柏玉晶，張貞明，姚玉玲，薛 莉，張振粉，楊成德

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院 ，甘肅 蘭州 730070； 2.甘肅省草原技術(shù)推廣總站， 甘肅 蘭州 730010；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

紫花苜蓿根腐新病原-厚垣鐮孢菌生物學(xué)特性研究

柏玉晶1，張貞明2，姚玉玲1，薛 莉1，張振粉3，楊成德1

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院 ，甘肅 蘭州 730070； 2.甘肅省草原技術(shù)推廣總站， 甘肅 蘭州 730010；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

針對(duì)紫花苜蓿根腐致病菌厚垣鐮孢菌(Fusariumchlamydosporum)在不同溫度、光照、pH和多種碳氮源條件下的生物學(xué)特性，采用菌餅法進(jìn)行了測(cè)定，并對(duì)不同碳氮源下菌落產(chǎn)色素情況進(jìn)行了連續(xù)觀察。結(jié)果表明：該病原菌在5～40℃均可生長(zhǎng)，最適溫度為25℃；當(dāng)pH 4.0～12.0時(shí)均能生長(zhǎng)，最適宜pH為7.0；全黑暗條件有利于菌絲生長(zhǎng)，菌絲生長(zhǎng)最適碳源、氮源分別為山梨醇和蛋白胨，碳源氯醛糖及除蛋白胨以外8種氮源均不利于菌絲的生長(zhǎng)。含不同碳氮源培養(yǎng)基可誘導(dǎo)菌絲產(chǎn)生不同色素，且顏色變化差異大，在不同的生長(zhǎng)階段，色素顏色也會(huì)發(fā)生變化。

苜蓿根腐病；厚垣鐮刀菌；生物特性；色素

紫花苜蓿(Medicagosativa)耐干旱貧瘠，再生性強(qiáng)，產(chǎn)草量高，粗蛋白含量高，素有牧草之王的稱號(hào)，是畜牧業(yè)首選青飼料，在世界各國(guó)廣泛種植。近幾年，隨著我國(guó)草地畜牧業(yè)的發(fā)展和農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，苜蓿種植面積逐步擴(kuò)大，已居世界第6位。但是由于我國(guó)苜蓿品種單一和利用年限的增長(zhǎng)，尤其是苜蓿根腐病發(fā)生日趨嚴(yán)重，已嚴(yán)重威脅到苜蓿產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[1]。據(jù)報(bào)道，苜蓿根腐病在美國(guó)、加拿大、澳大利亞、俄羅斯、日本和阿根廷等國(guó)家[2-7]及國(guó)內(nèi)新疆、甘肅、青海和內(nèi)蒙古等地嚴(yán)重發(fā)生[8-11]，全世界每年造成的產(chǎn)量損失在20%，嚴(yán)重發(fā)生的地塊達(dá)到40%[12]，使苜蓿固氮能力降低，植株衰弱，單產(chǎn)和品質(zhì)下降。國(guó)內(nèi)外先后報(bào)道的苜蓿根腐病病原菌中鐮孢菌達(dá)14種，國(guó)內(nèi)報(bào)道有尖孢鐮孢(F.oxysporum)、銳頂鐮孢(F.acuminatum)、半裸鐮孢(F.semitectum)、茄鐮孢(F.solani)、串珠鐮孢(F.moniliforme)和擬枝孢鐮孢菌(F.sporotrichioide)[8,13-14]。從試驗(yàn)前期研究發(fā)現(xiàn)，從甘肅省苜蓿根腐病樣分離獲得的厚垣鐮孢菌(F.chlamydosporum)經(jīng)致病性測(cè)定發(fā)病率達(dá)75%，可引發(fā)苜蓿根腐病，據(jù)報(bào)道該病原菌還可引起多種植物病害[15-18]。因此，為了有效防控由病菌引起的苜蓿根腐病，試驗(yàn)對(duì)厚垣鐮孢菌的生物學(xué)特性開展了研究，并對(duì)碳氮源利用能力及產(chǎn)色素情況進(jìn)行觀察，以期為明確該病害的發(fā)生規(guī)律及防控措施的制定提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試菌種

