勵(lì)建榮,國競文,李婷婷

(1.渤海大學(xué)食品科學(xué)研究院,遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧錦州 121013;2.大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,遼寧大連 116600;3.西南大學(xué)食品學(xué)院,重慶 400715)

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細(xì)菌共培養(yǎng)及其系統(tǒng)中群體感應(yīng)現(xiàn)象的研究進(jìn)展

勵(lì)建榮1,國競文1,李婷婷2,3,*

(1.渤海大學(xué)食品科學(xué)研究院,遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧錦州 121013;2.大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,遼寧大連 116600;3.西南大學(xué)食品學(xué)院,重慶 400715)

本文對(duì)微生物的共培養(yǎng)方式、分類、發(fā)展及應(yīng)用進(jìn)行了簡介,并對(duì)不同種屬的微生物共培養(yǎng)后產(chǎn)生的作用進(jìn)行了綜述。微生物共培養(yǎng)系統(tǒng)不僅受到協(xié)同代謝作用的調(diào)控,群體感應(yīng)在微生物共培養(yǎng)中也扮演著重要的角色。與純培養(yǎng)相比,共培養(yǎng)體系生物被膜的形成、信號(hào)分子和毒力因子的產(chǎn)生、細(xì)菌素的合成以及胞外蛋白酶的分泌等都有所不同。研究群體感應(yīng)的作用機(jī)理有助于共培養(yǎng)技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展與應(yīng)用。

微生物,共培養(yǎng),協(xié)同代謝,群體感應(yīng)

人們對(duì)微生物的研究大多局限于純培養(yǎng)方式,對(duì)于微生物共培養(yǎng)的研究較少,其實(shí)微生物共培養(yǎng)存在著巨大的研究潛力,不同種屬的微生物之間共培養(yǎng)后會(huì)產(chǎn)生迥然不同的作用[1]。目前對(duì)于共培養(yǎng)的研究大多都是從協(xié)同代謝出發(fā)的,很少有人涉足群體感應(yīng)對(duì)共培養(yǎng)體系調(diào)控作用的研究,直到最近才有人開始關(guān)注群體感應(yīng)在共培養(yǎng)中的作用。共培養(yǎng)(Co-culture)是指在無菌條件下,一些特別指定的不同的微生物在厭氧或好養(yǎng)條件下的混合培養(yǎng)[2]。群體感應(yīng)(Quorum-sensing,QS)系統(tǒng)是細(xì)菌間利用信號(hào)分子進(jìn)行交流的一種方式,即當(dāng)細(xì)菌的菌體數(shù)量達(dá)到一定密度時(shí)細(xì)菌會(huì)發(fā)生感應(yīng)現(xiàn)象進(jìn)而調(diào)控性狀表達(dá)[3]。一般來講,群體感應(yīng)對(duì)單個(gè)細(xì)菌菌體是沒有意義的,而對(duì)大量的細(xì)菌菌體來說是非常重要的,真核生物或是原核生物都具有群體感應(yīng)現(xiàn)象。食品處于復(fù)雜的微生物體系中,多種微生物在同一環(huán)境中會(huì)產(chǎn)生不同的作用,因此僅僅研究群體感應(yīng)對(duì)微生物純培養(yǎng)的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠,對(duì)于共培養(yǎng)體系中群體感應(yīng)調(diào)控作用的研究迫在眉睫。因此本論文主要針對(duì)微生物共培養(yǎng)系統(tǒng)中的群體感應(yīng)現(xiàn)象做出論述,旨在為微生物共培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展及共培養(yǎng)系統(tǒng)中群體感應(yīng)調(diào)控作用的研究提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 微生物共培養(yǎng)

