陳　敏，　張明升△，　張軒萍，　梁月琴

(山西醫(yī)科大學(xué) 1藥理學(xué)教研室， 2機能實驗室，山西 太原 030001)

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肢體缺血預(yù)適應(yīng)減輕人臍靜脈內(nèi)皮細胞的氧化應(yīng)激損傷*

陳敏1，張明升1△，張軒萍1，梁月琴2

(山西醫(yī)科大學(xué)1藥理學(xué)教研室，2機能實驗室，山西 太原 030001)

[摘要]目的： 探討肢體缺血預(yù)適應(yīng)對氧化應(yīng)激損傷的血管內(nèi)皮是否具有保護作用。方法: 人臍靜脈內(nèi)皮細胞分為5組：對照組不加任何處理；模型組給予過氧化氫損傷2 h；早期肢體缺血預(yù)適應(yīng)組、晚期肢體缺血預(yù)適應(yīng)組和假肢體缺血預(yù)適組這3組分別用5%大鼠早期肢體缺血預(yù)適應(yīng)血清、晚期肢體缺血預(yù)適應(yīng)血清和假肢體缺血預(yù)適應(yīng)血清孵育12 h，再用過氧化氫損傷2 h。檢測細胞凋亡情況，培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶的活性，內(nèi)皮細胞表面黏附分子的mRNA水平，血紅素氧合酶1的mRNA和蛋白表達情況。結(jié)果: 大鼠早期肢體缺血預(yù)適應(yīng)和晚期缺血預(yù)適應(yīng)血清可以減輕人臍靜脈內(nèi)皮細胞氧化應(yīng)激所導(dǎo)致的細胞死亡，減少乳酸脫氫酶的釋放，減少內(nèi)皮細胞表面黏附分子的表達，并能增加血紅素氧合酶1的mRNA和蛋白的表達。結(jié)論: 肢體缺血預(yù)適應(yīng)可以減輕血管內(nèi)皮細胞的氧化應(yīng)激損傷。

[關(guān)鍵詞]肢體缺血預(yù)適應(yīng)； 人臍靜脈內(nèi)皮細胞； 氧化應(yīng)激

血管內(nèi)皮細胞是緊貼血管內(nèi)表面的單層細胞，最初認為血管內(nèi)皮細胞只是起簡單的屏障作用，將血液與血管壁的其它組織分隔開。隨著研究的深入，研究人員發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細胞是人體最大的腺體[1]，通過產(chǎn)生各種血管活性物質(zhì)，調(diào)節(jié)血管的張力、血小板的活化、白細胞的黏附等，對維持血管穩(wěn)態(tài)起重要作用[2]。當(dāng)器官發(fā)生缺血再灌注損傷時，血管內(nèi)皮細胞首當(dāng)其沖受到影響，而內(nèi)皮功能的好壞又直接影響到器官的血液灌注和供氧，因此減輕血管內(nèi)皮損傷也是減輕器官損傷的重要環(huán)節(jié)。

肢體缺血預(yù)適應(yīng)(limb ischemic preconditioning，LIPC)不僅可以減輕心、腦等重要臟器的缺血再灌注損傷[3-4]，LIPC還可以改善正常人的血管內(nèi)皮功能[5]，減輕經(jīng)皮冠狀動脈介入治療患者的血管內(nèi)皮損傷[6]。臨床研究中，采用血流介導(dǎo)的舒張功能(flow-mediated dilation，F(xiàn)MD)評價血管內(nèi)皮功能，指標(biāo)單一，缺乏全面詳細的實驗數(shù)據(jù)支持。本實驗通過體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)，并用H2O2制造穩(wěn)定的氧化應(yīng)激損傷模型，采集大鼠LIPC的早期缺血預(yù)適應(yīng)血清和晚期缺血預(yù)適應(yīng)血清來觀察LIPC是否可以減輕內(nèi)皮細胞的氧化應(yīng)激損傷，并初步探討機制。

材料和方法

1動物、細胞和試劑

雄性SD大鼠，體重220～250 g，購自山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，動物合格證號為SCXK (晉) 2009-0001。飼養(yǎng)溫度(22±2) ℃，相對濕度50%～60%，自由飲水及攝食。正常喂養(yǎng)2周后，將大鼠隨機分為3組，每組5只。早期肢體缺血預(yù)適應(yīng)組(early limb ischemic preconditioning，EPC)，晚期肢體缺血預(yù)適應(yīng)組(delayed ischemic preconditioning，DPC)，假肢體缺血預(yù)適應(yīng)組(sham ischemic preconditioning，SPC)。