供試菌株厚垣鐮刀菌由植物病理實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 溫度對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響

菌株25℃恒溫培養(yǎng)5 d，用直徑5 mm的打孔器于菌落邊緣打取菌餅接于PDA平板中央，分別置于0～45℃(間隔5℃)恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3次重復(fù)，第5 d用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，利用SSPSS 19.0軟件和Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析。

1.3 光照對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響

設(shè)24 h/d連續(xù)光照、12 h光照12 h黑暗光暗交替和24 h/d全黑暗3個(gè)處理，將5 mm的菌餅接種于PDA平板中央，最適溫度下培養(yǎng)，3次重復(fù)，其他方法同1.2。

1.4 pH對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響

用0.1%的HCl和0.1%的NaOH將PDA培養(yǎng)基pH調(diào)節(jié)至4.0～12.0(間隔1.0)，最適溫度下培養(yǎng)，3次重復(fù)，其他方法同1.2。

1.5 碳、氮源對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：KH2PO40.5 g、K2HPO40.6g、MgSO4·7H2O 0.5 g、NaCl 0.1 g、CaCl20.1g、水1 000 mL和瓊脂12 g。

1.5.1 碳源對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響 基礎(chǔ)培養(yǎng)基加入0.5%蛋白胨，再分別加入葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、木糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、氯醛糖、2%可溶淀粉9種碳源，配制含不同碳源的固體培養(yǎng)基，以無碳源為對(duì)照，最適溫度下培養(yǎng)，3次重復(fù)，其他方法同1.2，并拍照。

1.5.2 氮源對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響 基礎(chǔ)培養(yǎng)基加入葡萄糖(2%)，再分別加入天門冬酰胺、甘氨酸、L -酪氨酸、蛋白胨、尿素、KNO3、NH4NO3、NH4Cl、0.5%NH4H2PO49種氮源，配置含不同氮源的固體培養(yǎng)基，以不含氮源為對(duì)照，最適溫度下培養(yǎng)，3次重復(fù)，其他方法同1.2。

1.5.3 不同碳氮源培養(yǎng)對(duì)菌落產(chǎn)色素的影響 連續(xù)觀察不同碳氮源培養(yǎng)條件下菌落產(chǎn)色素情況及色素變化狀況。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響

菌株在5～40℃均可生長(zhǎng)，0～25℃菌絲生長(zhǎng)速率隨溫度的升高顯著升高，30～40℃顯著下降(P<0.05)，其中，在25℃時(shí)菌落直徑可達(dá)8.03 cm，顯著高于其他溫度條件，為最適生長(zhǎng)溫度；0℃和45℃菌絲不生長(zhǎng)(圖1)。

圖1 溫度處理下病原菌菌絲的生長(zhǎng)狀況Fig.1 Effect of tempreture on mycelium growth

2.2 光照對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響

全黑暗條件下菌絲生長(zhǎng)最快，培養(yǎng)5 d菌落直徑可達(dá)7.07 cm，顯著高于全光照和光暗交替條件(P<0.05)，表明黑暗有利于菌絲生長(zhǎng)，光照對(duì)病原菌菌絲的生長(zhǎng)有一定的抑制作用(圖2)。

圖2 光照處理下病原菌菌絲的生長(zhǎng)狀況Fig.2 Effect of illumination on mycelium growth

2.3 pH對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響

菌絲在pH 4.0～12.0均可生長(zhǎng)，pH為7.0時(shí)菌絲生長(zhǎng)最快，菌落直徑可達(dá)7.70 cm，在pH 6.0～9.0菌絲生長(zhǎng)速率差異不顯著(圖3)。

