魏義勇，　李　科，　劉　云，　劉興奎，　王海英，　喻　田

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院麻醉科， 貴州 遵義 563003)

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吡那地爾后處理大鼠缺血再灌注損傷心肌線粒體的蛋白質(zhì)組學(xué)研究*

魏義勇，李科，劉云，劉興奎，王海英，喻田△

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院麻醉科， 貴州 遵義 563003)

[摘要]目的： 運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法探討吡那地爾后處理對(duì)缺血再灌注損傷大鼠心肌的保護(hù)作用。方法: 建立Langendorff大鼠離體心臟缺血再灌注損傷模型，隨機(jī)分為吡那地爾后處理組(Pina組)和缺血再灌注損傷組(I/R組)，每組9只。提取心肌線粒體蛋白質(zhì)行雙向凝膠電泳，應(yīng)用質(zhì)譜鑒定差異大于2倍的蛋白質(zhì)點(diǎn)。結(jié)果: Pina組與I/R組比較，共發(fā)現(xiàn)7個(gè)差異蛋白質(zhì)：Pina組NADH脫氫酶1α亞復(fù)合體10亞基(NDUFA10)﹑NADH脫氫酶鐵硫蛋白2(NDUFS2)和NADH脫氫酶黃素蛋白2(NDUFV2)表達(dá)低于I/R組；Pina組異檸檬酸脫氫酶α亞基(IDHA)和Δ3,5-Δ2,4-二烯酰輔酶A異構(gòu)酶(ECH1)表達(dá)高于I/R組；另有2個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)均被鑒定為ATP合酶δ亞基，一個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)表達(dá)升高，而另一個(gè)表達(dá)降低。結(jié)論:吡那地爾后處理可能抑制了復(fù)合體Ⅰ的亞基(NDUFA10﹑NDUFS2和NDUFV2)代償性增加，但促進(jìn)了IDHA和ECH1表達(dá)并引發(fā)了ATP合酶δ亞基發(fā)生磷酸化，這些改變可能均與吡那地爾后處理保護(hù)心肌的作用有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]吡那地爾； 缺血再灌注損傷； 線粒體； 蛋白質(zhì)組學(xué)； 后處理

吡那地爾(pinacidil，Pina)是一種非選擇性線粒體ATP敏感性鉀通道(mitoKATP)開放劑，其后處理能產(chǎn)生確切的心肌保護(hù)效應(yīng)[1-2]。研究表明mitoKATP開放可能是后處理心肌保護(hù)作用機(jī)制的觸發(fā)點(diǎn)和終末效應(yīng)器[3]，但具體機(jī)制仍不十分清楚。本研究擬通過(guò)分析吡那地爾后處理對(duì)缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)損傷大鼠心肌線粒體蛋白質(zhì)表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討吡那地爾后處理的心肌保護(hù)作用機(jī)制。

材料和方法

1材料

1.1動(dòng)物選擇和分組健康雄性清潔級(jí)SD大鼠，體重250～300 g，4～5月齡[由第三軍醫(yī)大學(xué)提供，動(dòng)物證書號(hào)為SCXK(渝)2007-0005]。將動(dòng)物隨機(jī)分成2組：吡那地爾后處理組(Pina組)和缺血再灌注損傷組(I/R組)。

1.2主要試劑吡那地爾；Nycodenz密度梯度介質(zhì)；灌注液為K-H液(mmol/L)：NaCl 118.00、KCl 4.75、CaCl22.50、NaHCO324.80、MgCl2·6H2O 1.19、KH2PO41.19和glucose 11.1;線粒體分離介質(zhì)1×MS(210 mmol/L mannitol、70 mmol/L sucrose、5 mmol/L Tris-HCl和1 mmol/L EDTA，pH 7.4);裂解液(7 mol/L 尿素、2 mol/L 硫脲、4% CHAPS、5 mmol/L EGTA和65 mmol/L DTT，pH 7.4)，以上試劑均購(gòu)自Sigma。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒由江蘇碧云天生物技術(shù)研究所提供，RCDC蛋白質(zhì)定量試劑盒由Bio-Rad提供。

