李佳歡，鄧 波，漫 靜，張佳良，劉 靜，李東琴

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,北京 100193； 2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118)

3種熒光標(biāo)記根瘤菌數(shù)量測(cè)定方法比較

李佳歡1，鄧 波1，漫 靜1，張佳良2，劉 靜1，李東琴1

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,北京 100193； 2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118)

試驗(yàn)以綠色熒光蛋白標(biāo)記的中華苜蓿根瘤菌菌株Sm1021為試驗(yàn)材料，將平板涂布法、膜過(guò)濾法、流式細(xì)胞術(shù)3種微生物計(jì)數(shù)方法測(cè)得結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，以平板涂布法為基準(zhǔn)，觀察膜過(guò)濾法與流式細(xì)胞術(shù)的準(zhǔn)確性。結(jié)果表明:利用膜過(guò)濾法測(cè)定根瘤菌數(shù)量可獲得與平板涂布法相近的結(jié)果,但在操作層面上具有一定制約，且測(cè)定成本較高，只有在某些特定情況下具有應(yīng)用優(yōu)勢(shì)；流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定的結(jié)果與平板涂布法所得結(jié)果間存在顯著的差異，但由于菌類(lèi)的數(shù)量基數(shù)較大，可進(jìn)行粗略的統(tǒng)計(jì)估算。此外，當(dāng)菌液中菌量較大時(shí)，流式細(xì)胞術(shù)的準(zhǔn)確性增加(P=0.495)。

熒光標(biāo)記；平板涂布法；膜過(guò)濾法；流式細(xì)胞術(shù)；根瘤菌

豆科植物與根瘤菌共生形成的根瘤具有高效的固氮能力，所固定的氮素約占生物固氮總量的65%[1-2]。在發(fā)達(dá)國(guó)家，接種高效根瘤菌以提高豆科植物的產(chǎn)量已成為廣泛使用的農(nóng)業(yè)措施[3]。但在田間條件下，人工接種的高效根瘤菌的占瘤率很低，并不能達(dá)到預(yù)期效果[4]。接種菌在植株根際的定殖是其與植株發(fā)生共生作用的前提。研究報(bào)道，根瘤菌在植株根系的定殖數(shù)量，尤其是在根尖的定殖數(shù)量對(duì)根瘤菌的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤能力有顯著影響[5-7]。準(zhǔn)確、快速測(cè)定根瘤菌的數(shù)量對(duì)于制定科學(xué)、合理的提高接種菌占瘤率的方法具有指導(dǎo)意義。

平板涂布法(spread plate method,SPM)是根瘤菌計(jì)數(shù)常用的方法[8-10]。其所需材料簡(jiǎn)單、成本較低，但操作繁瑣,工作量大。顯微鏡直接鏡檢法(Direct microscope counting,DMC)利用顯微鏡直接對(duì)可染色微生物進(jìn)行鏡檢計(jì)數(shù)，主要包括涂片法、瓊脂薄片法、膜過(guò)濾法。此方法操作簡(jiǎn)單，試驗(yàn)周期較短。其中，膜過(guò)濾法相比于其他兩種方法制樣均勻、制片簡(jiǎn)單、無(wú)需培養(yǎng)，用于可被特異染色微生物的計(jì)數(shù)[7,11-12]，但準(zhǔn)確性受細(xì)胞染色質(zhì)量，環(huán)境因素影響較大，使用范圍受限。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，微生物標(biāo)記手段逐漸成熟，熒光蛋白標(biāo)記技術(shù)得以完善，如綠色熒光蛋白(GFP)、紅色熒光蛋白(RFP)等[13-14]。此類(lèi)標(biāo)記蛋白在適當(dāng)波長(zhǎng)的光的照射下便可發(fā)射熒光，能量消耗較小。利用熒光顯微鏡測(cè)定熒光標(biāo)記的菌株的數(shù)量可減小鏡檢法的主觀判斷誤差及染色偏差。

