劉加強(qiáng)，彭旭東，劉德軍

(中央軍委聯(lián)合參謀部警衛(wèi)局保健處，北京 100017)

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·綜述·

基因測(cè)序技術(shù)在腫瘤診療中的應(yīng)用進(jìn)展

劉加強(qiáng)，彭旭東，劉德軍

(中央軍委聯(lián)合參謀部警衛(wèi)局保健處，北京 100017)

腫瘤是當(dāng)今導(dǎo)致人類主要死亡的主要疾病之一。由于其發(fā)病隱匿、治療方法局限、多數(shù)預(yù)后不良，且分子生物學(xué)特征復(fù)雜多變，因而腫瘤的預(yù)防、早期篩查與診斷、個(gè)體化治療、預(yù)后評(píng)估一直是臨床醫(yī)生致力于解決的關(guān)鍵問題。研究已證實(shí)，腫瘤多存在基因的改變，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基因測(cè)序技術(shù)取得長(zhǎng)足進(jìn)步，這對(duì)上述難題的解決起到巨大的推動(dòng)作用[1-4]。本文就基因測(cè)序技術(shù)在腫瘤診療中的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 基因測(cè)序技術(shù)的概述

第一代基因測(cè)序技術(shù)出現(xiàn)于20世紀(jì)70年代，標(biāo)志性技術(shù)是由Sanger和Gilbert等人發(fā)明的鏈終止法和化學(xué)降解法，已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究中，如人類基因組計(jì)劃即是采用第一代測(cè)序技術(shù)，總共測(cè)量了人類基因組中約30億個(gè)堿基對(duì)，發(fā)現(xiàn)大量與疾病有關(guān)的基因，為疾病的診斷與治療提供了大量信息[5-7]。第一代基因測(cè)序技術(shù)方法簡(jiǎn)便快捷，但測(cè)序通量低，操作過程復(fù)雜且費(fèi)用高，在大樣本測(cè)序上也存在諸多困難。

第二代基因測(cè)序技術(shù)又稱高通量或深度測(cè)序技術(shù)，其典型代表包括454測(cè)序技術(shù)、Illumina測(cè)序技術(shù)和SOLID測(cè)序技術(shù)[8]。第二代測(cè)序技術(shù)最大的優(yōu)勢(shì)就是高通量，可進(jìn)行基因組、轉(zhuǎn)錄組和表觀遺傳學(xué)方面的檢測(cè)。第二代基因測(cè)序技術(shù)成本低，費(fèi)用只相當(dāng)于第一代的1%，從而推動(dòng)了基因測(cè)序技術(shù)的普及。如今，第二代測(cè)序技術(shù)已成為應(yīng)用最為廣泛的測(cè)序技術(shù)，首張癌癥基因組圖譜(TCGA)、千種單基因病研究計(jì)劃等陸續(xù)啟動(dòng)，為生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展起到巨大的推動(dòng)作用。但由于其讀長(zhǎng)偏短(100～500 bp)且制備測(cè)序樣本時(shí)需要經(jīng)過PCR擴(kuò)增，而這一過程可能引起突變而影響準(zhǔn)確性[9]。

第三代基因測(cè)序技術(shù)以單分子實(shí)時(shí)測(cè)序(SMRT)和納米孔技術(shù)為標(biāo)志。其中，單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)采用熒光標(biāo)記脫氧核苷酸，通過顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察DNA合成時(shí)熒光強(qiáng)度的變化而檢測(cè)堿基序列[10-11]；納米孔技術(shù)利用電泳技術(shù)驅(qū)動(dòng)單個(gè)分子逐一通過納米孔而實(shí)現(xiàn)測(cè)序[12-13]。第三代基因測(cè)序技術(shù)具有高通量、長(zhǎng)度長(zhǎng)(達(dá)14 000 bp)、樣本不需要PCR擴(kuò)增、可以檢測(cè)極細(xì)微的差異以及小型化的優(yōu)點(diǎn)，但其出錯(cuò)率較高，需要重復(fù)多次檢測(cè)才能保證較高的準(zhǔn)確率[14]。隨著技術(shù)的進(jìn)步，上述問題有望早日得到解決，從而達(dá)到一人一個(gè)基因組乃至多個(gè)基因組的目標(biāo)。

