王燕平葉品良張傳濤盧潤生盧振方 陳 歡

·論著·

肺癆康治療與KatG基因突變相關(guān)的耐異煙肼肺結(jié)核分子機制初探

王燕平1葉品良1張傳濤2盧潤生3盧振方 陳 歡1

目的探討肺癆康治療耐異煙肼肺結(jié)核的分子機制是否與KatG基因突變發(fā)生回復(fù)相關(guān)。方法 SPF級昆明種小鼠80只隨機分為標(biāo)準(zhǔn)菌株組、對照組、異煙肼組、肺癆康組，各20只；分別給予生理鹽水、生理鹽水、異煙肼液、肺癆康液連續(xù)灌胃56天。處死小鼠解剖分離出肺組織，每組隨機抽取1～2只感染小鼠肺組織提取結(jié)核分枝桿菌DNA進(jìn)行全基因組檢測。分析各組小鼠肺組織耐藥分枝結(jié)核桿菌基因突變情況。結(jié)果 （1）標(biāo)準(zhǔn)菌株組基因序列與參考值一致；對照組與參考值比較僅KatG基因突變。（2）與對照組比較，異煙肼組、肺癆康組KatG基因突變位點未見基因回復(fù)現(xiàn)象，但發(fā)現(xiàn)更多突變位點。（3）與異煙肼組比較，肺癆康組不僅存在相當(dāng)大部分新生突變位點重合現(xiàn)象，還出現(xiàn)僅肺癆康組存在的新生突變位點，其密碼子對氨基酸表達(dá)影響程度達(dá)“HIGH”。結(jié)論 異煙肼、肺癆康對KatG基因突變導(dǎo)致的耐異煙肼肺結(jié)核均有治療作用。肺癆康組治療作用可能與新突變位點（RV0063）改變有關(guān)。

耐藥肺結(jié)核；肺癆康；KatG基因突變；分子機制

肺癆康是臨床治療肺結(jié)核的經(jīng)驗方，由蒸百部、蛤蚧、天冬等十二味中藥組成。前期研究[1]發(fā)現(xiàn)，肺癆康治療肺結(jié)核可以促進(jìn)結(jié)核病患者臨床癥狀和肺部體征消失，促進(jìn)肺部病變吸收，痰涂片轉(zhuǎn)陰，對結(jié)核分枝桿菌，尤其是對耐異煙肼等耐藥結(jié)核分枝桿菌有抗菌作用[2-3]。目前研究[4-5]提示，耐異煙肼肺結(jié)核分支桿菌的耐藥機制主要與結(jié)核分枝桿菌katG和inhA基因突變與耐異煙肼相關(guān)。本課題組提出肺癆康可能通過影響耐異煙肼肺結(jié)核的基因突變位點發(fā)生變化從而對其產(chǎn)生治療作用。本研究采用小鼠尾靜脈注射法建立單耐異煙肼肺結(jié)核小鼠模型[6]，提取經(jīng)高劑量肺癆康治療后的耐異煙肼肺結(jié)核小鼠肺組織中的單耐異煙肼結(jié)核桿菌DNA，通過全基因測序技術(shù)檢測對比分析統(tǒng)計，初步探討肺癆康治療耐異煙肼肺結(jié)核的分子機制。

1 材料與方法

1.1 動 物 SPF級昆明種小鼠80只，雌雄各半，體質(zhì)量18～22g，由成都達(dá)碩生物科技有限公司提供。動物實驗合格證號：SCXK（川）2013-24。

1.2 實驗菌株 結(jié)核分枝桿菌單耐異煙肼菌株、結(jié)核桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H37·Rv均由四川省疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病防治研究所提供。

1.3 治療用藥 肺癆康水煎液制備：蒸百部15g，蛤蚧10g，天冬15g，川貝母6g，紫河車10g，北沙參15，阿膠10g，天花粉15g，三七粉6g，貓爪草24g，海浮石20g，白及15g等。采用傳統(tǒng)方法煎煮。用電子恒溫水箱60℃低溫將煎煮好的藥液濃縮至含生藥1g/mL，4℃冰箱保存，加熱使用。所需藥物均購自北京同仁堂成都分店。異煙肼液制備：異煙肼片（沈陽紅旗制藥有限公司，批號：1309021）100mg磨成粉狀，加入蒸餾水4mL稀釋，混合均勻。