1.1 共培養(yǎng)的簡介

人們對(duì)于微生物的利用是一個(gè)逐步發(fā)展的階段,最初只是天然的混合培養(yǎng)(Mixed-culture),比如傳統(tǒng)發(fā)酵食品如乳制品、豆制品、肉制品的制作以及食醋、黃酒等的釀造均是利用了發(fā)酵體系中多種微生物之間的代謝作用。在18世紀(jì)末期純培養(yǎng)(Pure culture)技術(shù)開始發(fā)展,同時(shí)極大的促進(jìn)了醫(yī)學(xué)、生命科學(xué)和工農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域的發(fā)展。在1925年Sack[4]首次報(bào)道了關(guān)于微生物共培養(yǎng)的研究,指出亞消化單胞菌(Nitrosomonassp.)和生絲微菌(Hyphomicroblumsp.)在硅膠培養(yǎng)基中共培養(yǎng)時(shí)組合關(guān)系不同則形成不同的產(chǎn)物。最近幾十年人們又逐漸認(rèn)識(shí)到多種不同種屬的微生物共培養(yǎng)能夠產(chǎn)生特有的新物質(zhì)或者提高產(chǎn)量[5-7]。共培養(yǎng)微生物之間有著較為復(fù)雜的生態(tài)學(xué)關(guān)系,其中涉及協(xié)同代謝、互利共生、相互拮抗、細(xì)菌素、信號(hào)分子之間的相互作用等,這些作用在一定程度上都影響著共培養(yǎng)體系中物質(zhì)的產(chǎn)量和新物質(zhì)的產(chǎn)生。

1.2 共培養(yǎng)的方式及特點(diǎn)

微生物的共培養(yǎng)方式主要分為直接共培養(yǎng)、共固定化細(xì)胞混菌培養(yǎng)和間接共培養(yǎng)三種。直接共培養(yǎng)是指在一定的環(huán)境條件下,兩種或兩種以上細(xì)胞按照特定比例在同一體系中共同培養(yǎng)的過程。在這種培養(yǎng)方式中常伴隨著協(xié)同代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、群體感應(yīng)等多種復(fù)雜的微生態(tài)關(guān)系,共固定化細(xì)胞混菌培養(yǎng)是指采用共固定化生物技術(shù)將單個(gè)細(xì)菌制成固定化細(xì)胞后混合在一起。利用這種培養(yǎng)方式在避免了微生物直接接觸產(chǎn)生抑制作用的同時(shí)又可以發(fā)揮代謝物之間的信息傳遞。間接共培養(yǎng)是指將不同的微生物細(xì)胞置于特定的、互不接觸的載體上而在同一體系中培養(yǎng)[2]。這種共培養(yǎng)方式的優(yōu)點(diǎn)與共固定化細(xì)胞混菌培養(yǎng)相同,雖然實(shí)際應(yīng)用中這種方式?jīng)]有被廣泛采用,但是理論上它對(duì)于研究微生物代謝產(chǎn)物之間的相互作用以及揭示種間的群體感應(yīng)現(xiàn)象和信號(hào)分子的產(chǎn)生有重要意義。

1.3 共培養(yǎng)的應(yīng)用

利用共培養(yǎng)技術(shù)可以改造傳統(tǒng)的發(fā)酵工藝,使發(fā)酵周期縮短且產(chǎn)品質(zhì)量提高,如利用戊糖乳桿菌和腸膜明串珠菌共培養(yǎng)生產(chǎn)泡菜,在降低泡菜中腐敗菌數(shù)目的同時(shí)還可以改善泡菜的風(fēng)味[8]。共培養(yǎng)可以產(chǎn)生新的物質(zhì),如將枯草芽孢桿菌與放線菌共培養(yǎng)能夠產(chǎn)生純培養(yǎng)時(shí)不存在的抗腫瘤抗生素[9],顯示了共培養(yǎng)對(duì)于新抗腫瘤抗生素發(fā)現(xiàn)的重要性。共培養(yǎng)可以提高物質(zhì)產(chǎn)量,如將巨大曲霉和尖孢鐮刀菌共培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)抗真菌蛋白的產(chǎn)量明顯提高[10],這是微生物共培養(yǎng)技術(shù)的一大優(yōu)勢(shì),在當(dāng)下的研究中也備受關(guān)注。共培養(yǎng)可以降解有毒物質(zhì),這可能是源于微生物共培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生的協(xié)同作用,因此在降解有毒物時(shí)更加高效,如同時(shí)使用透明分枝桿菌與枝孢菌清除柴油時(shí)可以顯著提高清除率[11]。