2方法

2.1建立模型腹腔注射異戊巴比妥鈉(40 mg/kg)后迅速沿劍突下打開胸腔，于主動(dòng)脈根部剪下心臟，放入K-H液中，迅速將主動(dòng)脈固定于Langendorff灌注管口，每組均灌注氧合的K-H液20 min，常溫下缺血40 min后，Pina組續(xù)灌初給予吡那地爾(50 μmol/L)2 min，續(xù)灌37 ℃含氧K-H液58 min,I/R組續(xù)灌37 ℃含氧K-H液60 min。參照文獻(xiàn)建立Langendorff離體大鼠心臟缺血再灌注損傷模型[4]，比較灌注20 min和續(xù)灌60 min時(shí)2組左室舒張末壓(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)及左室發(fā)展壓(left ventricular developed pressure，LVDP)的差異。

2.2線粒體蛋白質(zhì)提取離體灌注后, 迅速取出心臟，浸入線粒體分離介質(zhì)中冰浴勻漿。4 ℃ 1 500×g離心10 min，取上清液4 ℃ 15 000×g離心10 min，沉淀即為粗提線粒體。粗提線粒體加入Nycodenz密度梯度介質(zhì)中，4 ℃ 100 000×g離心60 min,即得到純化線粒體。向純化線粒體中加入10倍體積的裂解液冰上孵育20 min, 超聲破碎3 min 后, 4 ℃ 20 000×g離心30 min，上清即為線粒體蛋白。Bio-Rad公司的RC DC試劑盒方法行蛋白定量檢測(cè)，350 μg分裝，-80 ℃保存。

2.3雙向凝膠電泳及質(zhì)譜分析根據(jù)Bio-Rad公司的操作手冊(cè)優(yōu)化雙向電泳過(guò)程，每組同時(shí)運(yùn)行3個(gè)蛋白質(zhì)樣品, 每個(gè)樣品重復(fù)3次。第一向等電聚焦電泳和第二向SDS-PAGE后，凝膠行硝酸銀染色。染色后的凝膠用EPSON Scan 2.2掃描儀透射掃描獲取圖像，PDQuest 8.0軟件分析比較2組間蛋白質(zhì)點(diǎn)的差異, 表達(dá)量改變(上調(diào)或下調(diào)) 2倍以上認(rèn)為有差異。切取差異蛋白質(zhì)點(diǎn)膠粒行膠內(nèi)酶解,運(yùn)用MALDI-TOF-MS分析，獲得的肽質(zhì)量指紋圖譜(PMF)通過(guò)Mascot軟件檢索蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)。同時(shí), 對(duì)二級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜的肽序列信息進(jìn)行檢索, 進(jìn)一步確證鑒定結(jié)果，選取部分差異蛋白質(zhì)用Western blot法行回復(fù)驗(yàn)證。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用t檢驗(yàn)以及單因素方差分析進(jìn)行組間差異比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1心功能的變化

灌注20 min，2組中LVEDP和LVDP均未發(fā)生明顯變化，續(xù)灌60 min，Pina組LVEDP低于I/R組(P<0.05)，而LVDP高于I/R組(P<0.05)，見表1。

表12組離體心臟左室心功能的變化

Table 1.The changes of left ventricular functions in the 2 groups (mmHg. Mean±SD.n=8)

GroupPerfusionfor20minReperfusionfor60minLVEDPLVDPLVEDPLVDPPina3.56±0.74122.40±8.707.87±1.21*87.66±6.21*I/R4.04±0.89115.70±6.8821.81±2.4756.81±7.40

*P<0.05vsI/R group.

2雙向凝膠電泳

經(jīng)蛋白質(zhì)點(diǎn)的檢測(cè)、背景扣除、量化和匹配后，每張凝膠上檢測(cè)出(480±22)個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，PDQuest 8.0軟件分析后得到7個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)(圖1)，結(jié)果顯示，Pina組與I/R組比較，共發(fā)現(xiàn)7個(gè)差異蛋白質(zhì)：Pina組NADH脫氫酶1α亞復(fù)合體10亞基(NDUFA10)﹑NADH脫氫酶鐵硫蛋白2(NDUFS2)和NADH脫氫酶黃素蛋白2(NDUFV2)表達(dá)低于I/R組；Pina組異檸檬酸脫氫酶α亞基(IDHA)和Δ3,5-Δ2,4-二烯酰輔酶A異構(gòu)酶(ECH1)表達(dá)高于I/R組；另有2個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)均被鑒定為ATP合酶δ亞基，一個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)表達(dá)升高，而另一個(gè)表達(dá)降低。這些蛋白質(zhì)點(diǎn)經(jīng)MALDI-TOF-MS鑒定結(jié)果及豐度變化見圖2、表2。

Figure 1.The maps of two-dimensional electrophoresis in the 2 groups.