1.4 主要儀器及試劑 電子稱重天平（廣州中山市金利電子衡器有限公司）；4℃冰箱（海爾集團(tuán)）；電子恒溫水箱（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增試劑盒（上?；蚩萍加邢薰咎峁?。Qubit 2.0熒光定量儀（Invitrogen，Q32866）；Magnetic Stand-96試劑（Life Technologies，AM-10027）；Agilent 2100 Bioanalyzer芯片分析系統(tǒng)（Agilent，G2939AA）；HiSeq 2500 Sequencing System測序系統(tǒng)（Illumina，SY-401-2501）；TruSeq DNA LT Sample Preparation Kit建庫（Illumina，F(xiàn)C-121-2001）；A-gencourt AMPure XP Beads（Beckman，A63881）。

2 實驗方法

2.1 肺結(jié)核小鼠模型制備及分組 小鼠于實驗室環(huán)境適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機分為標(biāo)準(zhǔn)菌株組（H37· Rv）、對照組（突變耐藥菌株組）、異煙肼組、肺癆康組，每組20只。標(biāo)準(zhǔn)菌株組小鼠尾靜脈注射H37·Rv結(jié)核標(biāo)準(zhǔn)菌株,其余三組分別注射與KatG基因突變相關(guān)的耐異煙肼菌懸液0.1mL（含105cfu細(xì)菌，建立肺結(jié)核動物模型[7]。

2.2 治療給藥 各組動物于造模1周后開始灌胃治療。（1）肺癆康組：參照前期實驗研究結(jié)果[2]并按國家中藥管理局的相關(guān)規(guī)定，以6g/kg為高劑量進(jìn)行灌胃治療；（2）異煙肼組：給予同體積的異煙肼灌胃。參照相關(guān)指南[8]，對耐藥結(jié)核病給予高劑量異煙肼[0.016～0.02g/（kg·d）治療，以正常成人體質(zhì)量70kg，小鼠體質(zhì)量20g按體表面積比（0.0026）等效劑量進(jìn)行換算，小鼠給藥量為 0.15g/（kg·d）；（3）標(biāo)準(zhǔn)菌株組（H37Rv）及對照組：分別給予同體積的生理鹽水灌胃。以上四組均每日灌胃1次，連續(xù)灌胃56天。

2.3 小鼠肺組織耐藥結(jié)核分支桿菌全基因組測序頸椎脫臼法處死小鼠后，用75%酒精消毒小鼠體表5min，無菌條件下解剖小鼠，分離出肺臟，在接種菌株的各實驗組隨機取1～2只小鼠肺組織標(biāo)本，分離出結(jié)核分支桿菌。采用DNeasy Blood&Tissue Kit （Qiagen，69506）按照生產(chǎn)廠商提供的操作流程進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌DNA抽提及純化，純化后的DNA經(jīng)Qubit 2.0 Fluorometer和0.8%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的DNA進(jìn)行后續(xù)的測序?qū)嶒?。按照實驗說明書對基因組DNA進(jìn)行片段化，末端修復(fù)、3’末端加A、連接接頭、富集等步驟，完成測序樣本文庫構(gòu)建。所建文庫使用Qubit 2.0 Fluorometer檢測濃度，按照 cBot User Guide所示相應(yīng)流程，在Illummina HiSeq 2500測序儀配套的 cBot上完成Cluster生成和第一向測序引物雜交。按照HiSeq 2500 User Guide準(zhǔn)備測序試劑，將攜有cluster的flow cell上機測序。測序過程由Illumina提供的data collection software進(jìn)行控制，并進(jìn)行實時數(shù)據(jù)分析。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 使用bwa軟件（version 0.7.8）對預(yù)處理后的上機讀取結(jié)果 reads進(jìn)行序列對比（Mapping）（參考基因組為肺結(jié)核桿菌H37RV標(biāo)準(zhǔn)菌（REF），參考基因組下載鏈為：http://ftp.ncbi.nih. gov//genomes/Bacteria/Mycobacterium-tuberculosis-H 37Rv-uid57777）組間樣本基因序列同一位點篩選對比。