2 協(xié)同代謝作用對(duì)共培養(yǎng)的調(diào)控

共培養(yǎng)微生物之間存在多種協(xié)同代謝作用,如為彼此提供營養(yǎng)物質(zhì)、對(duì)底物的競爭利用、改變體系的pH等。有報(bào)道指出細(xì)菌在純培養(yǎng)時(shí)生物活性容易降低,生物量也會(huì)減少,但是將細(xì)菌進(jìn)行混合培養(yǎng)在一定程度上可以減少或避免這一現(xiàn)象的發(fā)生[12-13]。這可能是由于細(xì)菌混合培養(yǎng)后產(chǎn)生了協(xié)同作用,細(xì)菌間的代謝增加。巨大芽孢桿菌與古龍酸菌共培養(yǎng)時(shí)能夠?yàn)楸舜颂峁I養(yǎng)物質(zhì),因而新陳代謝增強(qiáng)[14]。

Huang等[15]對(duì)分離自肉制品中的兩株糞腸球菌Enterococcusfaecium(E.faeciumB1和E.faeciumB2)與單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)進(jìn)行了共培養(yǎng)研究,E.faeciumB1中含有類細(xì)菌素物質(zhì)和腸道菌素基因,而E.faeciumB2中沒有,并且二者對(duì)L.monocytogenes都有一定的抑制作用。在共培養(yǎng)的早期E.FaeciumB1對(duì)L.monocytogenes有抑制作用,而E.faeciumB2沒有產(chǎn)生抑制作用,由此推測(cè)是E.FaeciumB1中的類細(xì)菌素物質(zhì)對(duì)L.monocytogenes的生長產(chǎn)生了抑制作用。同時(shí)測(cè)定了培養(yǎng)液中的pH發(fā)現(xiàn),共培養(yǎng)的pH低于單一純培養(yǎng)的pH,表明共培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生的酸性物質(zhì)抑制了L.monocytogenes的生長。對(duì)于沒有產(chǎn)細(xì)菌素基因的E.FaeciumB2來說,它對(duì)L.monocytogenes的抑制作用可能是由于細(xì)胞與細(xì)胞之間對(duì)于營養(yǎng)物質(zhì)的競爭作用。例如Nilsson等[16]已經(jīng)證實(shí),不產(chǎn)細(xì)菌素基因的棲魚肉桿菌會(huì)因?yàn)楦偁幤咸烟嵌鴮?duì)李斯特菌產(chǎn)生抑制作用。

Mellefont等[17]對(duì)單増李斯特菌(L.monocytogenesScott A)與大腸埃希式菌(E.coliM23)、熒光假單胞菌(P.fluorescens44)、乳酸桿菌(L.plantarumALC 01)分別進(jìn)行共培養(yǎng)的研究中發(fā)現(xiàn),混合體系中的協(xié)同增長的作用差異與混合培養(yǎng)濃度比例有一定關(guān)系,當(dāng)混合濃度相當(dāng)時(shí),協(xié)同增長作用最顯著;當(dāng)共培養(yǎng)L.monocytogenesScott A初始濃度較低時(shí),它的生長會(huì)受到其它細(xì)菌的抑制;相反,當(dāng)L.monocytogenesScott A初始濃度比P.fluorescens44和L.plantarumALC 01高時(shí),P.fluorescens44和L.plantarumALC 01的生長都會(huì)受到抑制,但是E.coliM23的生長不受影響,共培養(yǎng)體系的pH也會(huì)發(fā)生相應(yīng)變化。推測(cè)原因可能是共培養(yǎng)時(shí)某一個(gè)細(xì)菌分泌了對(duì)其它細(xì)菌生長不利的抑制因子,也可能是由于對(duì)培養(yǎng)體系中底物的利用能力不同產(chǎn)生的生長差異。此外肉湯培養(yǎng)的溫度不同也會(huì)影響共培養(yǎng)中單增李斯特菌與植物乳桿菌的競爭作用[18]。除此之外,Geng等[19]也曾報(bào)道過將硝化細(xì)菌和反硝化細(xì)菌進(jìn)行混合培養(yǎng)能夠加速硝化反應(yīng)的進(jìn)程還能穩(wěn)定系統(tǒng)中的pH。

對(duì)于微生物共培養(yǎng)的研究大多都是從協(xié)同代謝角度出發(fā)的,從群體感應(yīng)角度研究的較少,然而群體感應(yīng)在微生物共培養(yǎng)中扮演著重要角色。

3 群體感應(yīng)系統(tǒng)

3.1 細(xì)菌群體感應(yīng)