圖1Pina組與I/R組的凝膠圖像比較軟件分析后的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)

Figure 2.The changes of differential protein abundance in the 2 groups.

圖2Pina組與I/R組比較差異蛋白點(diǎn)的豐度變化

表2　2組差異蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)檢索結(jié)果

3回復(fù)驗(yàn)證

Pina組NDUFA10和NDUFS2的表達(dá)均低于I/R組(P<0.05)，見圖3。此結(jié)果與雙向凝膠電泳的改變趨勢(shì)一致，證明本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。

Figure 3.The expression of NDUFA10 and NDUFS2 proteins in each group detected by Western blotting. Mean±SD.n=8.*P<0.05vsI/R group.

圖3NDUFA10和NDUFS2在各組表達(dá)的免疫印跡分析

討論

本研究證實(shí)吡那地爾后處理明顯改善了缺血鼠心功能，與既往的研究結(jié)果一致[4]。通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法比較了吡那地爾后處理與心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌線粒體蛋白質(zhì)的表達(dá)圖譜，對(duì)7個(gè)差異蛋白質(zhì)進(jìn)行了鑒定，發(fā)現(xiàn)這些蛋白質(zhì)均與能量代謝和線粒體呼吸鏈有關(guān)，具體分述如下。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Pina組復(fù)合體Ⅰ的亞基(NDUFA10﹑NDUFS2和NDUFV2)表達(dá)較I/R組低，推測(cè)可能是吡那地爾后處理的離體心臟，mitoKATP開放，K+進(jìn)入線粒體內(nèi)，激活線粒體NADH呼吸鏈，ROS生成減少，ATP生成增加[5]，H+-K+交換和H+-Na+交換加快，細(xì)胞內(nèi)和線粒體內(nèi)酸中毒改善，機(jī)體所需的代償減少，使得這3個(gè)蛋白質(zhì)的表達(dá)增加程度降低。Kim等[6]通過(guò)兔心肌缺血預(yù)處理線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，缺血預(yù)處理組NDUFA10和NDUFS2的表達(dá)較缺血再灌注損傷組低，并認(rèn)為這種變化可能是作為代償措施來(lái)保護(hù)線粒體功能。有文獻(xiàn)報(bào)道NDUFS的亞基可能是治療心肌缺血再灌注損傷的靶點(diǎn)[7]，且NDUFV2可能是肥厚型心肌病損害的靶蛋白[8]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)吡那地爾后處理導(dǎo)致復(fù)合體Ⅰ的3個(gè)亞基存在著相似的變化，而研究表明mitoKATP開放可能是預(yù)處理和后處理心肌保護(hù)作用的觸發(fā)點(diǎn)和終末效應(yīng)器[2]，因此，這3個(gè)蛋白質(zhì)的改變可能與mitoKATP開放心肌保護(hù)作用的機(jī)制有著緊密聯(lián)系。

IDHA和ECH1在線粒體呼吸鏈和能量代謝過(guò)程中起著重要作用，目前它們?cè)谛募”Ｗo(hù)方面的文獻(xiàn)報(bào)道較少。本研究發(fā)現(xiàn)這2個(gè)蛋白質(zhì)的表達(dá)在Pina組均高于I/R組，推測(cè)可能是吡那地爾后處理促進(jìn)了它們的表達(dá)，以維持線粒體電子傳遞和能量代謝的正常功能。

