張宏祥，張明理,2

(1.中國科學(xué)院新疆生態(tài)與地理研究所干旱區(qū)生物地理與生物資源重點(diǎn)實驗室，新疆 烏魯木齊 830011；2.中國科學(xué)院植物研究所，北京 100093)

草原毒草白喉烏頭的遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu)研究

張宏祥1，張明理1,2

(1.中國科學(xué)院新疆生態(tài)與地理研究所干旱區(qū)生物地理與生物資源重點(diǎn)實驗室，新疆 烏魯木齊 830011；2.中國科學(xué)院植物研究所，北京 100093)

通過測定采自天山和阿爾泰山草原的17個白喉烏頭居群的葉綠體DNA片段序列，調(diào)查了其遺傳多樣性和空間遺傳結(jié)構(gòu),并計算出每個居群的遺傳多樣性；運(yùn)用分子變異方差(AMOVA)分析計算發(fā)生在居群內(nèi)和居群間的遺傳變異比例；利用錯配分析來檢驗該物種是否發(fā)生了歷史居群擴(kuò)張；最后，基于最大熵方法模擬其物種在不同時期的分布區(qū)。結(jié)果表明：白喉烏頭具有較低水平的遺傳多樣性(單倍型多樣性±SD=0.343 7±0.048 8)，所有居群均共享一個單倍型；遺傳變異大致均等分布于居群間和局群內(nèi)(58.25% vs.41.75%)；兩個不同譜系的分化發(fā)生在第四紀(jì)冰期(1.816～2.280百萬年以前)末次盛冰期時期，該物種的避難所存在于天山西部，而在未來氣候變化條件下其分布區(qū)不會發(fā)生變化。研究認(rèn)為白喉烏頭這種空間遺傳結(jié)構(gòu)與其克隆繁殖、長的生活周期、異交繁殖等生活史特征，以及第四紀(jì)氣候變化影響相關(guān)。

白喉烏頭；遺傳結(jié)構(gòu)；譜系地理學(xué)；草原毒草；居群動態(tài)歷史

白喉烏頭(Aconitumleucostomum)為毛茛科(Ranunculaceae)烏頭屬(Aconitum)多年生草本植物[1]。該植物含有一類特殊的有毒成分烏頭堿，對草原生態(tài)系統(tǒng)和地方畜牧業(yè)生產(chǎn)造成重要危害。它已被列入天然草地的毒草名錄[2]。近年來，在擁有我國第3大天然草地面積的新疆地區(qū)，由于過度放牧和干旱氣候?qū)е绿烊徊菰嘶瘒?yán)重[3]。白喉烏頭具有高的繁殖能力，擁有有性繁殖和克隆繁殖兩種方式；而且它對其他植物，如高羊茅(Festucaelata)、草地早熟禾(Poapratensis)、垂穗披堿草(Elymusnutans)和藥用蒲公英(Taraxacumofficinale)等，存在一定的化感作用[4]。故伴隨著草原退化，白喉烏頭發(fā)生了大范圍擴(kuò)張蔓延。

前人主要研究了白喉烏頭的毒理性及其控制措施，揭示了白喉烏頭對一些牧草植物具有化感作用[4-5]；刈割[6]、除草劑[7]、圍欄封育和挖除[8]是控制其蔓延的有效手段。此外，研究還發(fā)現(xiàn)在天然草地上白喉烏頭具有均一性的種群分布格局[9]。盡管這些研究闡明了白喉烏頭的種群特征，但是尚未確定該植物的遺傳多樣性和空間遺傳結(jié)構(gòu)。植物的遺傳結(jié)構(gòu)與生物學(xué)特征密切相關(guān)，諸如繁殖力、生活史、繁育體系、授粉機(jī)制以及生境條件等[10-11]。草原雜草由于具有高的擴(kuò)散能力，通常都擁有比較特殊的遺傳結(jié)構(gòu)特征。而且，掌握毒草的居群擴(kuò)張軌跡和潛在分布區(qū)也可以為毒草治理和管控提供理論依據(jù)。由于分布區(qū)擴(kuò)張時遺傳漂變效應(yīng)導(dǎo)致我國西部草原廣泛分布的多年生毒草瑞香狼毒(Stellerachamaejasme)在中心地區(qū)分布居群的基因流水平要高于邊緣地區(qū)居群[12]。而瑞香狼毒居群邊緣居群則是在間冰期時期從東南部避難所快速擴(kuò)張而來[13]，這種快速擴(kuò)張能力與其花的特征、繁育系統(tǒng)和傳粉生態(tài)密切相關(guān)[14]。