細(xì)菌的群體感應(yīng)依賴細(xì)菌的數(shù)量達(dá)到一定密度才能發(fā)生,細(xì)菌可以通過產(chǎn)生、釋放、檢測(cè)以及對(duì)信號(hào)分子做出相應(yīng)的反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)菌體之間的交流,這些信號(hào)分子又稱“自誘導(dǎo)物(Autoinducer,AI)”。人們最早是在20世紀(jì)70年代從海洋費(fèi)式弧菌(Vibriofisheri)中發(fā)現(xiàn)了群體感應(yīng)現(xiàn)象的存在[20],費(fèi)式弧菌能夠調(diào)控發(fā)光,而群體感應(yīng)可以調(diào)控發(fā)光的強(qiáng)度[21],并且這種發(fā)光現(xiàn)象與菌體數(shù)量有關(guān),當(dāng)費(fèi)式弧菌菌體濃度增加時(shí),AHLs信號(hào)分子的濃度也會(huì)相應(yīng)升高,當(dāng)達(dá)到一定閾值后就會(huì)與受體蛋白結(jié)合,使受體蛋白的構(gòu)象發(fā)生相應(yīng)變化,靶基因被激活[22]。鑒于群體感應(yīng)現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn),科學(xué)家的注意力從研究單個(gè)細(xì)胞的行為轉(zhuǎn)移到多細(xì)胞行為的研究上,并且人們發(fā)現(xiàn)QS與果蔬的腐爛、水產(chǎn)品的腐敗、牛奶及奶制品的腐敗等密切相關(guān),QS現(xiàn)已經(jīng)廣泛應(yīng)用到醫(yī)藥、生物防治、食品質(zhì)量安全和水產(chǎn)品腐敗控制等方面。介導(dǎo)微生物群體感應(yīng)的信號(hào)分子有多種,而不同種類的細(xì)菌在調(diào)控QS系統(tǒng)的基因表達(dá)時(shí)利用的信號(hào)分子結(jié)構(gòu)不同。

3.2 群體感應(yīng)系統(tǒng)的分類

常見的QS系統(tǒng)主要分為以下4類:

革蘭氏陰性菌中的群體感應(yīng)系統(tǒng)(AI-1):革蘭氏陰性細(xì)菌的群體感應(yīng)系統(tǒng),主要分泌的是N-酰基-高絲氨酸內(nèi)酯(N-3-acyl-homoserine lactones,AHLs)類物質(zhì),也叫做AI-1,它是由一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的高絲氨酸內(nèi)酯環(huán)和一條長度包含4至18個(gè)碳的?；鶄?cè)鏈組成,其?；鶄?cè)鏈上可能形成雙鍵或第三個(gè)碳上容易被羥基或氧取代,這些可變性決定了AHLs的特異性[23]。目前已在許多細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)類似費(fèi)式弧菌LuxI/LuxR系統(tǒng)的群體感應(yīng)系統(tǒng),如根癌農(nóng)桿菌的TraI/TraR系統(tǒng),銅綠假單胞菌的LasI/LasR系統(tǒng)和Rh1I/Rh1R系統(tǒng)等[24]。

革蘭氏陽性菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)(AIP):革蘭氏陽性菌的信號(hào)分子為寡肽(auto-inducing polypeptides,AIPs)類物質(zhì),它與AI-1結(jié)構(gòu)不同,是經(jīng)過加工或修飾的自身分泌的前導(dǎo)肽。AIPs有直鏈的也有環(huán)狀的,含有5～26個(gè)氨基酸殘基[25-26]。AIPs不能自由出入細(xì)胞,要經(jīng)過細(xì)胞壁需在ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的協(xié)同作用下才能達(dá)成[27]。

細(xì)菌種屬間的群體感應(yīng)系統(tǒng)(AI-2):除了以上兩類信號(hào)分子之外,細(xì)菌用于種間交流的是另外一類信號(hào)分子AI-2(autoinducer-2),細(xì)菌通過感受環(huán)境中AI-2的濃度從而了解環(huán)境中自身和其他細(xì)菌的數(shù)量,以此來調(diào)控自身的表型表達(dá)。AI-2類信號(hào)分子是由LuxS蛋白質(zhì)催化合成的呋喃硼酸二酯(Furanosyl borate diester)[28]。