圖3 pH處理下病原菌菌絲的生長(zhǎng)狀況Fig.3 Effect of PH on mycelium growth

2.4 碳、氮源對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響

2.4.1 碳源對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響 菌絲均生長(zhǎng)較快，在第5 d時(shí)菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿，其中，以山梨醇為碳源的培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)最快，菌落直徑達(dá)8.42 cm，其次為甘露醇和麥芽糖，菌落直徑分別為8.28和8.23 cm；D-木糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖培養(yǎng)基菌落直徑均明顯大于對(duì)照，但可溶性淀粉和氯醛糖對(duì)菌絲生長(zhǎng)有抑制作用，其中氯醛糖顯著低于其他碳源，且菌絲稀薄，近透明；在含不同碳源培養(yǎng)基上菌落均為圓形，D-木糖、葡萄糖和蔗糖培養(yǎng)基菌落邊緣不整齊。試驗(yàn)結(jié)果表明，山梨醇是F.Chlamydosporum生長(zhǎng)的最佳碳源，氯醛糖對(duì)菌絲生長(zhǎng)有明顯的抑制作用(表1)。

表1 碳氮源處理下菌絲的生長(zhǎng)
Fig.1 Effect of C-source and N-source on the mycelial ofFusariumchlamydosporum

碳源菌落直徑/cm氮源菌落直徑/cm山梨醇8．42a蛋白胨7．82a甘露醇8．28abCK6．63b麥芽糖8．23b硝酸鉀6．28cD?木糖7．93c甘氨酸5．45d葡萄糖7．82cL?酪氨酸4．97e蔗糖7．67d天門冬氨酸4．87e乳糖7．6d硝酸銨4．37fCK7．27e尿素3．67g可溶性淀粉7．25e氯化銨2．5k氯醛糖2．58f磷酸二氫銨2．38k

2.4.2 氮源對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響 在以蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基上，菌落直徑達(dá)7.82 cm，與對(duì)照差異顯著(P<0.05)，有顯著的促進(jìn)作用，硝酸鉀、甘氨酸、L-酪氨酸、天門冬氨酸、硝酸銨、尿素、氯化銨和磷酸二氫氨均對(duì)該菌的生長(zhǎng)有顯著抑制作用(P<0.05)，其中磷酸二氫氨對(duì)菌絲生長(zhǎng)抑制能力最強(qiáng)(表1)。在含不同氮源培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d后，對(duì)照菌落圓形，菌絲白色、絨毛狀、稀疏；尿素培養(yǎng)基菌落圓形，氣生菌絲致密；蛋白胨、硝酸鉀、甘氨酸、L-酪氨酸和天門冬氨酸培養(yǎng)基菌落近圓形，邊緣不整齊，硝酸銨、氯化銨和磷酸二氫氨培養(yǎng)基菌落不規(guī)則。試驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn).Chlamydosporum生長(zhǎng)的最佳氮源為蛋白胨這種有機(jī)氮，其次硝態(tài)氮和銨態(tài)氮，且多數(shù)硝態(tài)氮和銨態(tài)氮都不利于該菌生長(zhǎng)。

2.4.3 不同碳氮源培養(yǎng)對(duì)菌落產(chǎn)色素的影響 甘露醇、麥芽糖、D-木糖、葡萄糖、蔗糖和可溶性淀粉均可促使菌落產(chǎn)生橘黃至橘紅色色素，其中葡萄糖和蔗糖色素產(chǎn)量最大，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)培養(yǎng)基背面整體變?yōu)樽丶t色，菌絲也由白色變?yōu)榈丶t色，并產(chǎn)生大量棕紅色顆粒狀子實(shí)體；山梨醇培養(yǎng)基由淡紫紅色逐漸變?yōu)樽仙磷虾谏?；?duì)照無色素產(chǎn)生(圖4)。

蛋白胨、甘氨酸、L-酪氨酸、天門冬氨酸和硝酸銨培養(yǎng)基均能產(chǎn)生橘黃色色素，隨著時(shí)間的增長(zhǎng)色素顏色加深，直至培養(yǎng)基背面全部變色，其中相同時(shí)間段內(nèi)蛋白胨產(chǎn)色素最多，由橘黃色變?yōu)殚偌t色；氯化銨和磷酸二氫銨雖然菌絲生長(zhǎng)緩慢，但是培養(yǎng)基背面完全為橘紅色；硝酸鉀培養(yǎng)基產(chǎn)生黃綠色色素，后期培養(yǎng)基背面逐漸全部變?yōu)辄S綠色、綠色至黑綠色(圖5)。