選取草原毒草白喉烏頭為研究對象，為了弄清楚白喉烏頭分布區(qū)擴(kuò)張的遺傳機(jī)制，借助譜系地理學(xué)手段：(1)調(diào)查其空間遺傳結(jié)構(gòu)格局，揭示白喉烏頭與其生物學(xué)特征的關(guān)系；(2)預(yù)測未來環(huán)境變化條件下該植物分布區(qū)的潛在變化。

1 材料和方法

1.1 植物材料采集

采集了來自天山和阿爾泰山地區(qū)17個居群共135個白喉烏頭植物個體樣本及信息(圖1，表1)。為了避免克隆繁殖對采樣的影響，每個居群內(nèi)采集的個體樣品都來自不同的叢簇，且叢簇間隔大于50 m。采集白喉烏頭新鮮葉片在野外立即用硅膠干燥并帶回實驗室保存。

圖1 白喉烏頭的居群采集點(diǎn)和單倍型(H1-H5)分布Fig.1 Sampling locations and haplotypes (H1-H5) distribution of Aconitum leucostomum

居群名稱采集地經(jīng)/緯度個體數(shù)單倍型數(shù)單倍型多樣性/(±SD)×10-1核苷酸多樣性/(±SD)×10-2總體13553．437(0．488)2．865(1．440)GNS新疆和靜縣N43．23°/E84．74°725．714(1．195)6．684(3．825)WLST新疆新源縣N43．33°/E84．22°910．000(0．000)0．000(0．000)NLT新疆新源縣N43．31°/E84．02°922．222(1．662)2．600(1．479)GL新疆鞏留縣N43．24°/E82．84°1010．000(0．000)0．000(0．000)TKS新疆特克斯縣N42．87°/E81．75°910．000(0．000)0．000(0．000)ZS新疆昭蘇縣N42．70°/E80．81°724．762(1．713)0．112(0．125)MNS新疆瑪納斯縣N43．90°/E86．08°425．000(2．652)5．849(3．913)NLK新疆尼勒克縣N43．73°/E83．44°722．857(1．964)0．067(0．092)BL新疆博樂市N44．70°/E81．26°1033．778(1．813)0．094(0．107)HC新疆霍城縣N44．40°/E81．03°1022．000(1．541)0．047(0．072)YM新疆裕民縣N46．01°/E83．01°1010．000(0．000)0．000(0．000)EM新疆額敏縣N46．37°/E84．01°922．222(1．662)2．599(1．479)TC新疆塔城市N46．95°/E83．42°724．762(1．713)0．112(0．125)BEJ新疆布爾津縣N48．51°/E87．13°710．000(0．000)0．000(0．000)ALT新疆阿勒泰市N47．94°/E88．14°1022．000(1．541)2．339(1．321)FY新疆富蘊(yùn)縣N47．21°/E89．91°426．667(2．041)7．645(5．086)QH新疆青河縣N46．86°/E90．56°610．000(0．000)0．000(0．000)

1.2 DNA提取、擴(kuò)增和測序

每個樣品的葉綠體總DNA利用CTAB法從50 mg硅膠干燥葉片中提取。為了獲得足夠的堿基變異信息，預(yù)實驗中選擇了多對引物來進(jìn)行擴(kuò)增測序，包括cpDNA的psbA-trnH,trnS-trnG,trnL-trnF,atpB-rbcL,rps16-rpl32,psbB-psbH,rps16,rpoB-trnC,psbK-psbI 片段以及nrDNA ITS區(qū)間[15]。僅在cpDNA片段psbK-psbI中發(fā)現(xiàn)堿基變異。之后，對所有的135個個體的psbK-psbI片段進(jìn)行了擴(kuò)增測序。PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序依照文獻(xiàn)[16]設(shè)定。所得擴(kuò)增結(jié)果送至生工生物(上海)有限責(zé)任公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果利用CLUSTAL_X 軟件[17]比對校正，并基于堿基突變和缺失來確定cpDNA單倍型。所有獲得的單倍型序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(獲取號：XXXXX-XXXXX)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