流式細(xì)胞術(shù)是近年來(lái)新興的熱門(mén)技術(shù)，該技術(shù)基于流式細(xì)胞儀的應(yīng)用可準(zhǔn)確快速測(cè)定生物細(xì)胞大小、數(shù)量、活性狀態(tài)或其他精量指標(biāo)如膜電勢(shì)、胞內(nèi)鈣濃度等并進(jìn)行細(xì)胞分選[15]，具有快速、準(zhǔn)確、信息量大等優(yōu)點(diǎn)。流式細(xì)胞儀的許多應(yīng)用是基于內(nèi)置光源對(duì)熒光物質(zhì)的激發(fā)而設(shè)計(jì)。帶有熒光蛋白的微生物樣本不需進(jìn)行任何染色處理便可被高效識(shí)別分選并計(jì)數(shù)。研究結(jié)果報(bào)道，流式細(xì)胞儀可準(zhǔn)確計(jì)數(shù)<15 μm的細(xì)胞，如網(wǎng)織紅細(xì)胞、白細(xì)胞等[16-18]。但此類(lèi)細(xì)胞體積較大，便于識(shí)別。對(duì)于細(xì)菌細(xì)胞來(lái)說(shuō)，直徑小，數(shù)量多，利用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性有待驗(yàn)證。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒、培養(yǎng)基 綠色熒光蛋白標(biāo)記的Sm1021菌株(GFP-Sm1021)由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)王濤教授實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。

根瘤菌培養(yǎng)基配方：YEM培養(yǎng)基[19]，甘露醇10 g，酵母浸粉0.4 g，NaCl 0.1 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，K2HPO40.5 g，1 000 mL水(固體培養(yǎng)基加15 g瓊脂)。

1.1.2 試驗(yàn)儀器及分析軟件 Millipore直徑25 mm針頭式過(guò)濾器，Whatman孔徑0.25 μm，直徑25 mm微孔濾膜， 奧林巴斯熒光顯微鏡BX53，流式細(xì)胞儀BD FACS Calibur，流式細(xì)胞儀獲取分析軟件為cellquest pro，754型分光光度計(jì)，數(shù)據(jù)分析軟件為SPSS 18.0。

1.2 試驗(yàn)方法

在抗性平板上取GFP-Sm1021菌落接種YEM液體培養(yǎng)基，28℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)48 h為種子液。取500 μL種子液接種至含50 mL YEM液體培養(yǎng)基的150 mL錐形瓶中，18個(gè)重復(fù)。28℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)，每4 h取樣1次，每次取出1瓶菌液，利用分光光度計(jì)在600 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，繪制GFP-Sm1021吸光度曲線。用平板涂布法、膜過(guò)濾法、流式細(xì)胞術(shù)3種方法測(cè)定每個(gè)時(shí)期樣品所含根瘤菌數(shù)量，繪制GFP-Sm1021數(shù)量曲線。

平板涂布法參考文獻(xiàn)[20]方法進(jìn)行，在395 nm波長(zhǎng)簡(jiǎn)易紫外燈下計(jì)發(fā)光菌落數(shù)量。

膜過(guò)濾法參考文獻(xiàn)[12]，取1 mL適當(dāng)稀釋度的菌液利用可換膜針頭式濾器進(jìn)行過(guò)濾，無(wú)菌水沖洗針筒內(nèi)壁。用鑷子小心取出濕潤(rùn)的濾膜平鋪于載玻片上，有菌面朝上。在濾膜中央滴加1滴香柏油，蓋上蓋玻片。在蓋玻片上滴加一滴香柏油，放在熒光顯微鏡下，100倍油鏡下鏡檢。隨機(jī)抽取10個(gè)視野進(jìn)行熒光根瘤菌計(jì)數(shù)。注意控制菌液濃度，使每個(gè)視野內(nèi)的菌的數(shù)量介于20～70。根據(jù)公式計(jì)算1 mL菌液所含根瘤菌數(shù)量。