3 結(jié)果

3.1 肺癆康、異煙肼組不同“HIGH”突變位點與野生型對照組比較 從各組樣本隨機選取1～2個樣本進(jìn)行全基因組測序，標(biāo)準(zhǔn)菌株組抽取D16號，對照組抽取17號，異煙肼組抽取19號，肺癆康組抽取D21、25號，結(jié)果如下：（1）在基因序列第68156位置，標(biāo)準(zhǔn)菌株組及異煙肼組系統(tǒng)未獲取到核苷酸信息；對照組顯示“0/0”不存在由參考序列“G”向“T”突變或多態(tài)性，肺癆康組D21號樣本顯示“0/1”位點核苷酸序列存在多態(tài)性；肺癆康組25號樣本結(jié)果同對照組。在基因序列第392261位置，標(biāo)準(zhǔn)菌株組、對照組及異煙肼組分別顯示“0/0”無突變或多態(tài)性，“0/1”多態(tài)性，“1/1”突變結(jié)果；肺癆康組D21號、25號樣本系統(tǒng)均未獲得信息。染色體NC-000962.3第68156位置標(biāo)準(zhǔn)菌株組、對照組、異煙肼組未檢測到基因突變現(xiàn)象，而肺癆康組樣本提示存在多態(tài)性可能，即核苷酸“G”向“T”轉(zhuǎn)變的不穩(wěn)定性。第392261位置，與標(biāo)準(zhǔn)菌株比較，對照組存在“錯義突變”將原編碼終止密碼子的密碼子轉(zhuǎn)為編碼谷氨酰胺的密碼子的多態(tài)性改變，異煙肼組發(fā)生“錯義突變”，而肺癆康組在該位置系統(tǒng)未獲得檢測結(jié)果。見表1。

表1 肺癆康、異煙肼組不同“HIGH”突變位點與野生型對照組比較

3.2 肺癆康、異煙肼均發(fā)生“HIGH”突變的各位點與標(biāo)準(zhǔn)菌組及對照組比較 與標(biāo)準(zhǔn)菌株組比較，在染色體 NC-000962.3第 123454、2337179、4351039、4383655位置的核苷酸，對照組存在多態(tài)性，異煙肼組與肺癆康組存在完全突變；在3717105位置標(biāo)準(zhǔn)菌株組、對照組與參考序列對比核苷酸均為多態(tài)性狀態(tài)，異煙肼組、肺癆康組與參考序列對比則結(jié)果一致。見表2。

表2 肺癆康、異煙肼均發(fā)生“HIGH”突變的各位點與標(biāo)準(zhǔn)菌組及對照組比較

3.3 四組樣本KatG基因突變位點比較 標(biāo)準(zhǔn)菌株組經(jīng)PCR測序證實在KatG基因位置未發(fā)生突變，對照組與標(biāo)準(zhǔn)菌株組比較存在多態(tài)性，異煙肼組與肺癆康組存在突變；經(jīng)異煙肼和肺癆康治療干預(yù)后該突變位點，并未發(fā)生突變基因回復(fù)，相反，該位置基因存在形式由動態(tài)性轉(zhuǎn)變?yōu)橥蛔?。見?。

表3 四組樣本KatG基因突變位點比較

3.4 染色體以下位置堿基突變情況及所導(dǎo)致氨基酸序列改變總覽 第68156、123454、1037911、2337179、3717105、4351039位置基因編碼序列分別由Gaa→Taa、Caa→Taa、Cga→Tga、Gaa→Taa、Cag→Tag、Gaa→Taa轉(zhuǎn)變，其分別導(dǎo)致原編碼412位谷氨酸、380位谷氨酰胺、305位精氨酸、609位谷氨酰胺、6位谷氨酰胺、99位谷氨酸的密碼子變?yōu)榻K止密碼，使氨基酸鏈的合成終止，即發(fā)生“無義突變”，從而影響所表達(dá)蛋白的性質(zhì)。第392261、4383655位置發(fā)生“錯義突變”，導(dǎo)致原來的終止密碼子變?yōu)榉謩e編碼75位谷氨酰胺、111位谷氨酰胺的密碼子。見表4。