首先，運(yùn)用Network version 4.6 軟件[18]構(gòu)建MJ網(wǎng)絡(luò)圖來探測cpDNA單倍型之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。同時，運(yùn)用BEAST version 1.6.1軟件[19]進(jìn)行貝葉斯嚴(yán)格分子鐘運(yùn)算來估算單倍型分化時間。分歧時間以每百萬年8～10×10-3的堿基替換率來計算[20]。BEAST軟件執(zhí)行HKY替代模型下的MCMC運(yùn)算。運(yùn)算所得的聯(lián)合參數(shù)用Tracer version 1.4軟件[19]來檢驗相關(guān)參數(shù)的ESS是否均大于200。分子鐘系統(tǒng)樹在FigTree v.1.3.1軟件(http://tree.bio.ed.as.uk/software/figtree/)中編輯。在構(gòu)建median-joining(MJ)網(wǎng)絡(luò)圖和分子鐘分析時，選取了4個外類群：1個物種(Aconitumheterophyllum)來自烏頭屬(Aconitum)；兩個物種(HelleboruscroaticusandActaeaasiatica)來自金蓮花亞科；另外一個種(Thalictrumcoreanum)來自毛茛科(Ranunculaceae)其他亞科。

其次，運(yùn)用Arlequin version 3.11 軟件[21]計算了每個居群的遺傳多樣性，包括核苷酸多樣性[22]和單倍型多樣性[22]。同時，運(yùn)用該軟件進(jìn)行了分子變異方差(AMOVA)分析，計算了發(fā)生在居群內(nèi)和居群間的遺傳變異比例。為了檢驗白喉烏頭是否發(fā)生了歷史居群擴(kuò)張，還運(yùn)用Arlequin version 3.11 軟件[21]進(jìn)行了錯配分析。錯配分析的結(jié)果顯示，如果發(fā)生居群擴(kuò)張的一般表現(xiàn)為單峰狀，而居群穩(wěn)定則一般表現(xiàn)為雙峰或多峰狀。為了檢驗這個居群擴(kuò)張模型的顯著性，計算了Harpending糙度指數(shù)(r)[23]及其對應(yīng)的P值。如果結(jié)果符合居群擴(kuò)張模型，運(yùn)用經(jīng)驗公式τ= 2ut來計算擴(kuò)張時間(t)，其中u代表每個世代的突變率[24]。u值計算公式為u= 2μkg，μ為突變率；k為DNA序列長度；g為每個世代的年數(shù)?；谖覀円郧暗难芯縖20]，毛茛科多年生草本的每個世代年數(shù)為5年。

最后，為了明確白喉烏頭在歷史、現(xiàn)在和未來時期的分布區(qū)變化，運(yùn)用MAXENT 3.3.3k軟件[25]對該物種在末次盛冰期(LGM；2.2萬年以前)、全新世中期(6千年以前)、現(xiàn)在和未來(2050年和2070年)氣候條件下的分布范圍進(jìn)行基于最大熵方法的物種分布區(qū)模擬(SDM)。通過野外采集和中國數(shù)字標(biāo)本館(CVH;http://www.cvh.org.cn/cms/)收集獲得該物種41個現(xiàn)在分布點(diǎn)數(shù)據(jù)，這些點(diǎn)數(shù)據(jù)用于分布區(qū)模型分析。