試驗(yàn)結(jié)果說明，含不同碳氮源培養(yǎng)基可誘導(dǎo)菌絲產(chǎn)生不同色素，且顏色變化差異大；在不同的生長(zhǎng)階段，色素顏色亦會(huì)發(fā)生變化，因此，生產(chǎn)上可以根據(jù)需求，對(duì)不同階段的色素進(jìn)行研究利用。

圖4 不同碳源培養(yǎng)下菌落產(chǎn)色素狀況Fig.4 The pigmeng production of Fusarium Chlamydosporum in different C-source注：a.山梨醇;b.甘露醇;c.麥芽糖;d.D-木糖;e.葡萄糖;f.蔗糖;g.乳糖;h.CK;i.可溶性淀粉;j.氯醛糖

3 討論

苜蓿根腐病是一種典型的土傳病害，病原種類較多，國(guó)內(nèi)外先后報(bào)道的該病病原已達(dá)29種，但主要由鐮孢菌屬真菌引起。其病原菌對(duì)植物體的侵染一方面取決于其自身結(jié)構(gòu)功能和產(chǎn)生的多種次生代謝產(chǎn)物對(duì)植株的影響，如真菌菌絲可穿透植物表皮細(xì)胞進(jìn)入植物體，Rocha等從玉米上分離的輪枝鐮孢菌代謝產(chǎn)生的伏馬菌素、AAL毒素具有很強(qiáng)的毒性，能殺死植物細(xì)胞核；另一方面也決定于溫度、光照、pH等環(huán)境因素的變化，適宜的環(huán)境因素能促進(jìn)真菌菌絲生長(zhǎng)，菌核萌發(fā)，進(jìn)而侵染植物體，使植株發(fā)病。因此，病原菌生物學(xué)特性的研究是掌握其發(fā)病規(guī)律的基礎(chǔ)，本試驗(yàn)對(duì)不同溫度、光照、pH、碳、氮源下苜蓿根腐病病原菌-厚垣鐮刀菌菌絲的生長(zhǎng)進(jìn)行了研究，結(jié)果表明：該菌在溫度5～40℃和pH 4.0～12.0均可生長(zhǎng)，在過酸過堿條件下菌絲體仍生長(zhǎng)良好，菌絲發(fā)達(dá)而致密，說明厚垣鐮孢菌對(duì)環(huán)境有較強(qiáng)的適應(yīng)性，可耐高溫和酸堿，因而只要條件適宜，其可在苜蓿的各個(gè)生育期進(jìn)行侵染；在黑暗條件下菌絲生長(zhǎng)最快，而土壤的不透光性正為其生長(zhǎng)提供了有利條件。碳源為真菌生長(zhǎng)提供了碳素，其氧化過程也為真菌基本生命活動(dòng)提供了能源，該病原菌喜好山梨醇和甘露醇而較少利用多數(shù)真菌喜歡的葡萄糖、蔗糖等糖類，其可能是因?yàn)榫z的生長(zhǎng)受到了環(huán)境因素的誘導(dǎo)而產(chǎn)生了能分解醇類的酶，該酶在分解醇類過程中可釋放更多的能量供菌絲生長(zhǎng)[17-18]。在氮源的利用上，該菌能更好的利用蛋白胨這種有機(jī)氮，對(duì)硝態(tài)氮的利用率低，極不喜好銨態(tài)氮，而銨是參與菌株生長(zhǎng)代謝的直接底物，多數(shù)真菌優(yōu)先利用銨態(tài)氮作為氮素營(yíng)養(yǎng)[19]，潘紅等[20]研究報(bào)道尖孢鐮刀菌對(duì)氮素的有效利用順序?yàn)椋轰@態(tài)氮>有機(jī)氮>硝態(tài)氮，因此，銨態(tài)氮為什么能制約厚垣鐮孢菌菌絲生長(zhǎng)有待研究，有報(bào)道施氮40 kg/hm2苜蓿干草產(chǎn)量會(huì)顯著升高。