式中：N為1mL樣本菌液所含根瘤菌數(shù)量，d為濾膜直徑，F(xiàn)為顯微鏡視場(chǎng)數(shù)，M為顯微鏡物鏡放大倍數(shù)，n為視野內(nèi)看到的根瘤菌細(xì)胞數(shù)量的平均值,k為所取菌液的稀釋倍數(shù)。

流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定：采用熒光標(biāo)記后的根瘤菌為試驗(yàn)樣品，省去熒光標(biāo)記過(guò)程。將菌液調(diào)節(jié)至合適濃度，盡量保證測(cè)定過(guò)程中流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)小于500個(gè)/管，以提高測(cè)定精確度。

調(diào)節(jié)后的樣品放入流式管中待測(cè)。流式細(xì)胞儀的使用方法參照BDFACSCalibur使用說(shuō)明進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 GFP-Sm1021的吸光度曲線

利用YEM液體培養(yǎng)基培養(yǎng)GFP-Sm1021，其在600 nm波長(zhǎng)處的吸光度曲線呈“S”形，0～12 h吸光度增加緩慢，12 h后開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，吸光度快速增加，40 h后吸光度增加速率減慢(圖1)。由于菌液濃度與其吸光度在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，可根據(jù)吸光度值大致估計(jì)菌液中的根瘤菌數(shù)量。

圖1 GFP-Sm1021 吸光度曲線Fig.1 Absorbance curve of GFP-Sm1021

2.2 GFP-Sm1021數(shù)量測(cè)定結(jié)果

利用平板涂布法測(cè)定根瘤菌數(shù)量，所得數(shù)量曲線如圖2所示。由根瘤菌的吸光度曲線分析，在12～40 h，菌液中根瘤菌的吸光度處于對(duì)數(shù)期增長(zhǎng)期，但通過(guò)測(cè)定根瘤菌的數(shù)量曲線可知，在20 h之后，根瘤菌菌液中的活菌增加量減少。由此，在根瘤菌生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)后期，由于空間、營(yíng)養(yǎng)等因素的限制，根瘤菌的死亡量增大，總體活菌數(shù)量基本維持在穩(wěn)定值。

圖2 GFP-Sm1021 數(shù)量曲線Fig.2 Dynamic of the number of GFP-Sm1021

利用吸光度值可大致估計(jì)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)前期菌液中的根瘤菌數(shù)量，但此法并不能估算對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期的活菌數(shù)量，因?yàn)閷?duì)數(shù)生長(zhǎng)后期死亡根瘤菌的數(shù)量逐漸增加多，影響菌液吸光度與活菌數(shù)量間的相關(guān)性。 目前，常用的微生物數(shù)量的測(cè)定方法為平板涂布法，試驗(yàn)將膜過(guò)濾法、流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定結(jié)果與之進(jìn)行對(duì)比(圖2)，并對(duì)平板涂布法與濾膜法、流式細(xì)胞術(shù)所測(cè)得的數(shù)據(jù)進(jìn)行配對(duì)樣本T檢驗(yàn)，觀察平板涂布法與膜過(guò)濾法、流式細(xì)胞術(shù)測(cè)得的數(shù)據(jù)間差異顯著性(表1)。

表1 3種方法測(cè)得數(shù)據(jù)間差異顯著性分析

分析可知，利用微孔濾膜截留樣品中的微生物，在熒光顯微鏡下直接鏡檢，測(cè)定熒光根瘤菌的數(shù)量與平板計(jì)數(shù)法間沒(méi)有顯著性差異，數(shù)量曲線基本重合，數(shù)值差異大多不超過(guò)平板涂布法的3%。膜過(guò)濾法可用來(lái)代替平板涂布法，進(jìn)行快速的根瘤菌數(shù)量測(cè)定。但此方法僅限于可熒光染色或已進(jìn)行熒光標(biāo)記的菌種，有一定的局限性。此外，大量重復(fù)是膜過(guò)濾法進(jìn)行的前提，以保證數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性。