另外，從WordlClim數(shù)據(jù)庫(http://www.worldclim.org/download)下載了19個2.5分分辨率的生物氣候變量因子。由于同線性相關(guān)的環(huán)境變量會使得物種分布模型分析出現(xiàn)過擬合[26]。隨之，計算了19個生物氣候變量之間的Pearson相關(guān)性，并保留了6個低相關(guān)性的變量用于模型運(yùn)算(Pearson相關(guān)系數(shù)<0.75)。它們包括：BIO2 (平均日較差),BIO3 (等溫性),BIO6 (最冷月最低溫度),BIO9 (最干季平均溫度),BIO18 (最熱季降水量) 和BIO19 (最冷季降水量)。為了模擬歷史和未來分布區(qū)，物種分布區(qū)模擬分析需要加載對應(yīng)的氣候變量數(shù)據(jù)?；谝郧暗难芯縖20,27]，MIROC氣候模型更適合于模擬研究區(qū)域內(nèi)植物物種的分布。因此，我們從WordlClim數(shù)據(jù)庫(http://www.worldclim.org/download)中下載了MIROC模型下的LGM、全新世中期和未來(2050年和2070年)氣候數(shù)據(jù)。歷史和未來時期的分布區(qū)是基于對應(yīng)時間點(diǎn)的氣候變量投射至現(xiàn)在相同分辨率氣候變量上獲得。通過分析受試者工作特征曲線(ROC)的AUC值來評估模擬結(jié)果的可靠性，并運(yùn)用刀切法(jackknife test)來檢驗每個氣候變量在決定物種分布中所占的比重。

2 結(jié)果與分析

基于cpDNA psbK-psbI片段中的15個堿基置換和8個缺失，在17個白喉烏頭居群中共確定了5個單倍型。其中，單倍型H2擁有最廣泛分布，它在每個居群中都有出現(xiàn)(圖1)。單倍型H1和H3均出現(xiàn)于5個居群中，而另外兩個單倍型H4和H5均只在一個居群中出現(xiàn)(圖1)。MJ網(wǎng)絡(luò)圖表明白喉烏頭的5個單倍型存在兩個獨(dú)立的譜系，系統(tǒng)發(fā)育樹也支持這一拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(圖2)。其中，單倍型H1和H4聚為一個譜系；另外3個單倍型H2，H3和H5聚為另外一個譜系。分子鐘估算兩個譜系分化時間為1.816～2.280百萬年以前(圖2)；而譜系內(nèi)部單倍型間分化發(fā)生在0.067～0.283百萬年以前(圖2)。

在17個居群中，11個居群擁有兩個以上單倍型(表1)。從物種水平上來看，單倍型和核苷酸多樣性分別為0.3437 (±0.048 8)和0.028 6 (±0.014 4)(表1)。從居群水平上來看，GNS,MNS和FY 3個居群擁有較其他居群更高的遺傳多樣性(表1)。AMOVA分析表明，遺傳變異平均地分布于居群間與居群內(nèi)(58.25% vs.41.75%；表2)。該物種的錯配分析結(jié)果為單峰(圖3)，支持快速擴(kuò)張模型。同時，糙度指數(shù)(HRag= 0.389,P = 0.525)也符合擴(kuò)張模型?；赾pDNA的分子替代率，白喉烏頭的譜系擴(kuò)張估計發(fā)生在34.3～42.9千年以前。

圖2 白喉烏頭兩個不同譜系的分化時間和5個葉綠體單倍型Fig.2 Divergence dating of the two phylogeographic lineages of Aconitum leucostomum and the median-joining network for the five recovered chloroplast DNA haplotypes

變異來源自由度平方和方差組分變異百分比/%固定指數(shù)居群間16520．1263．76778Va58．25FST=0．58250，P<0．001居群內(nèi)118318．6602．70050Vb41．75總計134838．7856．46829

圖3 白喉烏頭17個居群的葉綠體單倍型的錯配分析Fig.3 Pairwise mismatch distributions of chloroplast DNA haplotypes for the 17 populations of Aconitum leucostomum

白喉烏頭分布區(qū)模型中用于訓(xùn)練和檢驗數(shù)據(jù)的AUC值為0.917/0.930，表明此次分布區(qū)模型結(jié)果良好。對白喉烏頭分布區(qū)模擬的生物氣候變量貢獻(xiàn)分別為：最熱季降水量(33.1%)、最冷季降水量(28.3%)、最冷月最低溫度(26.1%)、最干季平均溫度(9.2%)、平均日較差(2.1%)和等溫性(1.2%)。末次盛冰期(LGM；2.2萬年以前)、全新世中期(6千年以前)、現(xiàn)在和未來(2050年和2070年)時期白喉烏頭的分布范圍呈現(xiàn)在圖4中。該物種現(xiàn)在的潛在分布區(qū)出現(xiàn)在天山、準(zhǔn)噶爾西部山地和阿爾泰山。末次盛冰期時期該物種退縮到位于天山西部的避難所。物種分布區(qū)模型表明白喉烏頭在全新世中期(6千年以前)、現(xiàn)在和未來(2050年和2070年)時期具有穩(wěn)定的分布區(qū)。

