結(jié)腸癌組織C/EBPα表達(dá)及其對SW480細(xì)胞侵襲的影響

目的 研究結(jié)腸癌組織CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白－α（C/EBPα）的表達(dá)，及其過表達(dá)對結(jié)腸癌SW480細(xì)胞系侵襲性的影響。方法利用免疫組化方法檢測48例結(jié)腸癌患者的癌組織與正常組織C/EBPα表達(dá)情況，并統(tǒng)計分析C/EBPα的表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。構(gòu)建pCDGFP－C/ EBPα真核表達(dá)質(zhì)粒，通過細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察轉(zhuǎn)染對結(jié)腸癌SW480細(xì)胞系遷移能力的影響，并檢測與腫瘤侵襲相關(guān)蛋白KLF5、MMP－2、MMP－9、ECD的的表達(dá)。結(jié)果免疫組化結(jié)果顯示，正常組織C/ EBPα的低表達(dá)率為6．25%，而結(jié)腸癌組織C/EBPα的低表達(dá)率為68．75%，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05），且低表達(dá)C/EBPα的患者腫瘤直徑越大、TMN分期越晚、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移概率越大。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，劃痕48h、72h后，正常SW480細(xì)胞的遷移率分別為53．16%、80．77%，而過表達(dá)C/EBPα 的SW480細(xì)胞的遷移率分別為23．57%、31．89%，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）；免疫印記實(shí)驗(yàn)表明，過表達(dá)C/EBPα的SW480細(xì)胞的KLF5、MMP－2、MMP－9表達(dá)明顯降低，而ECD表達(dá)明顯升高。結(jié)論C/EBPα在結(jié)腸癌組織低表達(dá)，且與結(jié)腸癌的TMN分期和轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系，C/EBPα過表達(dá)能夠顯著降低結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲性，對今后結(jié)腸癌的早期診斷和基因靶向治療有重要指導(dǎo)意義。

結(jié)腸癌；C/EBPα；過表達(dá)；侵襲

結(jié)腸癌的發(fā)病率和病死率在全球惡性腫瘤中位居第三位[1－2]，且有逐年上升和年輕化的趨勢[3－4]。結(jié)腸癌發(fā)病初期非常隱蔽，通常確診時癌癥已經(jīng)發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移，影響臨床治療效果。所以，尋找結(jié)腸癌特異性生物分子標(biāo)記物，抑制腫瘤侵襲，對其早期診斷和基因靶向治療有著至關(guān)重要的意義。CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白－α（C/EBPα）廣泛存在于人體的正常組織中[5]，而且高表達(dá)于肝臟、肺、脂肪組織及胎盤等組織中[6－7]。C/EBPα作為一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，不但在抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞分化方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[8－9]，在抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移方面也有顯著作用[10]，因此其具有典型的抑癌基因特性。本文通過我院48例結(jié)腸癌患者的病理標(biāo)本，觀察C/ EBPα在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)情況，及其表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系；同時研究C/EBPα過表達(dá)對結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480侵襲性的影響，為尋找結(jié)腸癌新的分子標(biāo)志物和基因靶向治療提供重要依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 對 象 研究對象來源于我院腫瘤科2013年9月—2014年12月期間收治的48例結(jié)腸癌患者，其中男30例，女18例；年齡26～72歲，平均53．1歲；腫瘤直徑≤5cm 22例，腫瘤直徑＞5cm 26例；T1+ T2期 22例，T3+T4期 26例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移21例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移27例?；颊呔_診為結(jié)腸癌，手術(shù)前均未接受放化療治療。取患者癌組織和癌旁正常組織（距癌組織邊緣＞5cm）制成石蠟標(biāo)本。