2 基因測(cè)序技術(shù)在腫瘤診療中的應(yīng)用

2.1 腫瘤篩查與診斷 盡管近年來基因測(cè)序技術(shù)發(fā)展迅速，但其在腫瘤的篩查與診斷方面的臨床應(yīng)用仍十分有限[15]。目前，腫瘤的篩查主要以腫瘤標(biāo)記物檢測(cè)、體格檢查以及常用的影像學(xué)檢查為主，而腫瘤診斷的金標(biāo)準(zhǔn)為病理學(xué)診斷。隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步和檢測(cè)成本的持續(xù)降低，基因測(cè)序技術(shù)常規(guī)應(yīng)用于腫瘤篩查和診斷將為腫瘤的預(yù)防和早期治療提供幫助。通過檢測(cè)個(gè)體DNA序列可以發(fā)現(xiàn)基因組的異常變異，從而可以評(píng)估腫瘤疾患的風(fēng)險(xiǎn)。美國(guó)23andMe公司于2007年即開始向大眾提供基因檢測(cè)服務(wù)，內(nèi)容包括始祖分析、基因?qū)びH、酒精耐受、藥物過敏、遺傳病篩查和疾病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。通過基因組測(cè)序篩查癌癥等疾病開始被美國(guó)民眾(包括部分名人)所采用。但由于數(shù)據(jù)解讀的準(zhǔn)確性以及倫理爭(zhēng)議，F(xiàn)DA于2013年叫停了與健康有關(guān)的數(shù)據(jù)解讀服務(wù)，但于2015年又重新批準(zhǔn)23andMe公司開展遺傳病的基因檢測(cè)，如布魯姆綜合征(一種可能導(dǎo)致身材矮小并癌癥高發(fā)的疾病)。目前，國(guó)內(nèi)個(gè)別醫(yī)療機(jī)構(gòu)也開始進(jìn)行基因測(cè)序篩查癌癥的臨床試點(diǎn)工作，采用的技術(shù)為循環(huán)游離腫瘤DNA測(cè)序技術(shù)。

循環(huán)游離腫瘤DNA(ctDNA)測(cè)序技術(shù)是液體活檢的一種，與現(xiàn)有的組織活檢技術(shù)不同，其通過檢測(cè)外周血或體液標(biāo)本中ctDNA可以在疾病早期檢出腫瘤[16]。早在1998年就有研究證實(shí)了利用ctDNA診斷癌癥的可行性。在結(jié)腸癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、膀胱癌和頭頸部癌等癌癥中，ctDNA中包含DNA點(diǎn)突變、甲基化、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性等諸多變異信息[17]。但由于傳統(tǒng)檢測(cè)方法的局限性，只能針對(duì)某一個(gè)或幾個(gè)特定的基因進(jìn)行檢測(cè)，從而限制了其在癌癥診斷領(lǐng)域的應(yīng)用。高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展使得研究者能夠?qū)tDNA進(jìn)行全基因組測(cè)序[18]。Dawson等[19]證實(shí)采用基因測(cè)序技術(shù)檢測(cè)ctDNA在監(jiān)測(cè)腫瘤負(fù)荷的敏感性和動(dòng)態(tài)性方面均優(yōu)于傳統(tǒng)的腫瘤標(biāo)記物檢測(cè)和循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)。該研究提示利用基因測(cè)序技術(shù)檢測(cè)ctDNA有望成為腫瘤患者早期診斷的有力手段。