圖4 基于物種分布區(qū)模型模擬的白喉烏頭分布區(qū)Fig.4 Distributions of Aconitum leucostomum as derived from the species distribution modeling

3 討論

白喉烏頭是新疆天然草地中一種主要的毒害草[2]，它具有較高的擴(kuò)散能力。與研究區(qū)域內(nèi)的其他植物相比較[16,20]，白喉烏頭擁有較低水平的單倍型多樣性，和較高水平的核苷酸多樣性(表1)。生活史特征(如繁殖力、生存期、繁育系統(tǒng)以及授粉機(jī)制等)和環(huán)境效應(yīng)(如地理分布范圍和地形條件)會影響植物的遺傳多樣性[10-11]。白喉烏頭是多年生草本而且具有克隆和有性兩種生殖方式，以及長的生存期。而且，這種植物主要分布于環(huán)境條件相類似的山地地區(qū)。研究發(fā)現(xiàn)17個樣點(diǎn)居群都共享一個單倍型H2(圖1)。這些特征都促使物種具有高的擴(kuò)散能力和較低水平的遺傳多樣性(表1)[10]。此外，該植物一個果實內(nèi)可產(chǎn)出多枚種子，并且具有蟲媒條件下的異交繁育模式。這些特征會促使居群內(nèi)產(chǎn)生較多的核苷酸變異和高的遺傳多樣性(表1)。對于白喉烏頭，發(fā)生在居群內(nèi)和居群間的遺傳變異比例幾乎相等(58.25% vs.41.75%)(表2)。這一結(jié)果與研究區(qū)內(nèi)其他烏頭屬植物不同，它們表現(xiàn)為居群間的遺傳變異比例高于居群內(nèi)[28]。

所有居群間共享單倍型H2的這種格局(圖1)表明白喉烏頭經(jīng)歷了奠基者效應(yīng)。同時，錯配分析結(jié)果也支持該植物經(jīng)歷了歷史居群擴(kuò)張(圖3)。說明白喉烏頭在進(jìn)化歷史中經(jīng)歷了分布區(qū)擴(kuò)張。同時，調(diào)查發(fā)現(xiàn)該物種擁有兩個譜系分支(圖2)，分子鐘結(jié)果表明譜系間分化和譜系內(nèi)單倍型間的分化都是發(fā)生在第四紀(jì)(圖2)。這就吻合了第四紀(jì)氣候震蕩促使了研究區(qū)域內(nèi)植物遺傳分化這一推論[16,20]。模擬白喉烏頭LGM時期分布區(qū)指出該物種冰期避難所存在于西天山地區(qū)的南部山地(圖4c)。從單倍型分布和分布區(qū)模擬結(jié)果來看，ZS、TKS、GL、NLT、WLST和GNS這6個居群可能充當(dāng)了白喉烏頭的冰期避難所。在研究區(qū)域內(nèi)，盡管在第四紀(jì)冰期時期天山和阿爾泰山地區(qū)并未被大陸冰蓋覆蓋，但是這些山地地區(qū)還是發(fā)育了比較好的山地冰川。末次冰期時期，阿爾泰山的山地冰川下線延伸至海拔1 300～1400 m，而在天山山地冰川下線僅延伸至海拔2 300～2 500 m[29]。故而，西天山南部的居群就充當(dāng)了冰期避難所。當(dāng)間冰期來臨時，白喉烏頭居群就開始擴(kuò)張其分布范圍并向北遷移到阿爾泰山地區(qū)(圖4b，4c)。居群擴(kuò)張時間(34.3～42.9千年以前)也表明該物種在末次盛冰期(LGM)之后經(jīng)歷了居群擴(kuò)張事件。從單倍型分布來看(圖1)，兩個譜系都經(jīng)歷了向北擴(kuò)張過程，而連接天山和阿爾泰山之間的山系則成為白喉烏頭向北擴(kuò)張的通道。