HUVECs購自上海細胞所。用DMEM高糖培養(yǎng)基(HyClone)加10%的胎牛血清(杭州四季青)常規(guī)培養(yǎng)，2～3 d換液 1 次，待細胞長至80%時，0.25%胰酶(北京索萊寶)消化傳代。

細胞總RNA提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑及熒光定量PCR試劑購自TaKaRa；引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計并合成；血紅素氧合酶1 (heme oxyge-nase-1，HO-1)抗體購自Abcam；乳酸脫氫酶(laetate dehydrogenase， LDH)試劑盒購自南京建成生物工程有限公司；流式雙染試劑盒購自南京凱基生物發(fā)展有限公司。

2方法

2.1大鼠肢體缺血預(yù)適應(yīng)方法及血清的獲取用改良的血壓計套環(huán)套在大鼠右后肢，充氣加壓至200 mmHg，阻斷大鼠右后肢血流，大鼠右后肢發(fā)紫，足背動脈搏動消失，造成后肢缺血，持續(xù)加壓5 min。隨后放氣減壓，大鼠右后肢恢復(fù)正常顏色，足背動脈搏動出現(xiàn)，右后肢血流恢復(fù)，右后肢再灌注，持續(xù)10 min[7-8]。重復(fù)3個循環(huán)。假肢體預(yù)適應(yīng)組大鼠只將右后肢放入套環(huán)，并不充氣加壓阻斷血流。

大鼠麻醉(25%烏拉坦，腹腔注射，1 g/kg)后，腹主動脈無菌采血，4 ℃靜置30 min，3 000 r/min離心15 min，分離得血清，無菌分裝后，置于-80 ℃保存。LIPC后1 h內(nèi)采血，得到血清為早期肢體缺血預(yù)適應(yīng)血清(early limb ischemic preconditioning serum，EPS)，LIPC后24 h采血，得到晚期肢體缺血預(yù)適應(yīng)血清(delayed limb ischemic preconditioning serum，DPS)。

2.2細胞分組HUVECs分為5組：正常對照組(control，C)，常規(guī)培養(yǎng)，不加任何處理措施；模型組(model，M)，用1 mmol/L的H2O2處理2 h；EPS組,用5%的EPS預(yù)孵育12 h，再用1 mmol/L的H2O2處理2 h；DPS組,用5%的DPS預(yù)孵育12 h，再用1 mmol/L的H2O2處理2 h；SPS組，用5%的SPS預(yù)孵育12 h，再用1 mmol/L的H2O2處理2 h。

2.3流式細胞術(shù)檢測各組細胞處理結(jié)束后，用PBS清洗，胰酶消化，收集，離心后用Annexin V-FITC結(jié)合液重懸制成細胞懸液，加入Annexin V-FITC和PI室溫避光孵育10 min后上機檢測。

2.4細胞培養(yǎng)上清液中LDH活性的測定各組細胞處理結(jié)束后，收集細胞培養(yǎng)上清液，1 000 r/min，離心5 min棄去沉淀，用試劑盒檢測LDH的活性。

2.5細胞總RNA的提取和實時熒光定量PCR反應(yīng)按照試劑說明書提取細胞總RNA，經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定18 s和28 s的完整性，用分光光度計定量，按照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄實驗得到cDNA。取一定量的cDNA按照說明書進行熒光定量PCR實驗。所用引物如表1所示。設(shè)定反應(yīng)條件為95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)；95 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s ；95 ℃ 30 s。反應(yīng)結(jié)束，根據(jù)熒光反應(yīng)的閾值，得到Ct值，根據(jù)2-ΔΔCt法計算相對表達量。

表1　引物序列

2.6Western blot實驗細胞接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，各種處理結(jié)束后，棄去培養(yǎng)液，用PBS清洗2遍，加入含有PMSF的細胞裂解液，冰上裂解30 min，(10 000～14 000)×g離心15 min，取上清，分裝于-80 ℃保存。BCA定量后，取50 μg的總蛋白上樣電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉， I抗4 ℃孵育過夜， II抗孵育2～3 h，ECL曝光，底片拍照，用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)分析條帶灰度。用目的蛋白/β-actin的比值代表目的蛋白的相對表達量。