圖5 不同碳源培養(yǎng)下菌落產(chǎn)色素Fig.5 The pigmeng production of Fusarium Chlamydosporum in different N-source注：a.蛋白胨;b.CK;c.硝酸鉀;d.甘氨酸;e.L-酪氨酸;f.天門冬氨酸;g.硝酸銨;h.尿素;i.氯化銨;j.磷酸二氫銨

色素廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品等多種工業(yè)領(lǐng)域[21]，近年來，隨著人民生活理念的轉(zhuǎn)變，人們開始注重色素的品質(zhì)，天然色素的開發(fā)和應(yīng)用有了較大發(fā)展。張銀[22]發(fā)現(xiàn)，絲狀真菌中存在大量可食用色素，王風(fēng)琴等[23]從一株南極真菌中分離得到一種色素，并做了小鼠的毒力測(cè)定，確定該色素為可食用色素。真菌色素與其致病力和真菌耐藥性有密切關(guān)系，有增強(qiáng)致病真菌侵襲毒力和誘生真菌耐藥性的雙重作用，侯幼紅等[24]報(bào)道真菌色素與其菌株的生理代謝和致病性密切相關(guān)，是致病性真菌主要的致病毒力因子之一。

4 結(jié)論

(1)試驗(yàn)明確了不同環(huán)境因素對(duì)菌絲的生長(zhǎng)的影響，為苜蓿根腐病的準(zhǔn)確預(yù)報(bào)和合理防治提供理論依據(jù)，但有關(guān)不同環(huán)境因素對(duì)厚垣鐮孢菌產(chǎn)孢的影響及苜蓿根腐病的田間防治方法等需在今后做進(jìn)一步研究。

(2)對(duì)不同碳氮源條件下菌株的產(chǎn)色素情況進(jìn)行了初步觀察，結(jié)果表明不同碳氮源和不同的培養(yǎng)時(shí)間均可促使該病原菌產(chǎn)生不同色素，但為確定不同色素是否與菌株生理代謝和致病性有關(guān)，是否能用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域，還需對(duì)色素種類、產(chǎn)量、產(chǎn)生原因及功能等做進(jìn)一步研究。

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Biological characteristics of Fusarium chlamydosporum, a new pathogen cause alfalfa root rot

BAI Yu-jing1，ZHANG Zhen-ming2,YAO Yu-ling1，XUE Li1，ZHANG Zhen-fen3,YANG Cheng-de1

(1.Collegeofplantprotection,GansuAgriculturalUniversity，Lanzhou730070,China； 2.Gansugrasslandtechnicalextensionstation,Lanshou730010； 3.CollegeofPrataculturalScience,GansuAgriculturalUniversity/KeyLaboratoryofGrasslandEcosystem，MinistryofEducation/PrataculturalEngineeringLaboratoryofGansuProvince/Sino-U.S.CentersforGrazinglandEcosystemSustainability,Lanzhou730070,China)

This study used fungus cake method to determinate the biological characteristics ofFusariumchlamydosporumunder different condition in term of temperature,illumination,pH value,C-sources and N-sources,and observed the situation of pigment produced by mycelium in different C-sources and N-sources.The result showed that the pathogen can grow when the range of temperature from 5℃ to 40℃,and the optimum temperature was 25℃.It can grow when the range of pH were 4.0～12.0,and the optimum pH was 7.0.All dark condition promotes the mycelium growth.The optimum C- sources and N-sources were sorbitol and peptone,C-sources chloralose and other eight kinds of N-sources beside peptone all limited the mycelium's growth.Mycelium can produce different pigment in different C-sources and N-sources,and the change of pigment had great difference.At different growth stages,the color of the pigment was also changed.

alfalfa root rot；Fusariumchlamydosporum；biological characteristics；pigment

2016-01-11；

2016-04-11

甘肅省農(nóng)牧廳項(xiàng)目；國(guó)家自然科學(xué)基金(314 60639)和甘肅省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(145RJZA130)資助

柏玉晶(1989-),女,甘肅景泰人,在讀碩士研究生。 E-mail：1345491709@qq.com 楊成德為通訊作者。

S 435.4

A

1009-5500(2016)06-0049-06