽含量、氨基酸組成、電荷性質(zhì)等)和活性主要由生產(chǎn)工藝決定。生產(chǎn)工藝包括多個(gè)指標(biāo),如酶制劑的種類、酶用量、溫度、pH等。除此之外,還有為提高目標(biāo)活性肽含量的純化或富集工藝,如Holder等[31]利用超濾系統(tǒng)相結(jié)合的多步循環(huán)膜反應(yīng)器得到了ACE抑制能力提高13%的肽段組分;劉靜等[32]利用3種酶(堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶)協(xié)同水解大豆蛋白制得相對(duì)分子質(zhì)量主要集中在6000 u以下的大豆肽;Berot等[33]利用ZrO2載體膜技術(shù)分離得到疏水性肽段比例占77%～88%的肽段組分和親水性肽段比例為84%～90%的肽組分。這些處理工藝將會(huì)影響最終肽產(chǎn)品的化學(xué)性質(zhì)和生物活性。因此,需要在生產(chǎn)的各個(gè)環(huán)節(jié)設(shè)定相應(yīng)的檢測(cè)指標(biāo),如不同酶解時(shí)間點(diǎn)蛋白質(zhì)的水解度;在純化或富集環(huán)節(jié),中間產(chǎn)品的分子量分布、親水性-疏水性等特征;在濃縮、干燥、配制等環(huán)節(jié),中間產(chǎn)品肽含量、生物活性等。

總之,需要掌控各個(gè)生產(chǎn)環(huán)節(jié)中相應(yīng)產(chǎn)物的特征,利用各級(jí)中間產(chǎn)物的水解度、分子量分布、親水性-疏水性、電荷性質(zhì)、生物活性等指標(biāo)共同構(gòu)建肽生產(chǎn)工藝的指紋圖譜,以對(duì)其工藝進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和有效追蹤。

2.2.3 “肽生物活性指紋圖譜”的構(gòu)建 生物活性肽的功能活性最終由其氨基酸組成、序列和構(gòu)型決定,若指紋圖譜能包含這3項(xiàng)指標(biāo),即對(duì)每批樣品的氨基酸組成、序列和構(gòu)型進(jìn)行定性和定量分析,則可明確地對(duì)這種生物活性肽進(jìn)行防偽和質(zhì)量控制。但此目的的實(shí)現(xiàn)需要兩個(gè)條件:單一的肽段組成,明確的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系。然而,酶解得到的肽是一種混合物,它的功能活性無(wú)法和某一特征肽段建立專一的對(duì)應(yīng)性,而可能是多個(gè)肽段共同作用的結(jié)果;再者,到目前為止,肽的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系還沒(méi)有具體明確。因此,不可能將一個(gè)或幾個(gè)肽段的氨基酸組成或序列測(cè)定指標(biāo)作為肽的指紋。

盡管肽的結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系沒(méi)有完全明確,但對(duì)一些肽的性質(zhì)與功能活性的關(guān)系總結(jié)表明:肽的功能活性由分子結(jié)構(gòu)、氨基酸組成、氨基酸序列決定,因此生物活性肽的結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系可由肽的化學(xué)性質(zhì)與功能活性關(guān)系體現(xiàn)。目前所報(bào)道的肽的化學(xué)性質(zhì)一般包括疏水性、兩親性、電荷性、分子量、微量元素結(jié)合能力等[34-37]。其中分子量是較重要的特征指標(biāo),如Meisel等[38]報(bào)道生物活性肽一般有2～20個(gè)氨基酸組成,Zeng等[39]發(fā)現(xiàn)牡蠣的水解物中,分子量在1～5 ku的范圍內(nèi)的肽組分生物活性最強(qiáng);Cudennec等[15]發(fā)現(xiàn)從蝦頭蛋白水解物中得到的分子量在1～1.5 ku的肽段組分可顯著影響縮膽素的釋放;Li等[16]報(bào)道分子量在500～1500 u的玉米肽段抗氧化活性更強(qiáng)。氨基酸組成和疏水性也是常用指標(biāo),如You[40]和Liu等[41]報(bào)道,富含組氨酸、亮氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸和半胱氨酸的肽有較強(qiáng)的清除DPPH自由基的能力;富含疏水氨基酸(如脯氨酸和羥脯氨酸)則能有效地抑制脂肪氧化,此類肽表現(xiàn)出較強(qiáng)的疏水性;富含帶正電荷的疏水區(qū)域的肽能更好地穿過(guò)細(xì)胞膜,因而有較強(qiáng)的抗菌功效[42];二級(jí)結(jié)構(gòu)不同的肽,如α螺旋肽、β折疊肽和無(wú)定形肽的抗菌效果也有區(qū)別[43]。