基于白喉烏頭的生物學(xué)特性和空間遺傳結(jié)構(gòu)特征，該植物擁有克隆生殖方式以及一個果實內(nèi)可產(chǎn)出多枚種子的高擴(kuò)散能力。白喉烏頭為多年生草本，而且它可以在每年春季時從根部長出許多克隆植株[30]。在退化草原的土壤種子庫里，白喉烏頭的種子密度可以占到35%[30]。這些生物學(xué)特征都可以提升白喉烏頭的擴(kuò)張能力。從模擬的分布區(qū)來看，研究區(qū)內(nèi)所有的山地地區(qū)都適合白喉烏頭的生存(圖4c)。與現(xiàn)在分布相比，未來氣候條件下(2050年和2070年)該物種的潛在分布區(qū)都不會發(fā)生太大變化(圖4)。這主要是由于白喉烏頭以較濕潤的山地生境為主。刀切法檢驗也表明降水因素在決定白喉烏頭生態(tài)位中起到關(guān)鍵作用。而研究區(qū)內(nèi)的干旱盆地地區(qū)，如準(zhǔn)噶爾盆地地區(qū)，則不適應(yīng)該物種的生長。

4 結(jié)論

白喉烏頭由于具有高的擴(kuò)散能力在研究區(qū)天然草地上廣泛分布，并且對當(dāng)?shù)匦竽翗I(yè)生產(chǎn)帶來危害。該物種的空間遺傳結(jié)構(gòu)格局，如低的遺傳多樣性水平(表1)以及17個居群都共享一個單倍型H2(圖1)，與其克隆生殖和長的生存期等生活史特征密切相關(guān)。同時，異交的繁育模式也促使其居群內(nèi)出現(xiàn)較高的遺傳變異?；诜肿隅姾头植紖^(qū)模擬結(jié)果，白喉烏頭現(xiàn)代的分布格局是由于第四紀(jì)氣候變化導(dǎo)致。在未來氣候變化條件下，該物種的潛在分布區(qū)不會發(fā)生太大變化。

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Studies on genetic diversity and structure of a poisonous plant (Aconitum leucostomum)

ZHANG Hong-Xiang1，ZHANG Ming-Li1,2

(1.KeyLaboratoryofBiogeographyandBioresourceinAridLand,XinjiangInstituteofEcologyandGeography,ChineseAcademyofSciences,Urumqi830011,China； 2.InstituteofBotany,ChineseAcademyofSciences,Beijing100093,China)

Aconitumleucostomumis a widespread poisonous plant in grasslands of Xinjiang and causes a serious risk to the local animal husbandry.This plant has high dispersal ability and high reproductive capacity.In this study,we investigated the spatial genetic pattern and the demographic history of 17 populations from Tianshan and Altai Mountains based on sequenced cpDNA region.The genetic diversity were computed for each population，the proportions of genetic variations occurred among populations or within populations were estimated based on analysis of molecular variance (AMOVA) method，The historical demographic expansions of this species was tested by pairwise mismatch distribution analysis.Finally,the potential distributions of this species were modeled using the maximum entropy approach based on different climatic periods.Results showedA.leucostomumowned low level of genetic diversity (Hd = 0.343 7±0.048 8) and dominated by one haplotype in all populations.Genetic variation was almost equally distributed among populations and within populations (58.25% vs.41.75%).The characters of genetic structure were related with the life history traits of this poisonous species,such as clonal reproduction,long life cycle and outcrossing mode of reproduction.Molecular dating indicated the Quaternary glacial periods triggered divergence between two phylogenetic lineages.Species distribution modeling predicted this poisonous species owned LGM regugia at the western Tianshan Mounatins and will not change potential distributions during the future climatic scenarios (the 2050s and the 2070s).

Aconitumleucostomum;genetic structure;phylogeography;weed species;demographic history

2016-08-27；

2016-09-30

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金面上項目(2015211A050)資助

張宏祥(1986-)，男，湖南沅陵縣人，博士，助理研究員，主要從事干旱區(qū)植物地理與植物資源學(xué)研究。 E-mail：zhanghx561@ms.xjb.ac.cn 張明理為通訊作者。

S 812；Q 783

A

1009-5500(2016)06-0001-08