1.2 方 法

1.2.1 免疫組化 將蠟塊進(jìn)行切片、烤片（60℃，1h）、脫蠟（二甲苯+梯度乙醇）、復(fù)水（自來水+雙氧水）、清洗（雙氧水+蒸餾水）、微波修復(fù)（枸櫞酸緩沖液）、清洗（PBS）、封閉（5%BSA，20min）、一抗孵育（37℃，1h或4℃過夜）、二抗孵育（37℃，0．5h）、SABC （37℃，0．5h）、DAB顯色、蘇木素復(fù)染、分化（鹽酸+乙醇）、反藍(lán)（氨水）、脫水（梯度乙醇+二甲苯）、樹膠封片、鏡檢。結(jié)果評定標(biāo)準(zhǔn)：C/EBPα陽性表達(dá)為細(xì)胞膜和（或）細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的淡黃色至棕黃色顆粒色。顯微鏡下隨機(jī)選取5個高倍視野，計算視野中陽性腫瘤細(xì)胞的平均百分率。利用染色指數(shù)（SI）來表示染色結(jié)果，腫瘤細(xì)胞陽性率評分標(biāo)準(zhǔn)如下：4分：陽性率＞70%；3分：陽性率35%～70%；2分：陽性率10%～35%；1分：陽性率＜10%；0分：陽性率為0。染色強(qiáng)度評分標(biāo)準(zhǔn)如下：3分：棕色，強(qiáng)染色；2分：棕黃色，中度染色；1分：淡黃色，弱染色；0分：未見染色。SI為兩者的乘積，0表示未表達(dá)C/EBPα；0＜SI≤4表示C/EBPα低表達(dá)；SI≥6表示C/EBPα高表達(dá)。

1.2.2 質(zhì)粒構(gòu)建 構(gòu)建pCDGFP－C/EBPα真核表達(dá)質(zhì)粒，引物為：F－CGCGGATCCGCGAGCCACCATGGAGTCGGCCGACT；R－CCGGAATTCCGGCGCGCAG TTGCCCATG，首先利用PrimeSTAR聚合酶、通過PCR技術(shù)從含有人C/EBPα的cDNA文庫中擴(kuò)增出C/EBPα的編碼序列，并對PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳并膠回收純化，對純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切（BamHI和EcoRI），同時對pCDGFP載體也進(jìn)行相同的雙酶切；然后利用T4連接酶對雙酶切后的PCR產(chǎn)物和載體進(jìn)行連接（16℃，12h），并利用大腸桿菌感受態(tài)（TG1）對連接后的產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，倒置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直到出現(xiàn)克隆（約10h）；然后用滅菌牙簽挑取若干單克隆置于LB（氨芐抗性）培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)（37℃，250rpm），直到菌液變渾（約10h）；然后收集適量菌液，利用堿裂解法進(jìn)行質(zhì)粒抽提，并對抽提的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定（BamH I和EcoR I）；最后選取鑒定正確的一管質(zhì)粒進(jìn)行DNA測序。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng) 人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480購于百恩維生物科技有限公司，并長期保存于液氮中，實(shí)驗(yàn)前對細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，并用含有5%胎牛血清、10% FBS、青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)（37℃，5% CO2），每日定時觀察細(xì)胞狀態(tài)，及時更換培養(yǎng)液，待細(xì)胞的融合度達(dá)到90%以上時，對細(xì)胞進(jìn)行傳代，并以適當(dāng)密度重新進(jìn)行接種，取對數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)完成后，凍存細(xì)胞。

1.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 實(shí)驗(yàn)采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，首先準(zhǔn)備對數(shù)期 SW480細(xì)胞和濃度約為 500ng/μL的pCDGFP－C/EBPα質(zhì)粒，然后取適量轉(zhuǎn)染液（Opti－MEM）分別稀釋lip2000（15μL）和質(zhì)粒（5μg），靜置5min后，將它們溫和混勻，再靜置20min，將混合液輕輕加入細(xì)胞中，培養(yǎng)4～6h后，更換完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24～72h，每隔24h換液1次。

1.2.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 分別對轉(zhuǎn)染了pCDGFP－C/ EBPα及未轉(zhuǎn)染的SW480細(xì)胞進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)，在轉(zhuǎn)染6h換液后，用槍頭垂直在細(xì)胞面劃直線，并用PBS清洗2～3次，洗去劃下的細(xì)胞，然后繼續(xù)培養(yǎng)，定期換液，并在0、24、48、72h 4個時間點(diǎn)觀察細(xì)胞的遷移運(yùn)動情況，每個視野下選取10個觀測點(diǎn)，準(zhǔn)確記錄遷移起點(diǎn)到最遠(yuǎn)點(diǎn)的細(xì)胞間距，求平均間距，并通過以下公式計算各組細(xì)胞不同時間點(diǎn)的遷移率：遷移率=（劃痕初始寬度值－各時間點(diǎn)劃痕寬度值）/劃痕初始寬度值×100%。