由上可知,肽的生物活性主要與分子量、疏水性和二級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān),且這些特征性指標(biāo)能通過(guò)高效液相色譜技術(shù)和紅外技術(shù)獲得,由此,肽生物活性指紋圖譜的建立應(yīng)該主要分為6個(gè)步驟:

第一，通過(guò)凝膠色譜技術(shù)分離得到不同分子量分布的肽段組分;

第二，檢測(cè)各個(gè)組分的生物活性,得到單位質(zhì)量生物活性最高的肽段組分;

第三，獲得凝膠色譜分離前總樣品和各個(gè)組分的分子量分布、疏水性、二級(jí)結(jié)構(gòu)等特征;

第四，對(duì)照各個(gè)組分和總樣品的分子量譜圖、疏水性譜圖和紅外譜圖;

第五，得到總樣品和活性最高組分間共有的特有信息;

第六，匯總這些特有信息,構(gòu)建能反應(yīng)肽產(chǎn)品活性的指紋圖譜。

總之,以眾多的肽化學(xué)性質(zhì)與功能活性關(guān)系理論為基礎(chǔ),在明確一種肽的功能活性后,可利用與肽的生物活性相關(guān)的性質(zhì)指標(biāo)構(gòu)建肽生物活性指紋圖譜。

2.3 生物活性肽指紋圖譜的校對(duì)、復(fù)核和最終確立

建立指紋圖譜的實(shí)驗(yàn)方法和實(shí)驗(yàn)條件必須經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的方法學(xué)驗(yàn)證,即準(zhǔn)確性(數(shù)據(jù)間的相近程度)、精密度(數(shù)據(jù)的離散程度)、耐用性(不同條件下分析同一樣品所得結(jié)果的變化程度)。因此,方法驗(yàn)證的目的是證明采用的指紋圖譜測(cè)定方法具有可靠性和可重復(fù)性,符合指紋圖譜測(cè)定的要求。

3 總結(jié)

隨著生物活性肽產(chǎn)品種類的增多,建立肽的指紋圖譜日益重要。通過(guò)肽指紋圖譜,能夠鑒別肽產(chǎn)品的蛋白來(lái)源、監(jiān)控其生產(chǎn)工藝、保證其生理活性。利于增加消費(fèi)者對(duì)產(chǎn)品的可信度,維護(hù)企業(yè)形象,促進(jìn)肽產(chǎn)品行業(yè)的長(zhǎng)足發(fā)展。

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Signification and identification of food -derived bioactive peptides fingerprint

SU Shi-wei1,GUO Shun-tang1,*,ZHANG Chao2,ZHANG Ting2,LIANG Ming2

(1.College of Food Science and Nutritional Engineering,China Agricultural University,Beijing 100083,China;2.Infinitus(China)Company Ltd.;Guangzhou 510665,China)

Food-derived bioactive peptides exert multiple biological functions and thus attract worldwide interests for research and application. The increasing prosperity of bioactive peptides products urges an accurate method for evaluation and determination of peptides products. Based on numerous researches of bioactive peptides in the passing decades,the definition and construction of fingerprint used for identifying bioactive peptides are discussed in the report. The fingerprint construction of bioactive peptides could serve as a theoretical reference for the production management and application in peptides food industry.

food-derived peptides;bioactive activities;fingerprint

2016-04-25

蘇世偉(1991-)，女，碩士，研究方向：生物活性肽指紋圖譜的構(gòu)建，E-mail:shiwei_su@yahoo.com。

*通訊作者:郭順堂(1962-)，男，博士，教授，主要從事植物蛋白和肽的研究，E-mail:shuntang@cau.edu.cn。

TS207.7

A

1002-0306(2016)23-0396-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.23.066