細(xì)菌的其他群體感應(yīng)機(jī)制:在一些腸道共生細(xì)菌、腸致病性大腸桿菌等革蘭氏陰性菌中發(fā)現(xiàn)了AI-3型群體感應(yīng)系統(tǒng),但是其作用機(jī)制尚不明確,推測(cè)結(jié)構(gòu)可能和腎上腺素/去甲腎上腺素相似,且E.coli中AI-3分子的合成并不依賴于LuxS蛋白[29];在銅綠假單胞菌中還發(fā)現(xiàn)了2-庚基-3-羥基-4-喹諾酮(2-heptyl-3-hydroxyl-4-quinolone)類信號(hào)分子,其次級(jí)代謝產(chǎn)物可以調(diào)控假單胞菌毒性基因的表達(dá);在弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii)等細(xì)菌的培養(yǎng)上清液中發(fā)現(xiàn)了二酮哌嗪類化合物DKP(diketopiperazine),也是AI信號(hào)分子的一種,這類信號(hào)分子對(duì)細(xì)菌種內(nèi)及種間的群體感應(yīng)都起著重要的調(diào)控作用[30]。

4 群體感應(yīng)對(duì)共培養(yǎng)的調(diào)控作用

群體感應(yīng)調(diào)控著細(xì)菌共培養(yǎng)的多個(gè)方面,比如生物被膜的形成、信號(hào)分子的產(chǎn)生、毒力因子的產(chǎn)生、細(xì)菌素的合成、胞外蛋白酶的分泌等。

4.1 對(duì)生物被膜的調(diào)控作用

生物被膜是指微生物為了適應(yīng)環(huán)境而粘附于惰性或活性實(shí)體的表面,繁殖、分化并分泌一些多糖基質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸等,將菌體群落包裹其中而形成的細(xì)菌聚集體膜狀物[31]。被膜的形成是一個(gè)多級(jí)過程,包括細(xì)菌表面的粘附,細(xì)胞間集聚和繁殖,多聚基質(zhì)的產(chǎn)生、生長、成熟,最終被膜分散或降解。QS的調(diào)控涉及被膜形成的所有階段,它通過調(diào)節(jié)細(xì)菌的種群密度和成熟被膜內(nèi)的新陳代謝來適應(yīng)營養(yǎng)需求[32]。生物被膜普遍存在于食品表面和食品的加工車間中,清除困難且容易導(dǎo)致食品的二次污染。在生物被膜的保護(hù)下,細(xì)菌應(yīng)對(duì)抗生素、環(huán)境壓力以及來自外界的攻擊防御能力都會(huì)增強(qiáng)。因此抑制生物被膜的形成在一定程度上可以延長食物保質(zhì)期。有關(guān)生物被膜的最早報(bào)道是Costerton等[33]對(duì)于牙斑菌的生物被膜的研究,近年來有大量研究表明,許多菌種生物被膜的形成都受到群體感應(yīng)系統(tǒng)的調(diào)控。Brackman等[34]研究了伯霍爾德桿菌屬(Burkholderia)生物被膜的形成,發(fā)現(xiàn)其受群體感應(yīng)系統(tǒng)的調(diào)控,并且肉桂醛和白藜蘆醇有抑制生物被膜粘附的能力。群體感應(yīng)對(duì)生物被膜的調(diào)控作用不僅僅局限于單個(gè)細(xì)菌的純培養(yǎng)中,對(duì)于不同種屬細(xì)菌的共培養(yǎng)體系也會(huì)有一定的影響。楊安林[35]曾提到,加入細(xì)菌培養(yǎng)上清液后大腸桿菌生物被膜OD630的值比單獨(dú)培養(yǎng)大腸桿菌有所增加,尤其是金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的上清液能夠明顯增強(qiáng)大腸桿菌生物被膜的形成能力,并且加入量、OD值與生物被膜形成能力之間呈現(xiàn)一定的濃度依賴性;加入銅綠假單胞菌和單増李斯特菌后OD630值增幅不明顯。這表明不同種屬細(xì)菌進(jìn)行共培養(yǎng)時(shí)體系的生物被膜形成能力存在差異性,充分了解復(fù)雜的共培養(yǎng)體系中生物被膜的形成規(guī)律,找到有效抑制生物被膜形成的方法,有利于控制由于生物被膜粘附而導(dǎo)致的食品污染與腐敗現(xiàn)象。