研究表明，ATP合酶在預(yù)處理和mitoKATP開放心肌保護(hù)機(jī)制中均起著重要作用[9]。本研究發(fā)現(xiàn)有2個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)經(jīng)鑒定均為ATP合酶d亞基，一個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)表達(dá)上調(diào)，而一個(gè)表達(dá)下調(diào)。推測(cè)可能是吡那地爾后處理致該蛋白質(zhì)發(fā)生了磷酸化，且這種修飾在mitoKATP開放心肌保護(hù)作用機(jī)制中扮演著重要角色。學(xué)者通過(guò)腺苷和二氮嗪預(yù)處理心肌線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)ATP合酶的亞基發(fā)生了磷酸化，并證實(shí)ATP合酶的亞基磷酸化能起到心肌保護(hù)作用[10]。文獻(xiàn)顯示，ATP合酶的亞基發(fā)生磷酸化可能與mitoKATP開放的心肌保護(hù)作用機(jī)制有關(guān)[11-12]。

綜上所述，本研究證實(shí)吡那地爾后處理可能引起了復(fù)合體Ⅰ的亞基(NDUFA10﹑NDUFS2和NDUFV2)代償性增加程度降低，促進(jìn)了IDHA和ECH1表達(dá)升高，引發(fā)了ATP合酶δ亞基發(fā)生磷酸化。這些改變可能均參與了吡那地爾后處理心肌保護(hù)作用的機(jī)制，且這幾個(gè)蛋白質(zhì)極可能是mitoKATP開放心肌保護(hù)作用的關(guān)鍵蛋白質(zhì)，對(duì)其深入研究有益于進(jìn)一步揭示吡那地爾后處理的心肌保護(hù)作用機(jī)制。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅森)

*[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81460462; No. 31460696；No. 31001128)；南昌大學(xué)研究生創(chuàng)新基金資助項(xiàng)目(No. cx2015170)

*[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81170177, No. 81030002)

·綜述·

Proteomic study of myocardial mitochondria with ischemia/reperfusion injury and pinacidil postconditioning in isolated rat heartsWEI Yi-yong, LI Ke, LIU Yun, LIU Xing-kui, WANG Hai-ying, YU Tian

(DepartmentofAnesthesiology,TheAffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege,Zunyi563003,China.E-mail:zyyutian@126.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the protective effect of pinacidil postconditioning on rat myocardium suffering ischemia/reperfusion injury by mitochondrial proteomics. METHODS: Langendorff apparatus was used to establish the model of myocardial ischemia/reperfusion injury. Sprague-Dawley rats were randomly divided into 2 groups: pinacidil postconditioning group (Pina group) and ischemia/reperfusion injury group (I/R group). After 20 min of perfusion with K-H solution, the perfusion was suspended for 40-min (global ischemia) follow by 60 min of reperfusion in I/R group. In Pina group at the end of 40 min global ischemia, the isolated hearts were perfused with K-H solution containing pinacidil (50 μmol/L) for 2 min followed 58-min perfusion with regular K-H solution. Total proteins extracted from the mitochondria were applied to the two-dimensional gel electrophoresis (2-DE). The differentially expressed protein spots over 2 times were evaluated by a software. Then they were subjected to in-gel digestion, and analyzed by spectrometry. RESULTS: The expression levels of NDUFA10, NDUFS2 and NDUFV2 were elevated but those of IDHA and ECH1 were decreased in Pina group compared with I/R group. Interestingly, 2 spots in the 2-DE map were identified as ATPase subunit δ. The expression levels of one spot was elevated, while the other was decreased. CONCLUSION: Pinacidil postconditioning may decrease the degree of increased expression levels of NDUFA10, NDUFS2 and NDUFV2, promote the expression of IDHA and ECH1, and induce the phosphorylation of ATPase subunit δ, which may be related to the protective mechanism of pinacidil postconditioning.

[KEY WORDS]Pinacidil; Ischemia/reperfusion injury; Mitochondria; Proteomics; Postconditioning

通訊作者△余瓊芳 Tel： 0791-86259017； E-mail： qiongfangyu@yeah.net； 高典 Tel： 0791-86360556; E-mail： gaodian@ncu.edu.cn △Tel: 010-66936762; E-mail: liyangbsh@163.com

[收稿日期]2015- 09- 18[修回日期] 2015- 10- 14 2015- 07- 07[修回日期] 2015- 10- 13

[文章編號(hào)]1000- 4718(2015)12- 2296- 05

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.12.030

[中圖分類號(hào)]R363

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A