3統(tǒng)計學(xué)分析

用SPSS 13.0 軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間差異的比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用 Bonferroni 法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況

HUVECs各組細胞經(jīng)過處理后，進行流式細胞術(shù)檢測。M組的早期凋亡率、晚期凋亡率和總的死亡率與C組相比均顯著增高(P<0.01)，這表明1 mmol/L H2O2孵育2 h可以引起細胞損傷，模型構(gòu)建成功。如果用5% EPS和DPS 提前孵育12 h，則細胞的早期凋亡率、晚期凋亡率和總的死亡率顯著降低(P<0.01)，而SPS組早期凋亡率、晚期凋亡率和總的死亡率與M組相比，無顯著差異。

Figure 1.The cell viability of HUVECs in all groups analyzed by flow cytometry. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsM.

圖1流式細胞術(shù)分析各組細胞凋亡

2細胞培養(yǎng)上清液中LDH的活性

HUVECs細胞用1 mmol/L的H2O2處理2 h，細胞培養(yǎng)上清液中的LDH活性顯著升高(P<0.01)。與M組相比，用5%的EPS和DPS預(yù)孵12 h，上清液中LDH的活性顯著降低(P<0.01)。SPS組與M組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

3黏附分子的表達

經(jīng)過1 mmol/L H2O2處理 2 h，與對照組相比，M組的ICAM-1和VCAM-1 mRNA的量增加，用EPS和DPS預(yù)處理的細胞ICAM-1和VCAM-1 mRNA的量減少。SPS組與M組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

4HO-1的mRNA和蛋白水平

通過熒光定量PCR的檢測發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過EPS和DPS處理的細胞，HO-1的mRNA與M組相比，顯著增高(P<0.01)，而SPS組與M組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。Western blot檢測結(jié)果表明，與M組相比，EPS和DPS組細胞HO-1蛋白的表達量增高(P<0.05)，而SPS組HO-1蛋白表達與M組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖4。

Figure 2.The activity of LDH in culture medium of all groups. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsM.

圖2各組細胞培養(yǎng)液中LDH的活性

Figure 3.The mRNA levels of VCAM-1 and ICAM-1 detected by real-time PCR. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsM.

圖3各組細胞黏附分子的mRNA 水平

討論

本實驗中用1 mmol/L的H2O2損傷2 h發(fā)現(xiàn)，HUVECs細胞早期凋亡和晚期凋亡及壞死的細胞增多，細胞培養(yǎng)上清液中LDH的含量也明顯增加，HUVECs細胞損傷嚴(yán)重。將EPS和DPS加入HUVECs預(yù)孵12 h，可以明顯減輕H2O2對內(nèi)皮細胞的損傷，凋亡和壞死的細胞減少，LDH的釋放減少，這表明肢體缺血預(yù)適應(yīng)可以減輕內(nèi)皮細胞的氧化應(yīng)激損傷。

血管內(nèi)皮細胞損傷，單核細胞黏附于血管內(nèi)皮是動脈粥樣硬化發(fā)生過程的初始因素。在此過程中，血管內(nèi)皮細胞表面的黏附分子起重要作用。內(nèi)皮損傷內(nèi)皮功能障礙時，血管內(nèi)皮細胞表面的黏附分子表達增加[9]。本實驗用1 mmol/L的H2O2損傷HUVECs，血管內(nèi)皮細胞的黏附分子ICAM-1和VCAM-1的mRNA水平顯著增加，而EPS和DPS處理后，血管內(nèi)皮細胞的ICAM-1和VCAM-1的mRNA降低，這表明LIPC可以減少血管內(nèi)皮細胞黏附分子的表達，有助于減輕動脈粥樣硬化。

Figure 4.The expression of HO-1 at mRNA and protein levels. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vsM.

圖4各組細胞HO-1的mRNA和蛋白表達水平

HO-1是一個內(nèi)源性的保護酶，能夠被氧化應(yīng)激誘導(dǎo)表達增多[10]。HO-1的主要功能是催化血紅素生成一氧化碳、鐵離子和膽紅素[11]?，F(xiàn)在的研究證實HO-1可以抗氧化應(yīng)激，產(chǎn)生細胞保護效應(yīng)，能夠減輕血管的重構(gòu)和動脈粥樣硬化的形成[12-13]，是治療血管疾病的一個重要靶點。HO-1還能夠減輕多種因素，如吸煙[14]、PM2.5[15]所導(dǎo)致的內(nèi)皮損傷。在本研究中，EPS和DPS預(yù)孵后能夠誘導(dǎo)HUVECs表達HO-1，肢體缺血預(yù)適應(yīng)可能通過誘導(dǎo)HO-1的表達而減輕過氧化氫造成的氧化應(yīng)激損傷。