4.2 對(duì)信號(hào)分子的調(diào)控作用

朱晶等[36]對(duì)多株乳酸菌、腸毒素大腸桿菌(EnterotoxigenicEscherichiacoli,ETEC)和豬小腸上皮細(xì)胞系IPEC-J2共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),乳酸菌能夠使ETEC對(duì)IPEC-J2的毒力作用顯著降低,其中乳酸菌S8能夠明顯促進(jìn)ETEC的AI-2分泌。這表明乳酸菌可能通過向環(huán)境中分泌某種物質(zhì)來影響ETEC LuxS系統(tǒng)AI-2的產(chǎn)生,使ETEC的毒力基因無法正常表達(dá)。郭倩茹等[37]對(duì)分離自酸馬奶酒中的9株乳酸菌、8株酵母菌進(jìn)行兩次共生篩選后得出了三對(duì)典型的共生組合,酵母菌YSTT2代謝產(chǎn)物均能促進(jìn)LAB4、LAB7、LAB9這3株乳酸菌產(chǎn)生AI-2,共培養(yǎng)YST2與LAB4、YST2與LAB9極顯著的促進(jìn)了乳酸菌AI-2的產(chǎn)生。Di等[38]將酵母乳桿菌LactobacillusplantarumDC400與其他乳酸桿菌共培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)DC400的LuxS基因調(diào)控的AI-2的產(chǎn)生會(huì)受影響。以上研究表明,微生物共培養(yǎng)會(huì)影響信號(hào)分子AI-2的產(chǎn)生。由于共培養(yǎng)體系可能同時(shí)受到多種信號(hào)分子的調(diào)控,因此僅僅研究共培養(yǎng)液中AI-2的變化還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠,對(duì)于添加外源AI-2后是否也會(huì)產(chǎn)生類似的趨勢(shì)還有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。

4.3 對(duì)毒力因子產(chǎn)生的調(diào)控作用

毒力因子可以幫助病原體侵入宿主,并且對(duì)于宿主的自我防御功能有相應(yīng)的抵抗機(jī)制,從而使病原體更具致病危害性。研究表明,一些QS系統(tǒng)參與了毒力因子的產(chǎn)生和運(yùn)輸過程。如葡萄球菌毒力因子的產(chǎn)生會(huì)受到QS的調(diào)控[39]。在創(chuàng)傷弧菌中,溶血素基因vvhA和蛋白酶基因vvpE在其QS系統(tǒng)中起重要作用[40]。何夙旭等[41]曾報(bào)道,嗜水氣單胞菌NJ-1與芽孢桿菌R1共培養(yǎng)時(shí),僅能檢測(cè)出少量的AHLs信號(hào)分子,毒力因子相關(guān)基因表達(dá)量均顯著下調(diào);LuxR表達(dá)受到抑制,LuxS在36h表達(dá)量明顯增多,不影響QseB的正常表達(dá),并且指出R1抑制NJ-1毒力因子相關(guān)基因表達(dá)的原因可能是R1對(duì)NJ-1的多種QS系統(tǒng)都有調(diào)控作用。已有研究表明,某些物質(zhì)對(duì)毒力因子的產(chǎn)生有一定的抑制作用,如大蒜提取物[42]和梔子苷[43]可以通過QS系統(tǒng)抑制銅綠假單胞菌的毒力因子表達(dá),降低其致病性。是否存在某種物質(zhì)能夠同時(shí)調(diào)控共培養(yǎng)體系中多種細(xì)菌的毒力因子的產(chǎn)生,還有待于進(jìn)一步的研究。