2.2 腫瘤個(gè)體化治療 個(gè)體化治療一直是腫瘤治療過程中的熱點(diǎn)問題，高通量基因測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)推動(dòng)了腫瘤個(gè)體化治療的進(jìn)展。部分腫瘤患者基因組存在特征性的改變，如甲基化水平的改變，KRAS、EGFR、TP53、BRCA1、BRCA2基因突變等[20]。通過高通量測(cè)序技術(shù)可以精確檢測(cè)出這些變異，從而幫助制訂個(gè)體化的治療措施，包括分子靶向藥物或通路靶向藥物的使用和放化療的應(yīng)用[21]。同時(shí)，采用高通量測(cè)序技術(shù)比較腫瘤原發(fā)灶與復(fù)發(fā)灶基因序列的差異，可以幫助評(píng)估化療效果和了解耐藥的潛在機(jī)制[22]。既往腫瘤患者的基因測(cè)序取材手段主要為組織活檢，但該方式的有創(chuàng)性會(huì)影響對(duì)基因狀況的實(shí)時(shí)觀察，同時(shí)由于腫瘤存在異質(zhì)性，單一部位的活檢并不能反映腫瘤的全貌；采用高通量測(cè)序技術(shù)無創(chuàng)性檢測(cè)ctDNA將會(huì)很好地解決上述問題[16,23]。Uchida[24]和Sober等[25]證實(shí)對(duì)肺癌患者ctDNA進(jìn)行深度測(cè)序可確定其表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)分型，從而決定是否使用酪氨酸激酶抑制劑(TKIs)進(jìn)行靶向治療。Liao等[26]采用高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)肝癌患者ctDNA，證實(shí)其可預(yù)測(cè)無復(fù)發(fā)生存期，并可克服腫瘤異質(zhì)性的限制。通過高通量測(cè)序技術(shù)監(jiān)測(cè)編碼免疫球蛋白受體的ctDNA片段可比影像學(xué)檢查更早發(fā)現(xiàn)彌漫性B淋巴瘤的復(fù)發(fā)，同時(shí)還可提供腫瘤異質(zhì)性、克隆演變進(jìn)程和耐藥機(jī)制方面的信息，從而指導(dǎo)淋巴瘤的個(gè)體化治療[27]。由于基因測(cè)序技術(shù)在取材手段和方式方法的不斷更新，其必將在腫瘤個(gè)體化治療中發(fā)揮舉足輕重的作用，從而開啟精準(zhǔn)醫(yī)療的新篇章。

3 存在的問題及展望

雖然基因測(cè)序技術(shù)可以幫助人類了解更多腫瘤相關(guān)的基因信息，從而推動(dòng)腫瘤篩查、診斷與治療的發(fā)展，但由于疾病與基因并非嚴(yán)格對(duì)應(yīng)的關(guān)系，其可能還會(huì)受到環(huán)境因素等的影響，故單純通過基因測(cè)序的方法檢測(cè)基因變異來預(yù)測(cè)和診斷腫瘤有一定局限性。同時(shí)，由于腫瘤單分子靶向治療的耐藥性，故還需要通過基因測(cè)序技術(shù)深入了解腫瘤分子生物學(xué)特征，從而尋找更多有效的靶點(diǎn)，采取聯(lián)合治療的策略[28]。隨著基因測(cè)序技術(shù)成本的降低，基因測(cè)序技術(shù)必將普遍應(yīng)用于大眾，但由此可能會(huì)引起的個(gè)人基因組信息的泄露，從而導(dǎo)致保險(xiǎn)、就業(yè)歧視等一系列社會(huì)問題，尚需制訂和完善相關(guān)法律法規(guī)來規(guī)范其應(yīng)用。由于測(cè)序結(jié)果所包含信息的復(fù)雜性與海量性，如何正確地向受試者解讀這些數(shù)據(jù)，避免引起其不必要的擔(dān)憂也尤為重要[29]。目前使用的基因測(cè)序技術(shù)仍以高通量基因測(cè)序技術(shù)為主導(dǎo)，但多數(shù)第二代測(cè)序平臺(tái)具有讀長(zhǎng)短的缺陷，從而影響到基因重復(fù)序列和插入缺失檢測(cè)的準(zhǔn)確性。第三代測(cè)序技術(shù)雖然有望解決這一問題，但其仍處于研發(fā)階段，距大規(guī)模應(yīng)用還有較長(zhǎng)的時(shí)間。同時(shí)，基因測(cè)序技術(shù)越來越高通量的發(fā)展趨勢(shì)也對(duì)計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理能力提出了更高的要求，如何恰當(dāng)?shù)仄ヅ鋬烧咭彩秦酱鉀Q的問題[30]。

基因測(cè)序技術(shù)作為一種高通量基因檢測(cè)技術(shù)，可大規(guī)模、準(zhǔn)確地檢測(cè)腫瘤基因組、轉(zhuǎn)錄組及表觀遺傳學(xué)的改變，從而為腫瘤發(fā)生機(jī)制的研究和臨床診療提供強(qiáng)有力的平臺(tái)。隨著測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展、取材手段的改進(jìn)(如液體活檢ctDNA)、計(jì)算機(jī)技術(shù)的匹配，人類通過基因測(cè)序的方法常規(guī)進(jìn)行腫瘤篩查、預(yù)防、診斷和治療的目標(biāo)終將實(shí)現(xiàn)。

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劉加強(qiáng)，主任醫(yī)師，Email：fhong.ok@163.com

劉德軍，主任醫(yī)師，Email：liudejun6721@126.com

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10.3969/J.issn.1672-6790.2016.05.032

2016-07-02)