至今為止，肢體缺血預(yù)適應(yīng)的機制并不完全清楚。目前有3個假設(shè)用來解釋LIPC的保護作用：第一是肢體缺血預(yù)適應(yīng)觸發(fā)某些物質(zhì)釋放入血液，經(jīng)血流到達靶器官發(fā)揮保護作用；第二是LIPC刺激后，神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)靶器官產(chǎn)生保護作用[16]，神經(jīng)系統(tǒng)參與了LIPC過程；第三是LIPC觸發(fā)細胞內(nèi)抗炎和抗凋亡作用[17]。LIPC后，血液中成分確實發(fā)生了改變，如健康成人的上肢進行缺血預(yù)適應(yīng)后，血液中有51種蛋白質(zhì)發(fā)生變化，這些蛋白質(zhì)涉及免疫反應(yīng)，離子結(jié)合，滲透壓維持及氧化應(yīng)激反應(yīng)等方面[18]。人類LIPC后血液中產(chǎn)生的這些物質(zhì)甚至可以對兔心臟產(chǎn)生保護作用，這意味著LIPC存在種屬交叉[19]。大鼠經(jīng)過肢體缺血預(yù)適應(yīng)之后，血漿中有7種蛋白發(fā)生改變，這些蛋白早已被證實參與器官保護、抗炎和抗缺血[20]。本研究則發(fā)現(xiàn)大鼠LIPC后的血清可以減輕人臍帶靜脈內(nèi)皮細胞的氧化應(yīng)激損傷，進一步證實了LIPC所產(chǎn)生的保護性物質(zhì)在種屬間有交叉性。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)肢體缺血預(yù)適應(yīng)通過誘導(dǎo)HO-1的表達，從而減輕內(nèi)皮細胞的氧化應(yīng)激損傷，減少黏附分子的表達。肢體缺血預(yù)適應(yīng)產(chǎn)生的保護物質(zhì)在種屬間有交叉。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅森)

*[基金項目]深圳市重點資助科技計劃(No.201201022)

Limb ischemic preconditioning protects human umbilical vein endothelial cells from oxidative stress induced by H2O2CHEN Min1, ZHANG Ming-sheng1, ZHANG Xuan-ping1, LIANG Yue-qin2

(1DepartmentofPharmacology，2MedicalFunctionalExperimentalCenter,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China.E-mail:4156589@sina.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the effects of the sera from the rats after limb ischemic preconditioning (LIPC) on human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) injured by hydrogen peroxide (H2O2). METHODS: The HUVECs were divided into 5 groups: the cells in control group were cultured without any intervention; the cells in model group (M) were damaged by 1 mmol/L H2O2for 2 h; the cells in early preconditioning serum (EPS) group, delayed preconditioning serum (DPS) group or sham limb ischemic preconditioning serum (SPS) group were treated with the corresponding serum at 5% for 12 h, respectively, and then treaed with H2O2for 2 h. The viability of the HUVECs was analyzed by flow cytometry. The lactate dehydrogenase (LDH) in the culture media was detected. The cell adhesion molecules in the HUVECs were detected by real-time PCR. The mRNA and protein expression of heme oxygenase-1 (HO-1) was also determined. RESULTS: The viability of HUVECs incubated with 1 mmol/L H2O2for 2 h significantly decreased compared with the control cells, which was accompanied with the augmentations of LDH in the medium and the cell adhesion molecules in cells, such as vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1). Preincubation with EPS and DPS derived from the rats subjected LIPC attenuated these injuries. Furthermore, pretreatment with EPS and DPS increased the expression of HO-1 at mRNA and protein levels. CONCLUSION: LIPC protects the HUVECs from H2O2-induced injury.

[KEY WORDS]Limb ischemic preconditioning; Human umbilical vein endothelial cells; Oxidative stress

通訊作者△Tel: 0755- 22943200; E-mail: dsp66@medmail.com.cn

[收稿日期]2015- 06- 29[修回日期] 2015- 09- 22

[文章編號]1000- 4718(2015)12- 2282- 05

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.12.028

[中圖分類號]R363

[文獻標(biāo)志碼]A