4.4 對(duì)細(xì)菌素產(chǎn)生的調(diào)控作用

細(xì)菌素是細(xì)菌為了適應(yīng)不利的生長條件或者環(huán)境變化而產(chǎn)生的一類具有生物活性的蛋白質(zhì)、多肽,當(dāng)這些物質(zhì)積累到一定的數(shù)量后對(duì)同一生長體系中的其他微生物會(huì)產(chǎn)生抑制作用[44]。細(xì)菌素合成對(duì)條件依賴性很大,如溫度、pH、應(yīng)激、離子強(qiáng)度等都會(huì)影響細(xì)菌素產(chǎn)生量。當(dāng)前研究已證明在乳酸乳球菌、糞腸球菌、植物乳桿菌等中存在著調(diào)控細(xì)菌素合成的QS機(jī)制[45]。更有研究表明在進(jìn)行共培養(yǎng)時(shí),其他種屬的細(xì)菌會(huì)利用QS來調(diào)控細(xì)菌素的產(chǎn)生菌來合成細(xì)菌素。如與特定的革蘭氏陽性菌共培養(yǎng)可誘導(dǎo)植物乳桿菌細(xì)菌素的合成[46-47]。LactobacillusplantarumJ23與LactobacillusplantarumNC8具有相同的群體感應(yīng)雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)[48],當(dāng)LactobacillusplantarumNC8與特定的革蘭氏陽性菌共培養(yǎng)時(shí),可促進(jìn)細(xì)菌素的合成和提高自體誘導(dǎo)物的活性,這對(duì)于維持細(xì)菌素的合成有很大幫助[49-50]。在液體培養(yǎng)基中對(duì)LactobacillusplantarumNC8進(jìn)行純培養(yǎng)時(shí)是無法合成細(xì)菌素的,但當(dāng)與LactococcuslactisMG1363共培養(yǎng)時(shí),細(xì)菌素合成量大大增加[51-52]。在共培養(yǎng)體系中,芽孢桿菌會(huì)在與其親緣關(guān)系較近的其他微生物的作用下產(chǎn)生大量細(xì)菌素,這種作用與種間群體感應(yīng)密不可分[53]。由于細(xì)菌素可以作為發(fā)酵劑的發(fā)酵副產(chǎn)物存在于奶制品中,而植物乳桿菌作為誘導(dǎo)菌對(duì)乳酸菌產(chǎn)細(xì)菌素具有一定的調(diào)控作用,并且此調(diào)控作用與QS有很大關(guān)聯(lián)。因此研究群體感應(yīng)對(duì)于共培養(yǎng)體系中細(xì)菌素的合成具有很大的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

4.5 對(duì)分泌蛋白酶的調(diào)控作用

具有蛋白水解酶的細(xì)菌可以水解食品腐敗過程中產(chǎn)生的蛋白質(zhì),產(chǎn)生一些小分子物質(zhì)為自身提供營養(yǎng)同時(shí)也會(huì)被處于同一環(huán)境中的其他微生物所利用[54],產(chǎn)蛋白酶豐富的細(xì)菌則會(huì)成為食品腐敗過程中的優(yōu)勢(shì)腐敗菌。因此研究多種細(xì)菌的生長體系中蛋白酶的變化有助于掌握食品的腐敗機(jī)制。相關(guān)研究表明,群體感應(yīng)AHLs能夠調(diào)控銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和鰻弧菌(Vibrioanguillarum)蛋白水解酶的基因表達(dá)[55-56]。劉敏等[57]將芽孢桿菌與嗜熱鏈球菌共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),芽孢桿菌會(huì)促進(jìn)嗜熱鏈球菌的生長,且芽孢桿菌分泌的蛋白酶會(huì)水解乳中蛋白質(zhì)產(chǎn)生寡肽和氨基酸等物質(zhì),正是這些物質(zhì)促進(jìn)了嗜熱鏈球菌的生長。黃艷等[58]將輔助菌與橙色粘球菌共培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)輔助菌有助于粘細(xì)菌產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物,而產(chǎn)生這種狀況的原因可能是由于共培養(yǎng)的微生物在生長過程中各自產(chǎn)生的酶類之間有相互協(xié)同的作用。本實(shí)驗(yàn)室利用從腐敗大菱鲆中分離到的兩株熒光假單胞菌(PF-04)和嗜水氣單胞菌(AH-01)進(jìn)行共培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn),共培養(yǎng)液產(chǎn)胞外蛋白酶的能力均好于這兩株菌的純培養(yǎng)液,說明共培養(yǎng)后兩株菌產(chǎn)生了協(xié)同作用,當(dāng)改變兩株菌共培養(yǎng)的初始濃度時(shí)會(huì)產(chǎn)生不同的共生效果。由于PF-04為大菱鲆的優(yōu)勢(shì)腐敗菌,而AH-01為非優(yōu)勢(shì)腐敗菌,故本實(shí)驗(yàn)將這兩株菌進(jìn)行共培養(yǎng),目的在于研究共培養(yǎng)體系中非優(yōu)勢(shì)腐敗菌對(duì)優(yōu)勢(shì)腐敗菌分泌蛋白酶能力的調(diào)控作用,進(jìn)而為延緩食品腐敗提供理論依據(jù)。