利用流式細(xì)胞儀的分選功能，可測(cè)定并計(jì)算菌液中的菌量。在菌體熒光標(biāo)記的基礎(chǔ)上，流式細(xì)胞儀的內(nèi)置光源可激發(fā)熒光，捕捉樣品中的發(fā)光體。然而，流式細(xì)胞術(shù)在根瘤菌計(jì)數(shù)上的準(zhǔn)確性鮮有報(bào)道。試驗(yàn)利用流式細(xì)胞儀測(cè)得的數(shù)據(jù)與平板涂布法測(cè)得的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)二者測(cè)得結(jié)果間存在顯著差異，尤其是在菌液濃度較低時(shí)，流式細(xì)胞術(shù)測(cè)得結(jié)果甚至可達(dá)平板涂布法的6倍以上。但在培養(yǎng)20 h后菌液中活菌數(shù)量增大，流式細(xì)胞術(shù)的準(zhǔn)確性增加(P=0.495)，二者間的差值大多不超過(guò)平板涂布法測(cè)得數(shù)量的20%。

3 討論

20世紀(jì)60年代，Shimomura 等從從維多利亞多管水母中首次分離純化出生物發(fā)光蛋白質(zhì)，得到綠色熒光蛋白(GFP)，并在2008年因此獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。隨后，綠色熒光蛋白廣泛應(yīng)用于多種細(xì)菌、真菌、植物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞的研究[21-22]。GFP是由238個(gè)氨基酸殘基組成的酸性單體球狀蛋白，能夠抵抗高溫及性劑，分子量為27～30 kD，可在長(zhǎng)波紫外光的照射下發(fā)射綠光。因其靈敏、穩(wěn)定、無(wú)毒害、光譜等優(yōu)點(diǎn)常用作標(biāo)記物[23-24]，在根瘤菌標(biāo)記上的應(yīng)用也較為普遍。

雖然膜過(guò)濾法已常用于微生物數(shù)量的檢測(cè)，尤其是水體中大腸桿菌的測(cè)定[25]，但筆者在試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)膜過(guò)濾法雖可在短時(shí)間內(nèi)測(cè)定微生物的數(shù)量，但并不像部分文獻(xiàn)中提到的簡(jiǎn)單易行，存在一定的局限性。①國(guó)產(chǎn)微孔濾膜與可換膜過(guò)濾器的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)尚不能滿足此項(xiàng)測(cè)定，只能選用進(jìn)口濾膜及濾器，造成了此方法的成本提高；②為保證計(jì)數(shù)方便和測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，要保證視野內(nèi)細(xì)胞數(shù)量在一定的數(shù)量范圍內(nèi)，不能過(guò)多或過(guò)少，這就意味著對(duì)于未知濃度的樣本來(lái)說(shuō)，需進(jìn)行多次預(yù)實(shí)驗(yàn)確定合適的稀釋度，增加工作量與試驗(yàn)成本；③由于濾膜在負(fù)壓過(guò)濾過(guò)程中會(huì)被壓出輕微褶皺，而且在鏡檢的過(guò)程中需在濾膜的中央滴加香柏油以排除蓋玻片與濾膜間的空氣，導(dǎo)致微生物細(xì)胞向凹陷處的移動(dòng)，干擾試驗(yàn)結(jié)果?；谝陨显?，只有在某些特定條件下，如快速測(cè)定樣品，樣品中有兩種以上熒光標(biāo)記(便于一次性同時(shí)測(cè)出)，樣品中雜菌過(guò)多等，膜過(guò)濾法才具有明顯優(yōu)勢(shì)，否則應(yīng)采用平板涂布法。