表4 各組染色體以下位置堿基突變情況及所導(dǎo)致氨基酸序列改變總覽表

4 討 論

目前多數(shù)研究[9-11]表明，結(jié)核分支桿菌耐異煙肼的產(chǎn)生與過氧化氫酶—過氧化物酶的編碼基因KatG基因的缺失和突變有關(guān)，KatG基因?qū)е碌腗TB觸酶—過氧化物酶活性降低或缺失可以解釋90%以上的異煙肼耐藥。本次研究在前期臨床中藥復(fù)方肺癆康治療耐異煙肼結(jié)核病患者臨床有效以及動物實驗和體外藥理等實驗[1-3]基礎(chǔ)上，繼續(xù)深入對耐藥結(jié)核分枝桿菌基因?qū)哟芜M(jìn)行探討。實驗結(jié)果顯示，經(jīng)肺癆康、異煙肼干預(yù)治療后，在KatG基因突變位置并未發(fā)現(xiàn)基因回復(fù)現(xiàn)象，否定了本實驗最初的探索性假設(shè)，但是本次實驗有一定新發(fā)現(xiàn)，全基因測序發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌的NC-000962.3染色體第68156位置經(jīng)肺癆康干預(yù)治療后與其它三組比較，肺癆康組存在“基因多態(tài)性”現(xiàn)象，該基因RV0063所編碼蛋白功能雖暫不完全明確，但其可能編碼相關(guān)過氧化酶，類似于rv3107c，rv1257c等編碼結(jié)核分枝桿菌蛋白，如與過氧化還原酶ps00862含有共價FAD結(jié)合位點[12]，當(dāng)該處核苷酸由“G”變?yōu)椤癟”后，則該處基核苷酸序列發(fā)生“無義突變”，使氨基酸的編碼終止，導(dǎo)致編碼412谷氨酸的密碼子變?yōu)榻K止密碼，使氨基酸鏈繼續(xù)形成終止，使蛋白的繼續(xù)表達(dá)中斷，而異煙肼治療組沒有這一變化，肺癆康治療耐異煙肼結(jié)核病的作用是否與這種改變有直接相關(guān)性尚不能肯定。另外在所有表格所列的其它基因位點上，異煙肼組、肺癆康組均發(fā)生相同改變，也說明肺癆康在治療耐藥結(jié)核分枝桿菌上可能有類似于異煙肼的作用，但這些位點所編碼的蛋白，其功能目前還未被研究證實。

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（收稿：2015-10-20 修回：2015-12-07）

Molecular Mechanism of Isoniazid Resistant Tuberculosis Associated with KatG Gene Mutation by Treat-ment with Feilaokang

WANG Yanping1,YE Pinliang1,ZHANG Chuantao2,LU Runsheng3,LU Zhenfang1,CHENHuan1. 1 Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Chengdu(610075);2 Department of Infectious Disease,Affiliated Hospital of Chengdu University of Traditional ChineseMedicine,Chengdu(610072);3 Sichuan Provincial Center for Disease Control and Prevention,Chengdu(610041),China

ObjectiveTo explore the molecular mechanism of Feilaokang treating isoniazid-resistant tuberculosis is related to KatG gene mutations with or without reply.Methods Eighty SPF mice were randomly divided into standard strain group,control group,isoniazid group,and Feilaokang group,in each group of 20 mice.Mice in the above groups were given saline,saline,isoniazid,and Feilaokang by gavage for 56d,respectively,then the mice were sacrificed and the lung tissues were dissected and isolated,and 1-2 of the DNA infected mice in each group were randomly selected to extract mycobacterium tuberculosis.Results The gene sequence of mycobacterium tuberculosis in standard strain group was consistent with reference;that of control group had KatG gene mutation.Compared with control group,isoniazid and Feilaokang groups had more KatG gene mutations with out reply.Compared with isoniazid group,Feilaokang group had more de novo KatG gene mutations,and some of the mutations were only observed in Feilaokang group.The codon of the mutation had high accuracy in specifying the amino acid. Conclusion Both of Isoniazid and Feilaokang can treat isoniazid-resistant tuberculosis induced by KatG gene mutations.The effect of Feilaokang may be related to the new mutation site RV0063.

drug-resistant tuberculosis;Feilaokang;KatGgene mutation;molecular mechanism

國家自然科學(xué)基金資助項目（No.81173382）

1成都中醫(yī)藥大學(xué)（成都 610075）；2成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院感染科（成都 610072）；3四川省疾病預(yù)防控制中心（成都 610041）

葉品良，Tel：13881839284；E-mail：mrypl@163.com