綜上所述,群體感應(yīng)在微生物共培養(yǎng)體系的多個(gè)方面都有調(diào)控作用,如生物被膜的形成、信號(hào)分子的產(chǎn)生、毒力因子的產(chǎn)生、細(xì)菌素的合成、蛋白酶的分泌等,且不同種屬的細(xì)菌之間共培養(yǎng)體系的變化不同。

5 共培養(yǎng)存在的問題與展望

信號(hào)分子決定了共培養(yǎng)微生物之間的不同生態(tài)行為,充分利用共培養(yǎng)技術(shù)可以幫助人類發(fā)現(xiàn)更多新的種間信號(hào)分子。對(duì)于共培養(yǎng)中群體感應(yīng)現(xiàn)象的研究可以結(jié)合代謝組學(xué)、基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)。雖然科學(xué)家已經(jīng)對(duì)部分菌株共培養(yǎng)體系中的QS機(jī)制有了初步的認(rèn)識(shí)與研究,但是到目前為止還有許多問題亟待解決。比如共培養(yǎng)體系中目標(biāo)菌通過什么方式感知環(huán)境中其他菌株產(chǎn)生的信號(hào)分子？如何激發(fā)自身及其他菌株的誘導(dǎo)機(jī)制？具體是哪一類信號(hào)分子產(chǎn)生的作用等。

現(xiàn)在大多數(shù)研究只限于兩種不同種屬的細(xì)菌之間,對(duì)于三種或三種以上種屬的細(xì)菌同時(shí)進(jìn)行共培養(yǎng)的研究還未曾見報(bào)道,未來要致力于群體感應(yīng)在三種以上細(xì)菌的培養(yǎng)體系的研究;對(duì)于共培養(yǎng)體系中群體感應(yīng)調(diào)控的其他因子如群集泳動(dòng)、嗜鐵素的產(chǎn)生以及質(zhì)粒的結(jié)合轉(zhuǎn)移等也有待于探索;且目前對(duì)于共培養(yǎng)體系的設(shè)立大多是利于細(xì)菌生長的環(huán)境條件,對(duì)于極限條件下(環(huán)境脅迫)對(duì)共培養(yǎng)體系中群體感應(yīng)的變化值得研究;在共培養(yǎng)的不同階段檢測(cè)體系中產(chǎn)生的信號(hào)分子種類及各類型信號(hào)分子的含量變化,有助于了解共培養(yǎng)時(shí)期信號(hào)分子等相關(guān)指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律。

綜上所述,我們要對(duì)微生物的共培養(yǎng)進(jìn)行多角度、多層次、全方位的研究,為進(jìn)一步了解共培養(yǎng)機(jī)理及群體感應(yīng)在共培養(yǎng)中的作用提供理論基礎(chǔ)。

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Research progress of quorum sensing phenomenon in microorganisms co-culture system

LI Jian-rong1,GUO Jing-wen1,LI Ting-ting2,3,*

(1.Liaoning Provincal Key Laboratory of Food Safety,Food Science Research Institute,Bohai University,Jinzhou 121013,China; 2.College of Life Science,Dalian Nationality of University,Dalian 116600,China; 3.College of Food Science,Southwest University,Chongqing 400715,China)

The method,classification,development,application of microbial co-culture were introduced,and the effects of co-culture of different species were summarized.Microbial co-culture system was regulated not only by the collaborative metabolism,but also by quorum sensing in microbial cultures. Compared with the pure culture,biofilm formation,signaling molecules,virulence factors of production,bacteriocin synthesis and secretion of extracellular protease of co-culture system were different. The research of action mechanism of quorum sensing would improve further development and application of cultivation technology.

microorganisms;co-culture;quorum sensing;synergy metabolism

2016-06-24

勵(lì)建榮(1964-)，男，博士，教授，主要從事水產(chǎn)品和果蔬貯藏加工，食品安全方面的研究，E-mail：lijr6491@163.com。

*通訊作者:李婷婷(1978-)，女，博士，副教授，主要從事水產(chǎn)品貯藏加工及質(zhì)量安全方面的研究，E-mail：tingting780612@163.com。

國家自然科學(xué)基金(31301572，31301418)；中國博士后科學(xué)基金(2014M552302)。

TS201.1

A

1002-0306(2016)23-0377-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.23.062