1.2.6 Western blot分析 轉(zhuǎn)染48h后取出SW480細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS清洗2～3次，胰酶消化，低速離心收集細(xì)胞，加入適量的細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞，4℃混勻30min，低溫高速離心收集上清，取適量加入等量的SDS上樣緩沖液（2×），沸水浴10min后置冰水中冷卻；取適量樣品上樣，SDS－PAGE電泳（100V，2h），恒壓濕轉(zhuǎn)（100V，1h）；5%的脫脂奶粉或BSA溶液封閉1－2h；KLF5/MMP－2/MMP－9/ECD兔多克隆抗體（1︰500）4℃孵育過夜或室溫孵育2h，TBST溶液洗膜3次；HRP山羊抗兔IgG二抗（1︰10000）室溫孵育1h，TBST溶液洗膜；暗室中進(jìn)行顯影。比較轉(zhuǎn)染了C/EBPα之后，KLF5/MMP－2/MMP－9/ECD表達(dá)的變化。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS軟件對統(tǒng)計數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s） 表示，組間對比采用配對t檢驗(yàn)，計數(shù)資料采用比例表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)。P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 C/EBPα在結(jié)腸癌與正常癌旁組織的表達(dá) 對48例患者的結(jié)腸癌病理組織與正常組織進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)，利用染色指數(shù)評定C/EBPα的表達(dá)情況。48份正常組織，僅有3份顯示C/EBPα未表達(dá)或低表達(dá)，其余45份顯示C/EBPα高表達(dá)，低表達(dá)率為6．25%；48份結(jié)腸癌病理組織，有33份顯示C/EBPα的未表達(dá)或低表達(dá)，其余15例顯示C/EBPα高表達(dá)，低表達(dá)率達(dá)68．75%。與正常組織相比，結(jié)腸癌組織中C/EBPα的表達(dá)量明顯降低（P＜0．05）。

2.2 C/EBPα表達(dá)和結(jié)腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系48例結(jié)腸癌中，C/EBPα的表達(dá)與結(jié)腸癌患者的性別、年齡等臨床病理參數(shù)無關(guān)，但和結(jié)腸癌的腫瘤直徑、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系（P＜0．05），見表1。

2.3 pCDGFP－C/EBPα質(zhì)粒的酶切鑒定 對重組質(zhì)粒pCDGFP－C/EBPα進(jìn)行BamH I、EcoR I雙酶切，第2泳道的重組質(zhì)粒pCDGFP－C/EBPα酶切后得到兩條亮帶，通過與pCDGFP酶切產(chǎn)物、C/EBPα的PCR產(chǎn)物以及Marker的橫向?qū)Ρ缺砻?，一條亮帶是載體pCDGFP（6100bp），另一條亮帶是目的片段C/ EBPα（1077bp），表明該質(zhì)粒成功連接。后續(xù)的測序結(jié)果也表明連接正確。酶切鑒定的結(jié)果見圖1。

表1 結(jié)腸癌C/EBPα表達(dá)和結(jié)腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系[（例）%]

圖1 重組質(zhì)粒pCDGFP-C/EBPα的雙酶切鑒定

2.4 過表達(dá)C/EBPα對結(jié)腸癌SW480細(xì)胞遷移力的影響 細(xì)胞劃痕24h后，未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞遷移率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）；劃痕48、72h后，未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞遷移率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）。C/EBPα過表達(dá)顯著降低結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的遷移力，見表2。

表2 PCDGFP－C/EBPα轉(zhuǎn)染對結(jié)腸癌SW480細(xì)胞遷移力的影響（%±s）

表2 PCDGFP－C/EBPα轉(zhuǎn)染對結(jié)腸癌SW480細(xì)胞遷移力的影響（%±s）

注：與未轉(zhuǎn)染組比較，*P＜0．05

2.5 過表達(dá)C/EBPα對腫瘤侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 在結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中過表達(dá)C/EBPα后48h收緊細(xì)胞進(jìn)行WB實(shí)驗(yàn)，檢測與腫瘤侵襲有著密切關(guān)系蛋白（KLF5、MMP－2、MMP－9、ECD）的表達(dá)情況，抗體免疫結(jié)果顯示，與未轉(zhuǎn)染組相比，過表達(dá)C/ EBPα組的KLF5、MMP－2、MMP－9蛋白表達(dá)量明顯下降，而ECD的蛋白表達(dá)量明顯升高。結(jié)果表明，過表達(dá)C/EBPα能夠明顯降低促進(jìn)腫瘤侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)，進(jìn)而起到抑制腫瘤侵襲的作用。見圖2。