隨著流式細(xì)胞儀的普及，利用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞的分選、計(jì)數(shù)已逐步應(yīng)用于微生物領(lǐng)域。許多試驗(yàn)結(jié)果表明，流式細(xì)胞術(shù)在進(jìn)行水體微型浮游植物[26]、酵母菌[27]、細(xì)菌[28-29]計(jì)數(shù)，檢測(cè)DNA含量和細(xì)胞的倍性水平[30-31]、觀測(cè)細(xì)胞凋亡[32]時(shí)均表現(xiàn)出較高的準(zhǔn)確性。但在此次試驗(yàn)中，利用流式細(xì)胞儀測(cè)定熒光標(biāo)記根瘤菌的數(shù)量時(shí)，并未獲得十分準(zhǔn)確的結(jié)果。原因有幾點(diǎn)：①根瘤菌體積較小，儀器不能精確識(shí)別；②部分前人試驗(yàn)僅選取了幾個(gè)樣本，樣本量過(guò)少或樣本間的菌量差異過(guò)小，不足以代表流式細(xì)胞術(shù)計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性。同時(shí)反映出應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)時(shí)，當(dāng)菌量處于某一數(shù)量級(jí)時(shí)才可達(dá)準(zhǔn)確水平。本試驗(yàn)中，流式細(xì)胞儀測(cè)得的培養(yǎng)20 h后的樣品菌量與稀釋平板法相近(P=0.495)也可支持這一結(jié)論。此外，雖然在樣品中根瘤菌數(shù)量較少時(shí)利用流式細(xì)胞儀測(cè)定根瘤菌數(shù)量得出的結(jié)果與稀釋平板法得出的結(jié)果間存在顯著差異，但由于菌類(lèi)數(shù)量的數(shù)量級(jí)較高，測(cè)定的數(shù)據(jù)間差距并未達(dá)到一個(gè)數(shù)量級(jí)以上，對(duì)于某些雜菌多，不適于平板培養(yǎng)的樣品，可利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行粗略、快速地估計(jì)，從而提高工作效率。

4 結(jié)論

膜過(guò)濾法可快速測(cè)定樣品中熒光根瘤菌數(shù)量，操作過(guò)程不需嚴(yán)格無(wú)菌條件。但此方法成本昂貴，不易操作，僅在快速測(cè)定數(shù)據(jù)、樣品中熒光標(biāo)記種類(lèi)較多或雜菌干擾時(shí)具有使用優(yōu)勢(shì)。流式細(xì)胞術(shù)測(cè)得的熒光根瘤菌的數(shù)量并不精確，但由于菌類(lèi)數(shù)量的基數(shù)較大，可用來(lái)粗略估測(cè)樣品中熒光根瘤菌數(shù)量。

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Accuracy comparison of three methods on fluorescence labelled rhizobia counting

LI Jia-huan1，DENG Bo1，MAN Jing1，ZHANG Jia-liang2，LIU Jing1，LI Dong-qin1

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing,100193,China；2.CollegeofAnimalScienceandTechnology,JiLinAgriculturalUniversity,ChangChun130118,Chian)

Rhizobia strain Sm1021 marked with GFP (GFP-Sm1021) was used as an experimental strain to compare the counting accuracy of spread plate method(SPM),membrane filter method(MFM) and flow cytometry method (FCM).The results showed that the number of rhizobia counted by MFM was similar to SPM,however,MFM had some technical restrictiveness and higher experimental cost.There was a significant difference on the counted number between FCM and SPM,however,FCM can be used as a rough counting method because of the larger population of rhizobia.In addition,the accuracy of flow cytometry was better when the number of rhizobia was increased.

fluorescent mark；spread plate method；direct microscope counting；flow cytometry；rhizobia

2016-05-27；

2016-09-29

國(guó)家牧草產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-35)

李佳歡(1992-)，女，內(nèi)蒙古通遼人，碩士研究生。 E-mail：410243571@qq.com 鄧波為通訊作者。

S 182；S 541

A

1009-5500(2016)06-0055-05