圖2 腫瘤侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)圖

3 討 論

腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移是指癌細(xì)胞離開原發(fā)灶后侵犯周圍組織并不斷增殖，最終形成新腫瘤的過程，是惡性腫瘤最為重要的生物學(xué)特性。CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白-α（C/EBPα）是C/EBP轉(zhuǎn)錄因子家族中首個被發(fā)現(xiàn)的成員[11]，該基因位于19q13.1染色體上，其編碼p42和p30兩種異構(gòu)體蛋白，由于p30缺失了氨基末端，無法抑制E2F下游靶基因的表達(dá)，也就失去了抑制細(xì)胞增殖的功能。而p42作為一個完整的轉(zhuǎn)錄因子，具有抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞分化、阻止腫瘤轉(zhuǎn)移等抑癌功能[12-13]，已在肝癌、肺癌、皮膚癌、乳腺癌等癌癥中發(fā)現(xiàn)C/EBPα表達(dá)量降低的現(xiàn)象[14-15]。

本研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌組織中C/EBPα低表達(dá)，與結(jié)腸癌的腫瘤直徑、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系，提示C/EBPα低表達(dá)可能與結(jié)腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。通過觀察C/EBPα的表達(dá)對結(jié)腸癌SW480細(xì)胞侵襲性的影響，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)C/EBPα 48h后的SW480細(xì)胞的侵襲性顯著減弱。而過表達(dá)C/EBPα之后，SW480細(xì)胞中KLF5、MMP-2、MMP-9也表達(dá)量顯著降低，ECD的表達(dá)量顯著升高。研究[16-18]報道, KLF5、MMP-2、MMP-9的過量表達(dá)，ECD的低表達(dá)都將促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲，與本文研究結(jié)果一致。綜上，C/EBPα與結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系。

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（收稿：2015-06-16 修回：2015-09-18）

Expression of C/EBPαin Colon Cancerand Its Effects on Invasion of SW480

CHEN Xuquan1,NI Yanle1,ZHOU Hongzhong2,ZHANG Zhiyong1,YE Long1． 1 Department of Surgery,the Second People's Hospital of Leqing,Leqing(325600),China;2 Department of Gastrointestinal Surgery,the First Hospital Affiliated to Wenzhou Medical University,Wenzhou(325000),China

ObjectiveTo study the expression of C/EBPα in colon cancer tissues and the effect of its over－expression on invasion of SW480．MethodsThe expression level of C/EBPα was detected in cancer tissues and normal tissues from 48 patients with colon cancer by immunohistochemistry．The relationships between theexpression of C/EBPα and clinicopathological parameters of colon cancer were statistically analyzed．pCDGFP－C/EBPα eukaryotic expression vector was constructed and transfected into SW480to study the change of invasive ability of tumor cells by wound scratch assay and to detect the change of tumor invasion－associated protein（KLF5,MMP－2,MMP－9, ECD）expressions．ResultsImmunohistochemistry results showed that the rate of low expression of C/EBPα was 6．25%in normal tissues and 68．75%in colon cancer tissues,with a statistically significant difference between them （P＜0．05）．Patients with low expression of C/EBPα hada larger tumor diameter,later stages of the TMN and higherprobability of lymph node metastasis．Wound scratch assay showed that the migration rate of normal SW480 cells was 53．16%after 48h and 80．77%after 72h（P＜0．05）;the migration rate of SW480 cells that overexpressed C/ EBPα was 23．57%after 48h and 31．89%after 72h（P＜0．05）．Immunoblotting experiments also showed that the expression of KLF5,MMP－2,MMP－9 was significantly decreased,but ECD was significantly increased in SW480 cells with overexpressed C/EBPα．ConclusionThe expression of C/EBPα reduces in colon cancer,and it has a close relationship with TMN staging and migration．The overexpression of C/EBPα can significantly reduce the invasion of colon cancer cells and hence it may have a great significance on early diagnosis and targeted therapy of colon cancer in the future．

colon cancer;C/EBPα;overexpression;invasion

浙江省樂清市軟課題與社會發(fā)展項目（No．2014Y005）

浙江省樂清市第二人民醫(yī)院外科（樂清 325600）；2溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胃腸外科（溫州 325000）

陳旭權(quán)，Tel：13806606853；E－mail：chenxunquan1972@163．com