徐　倩，　趙亞玲，　付建珠，　谷　蕾，　劉貴敏，　梁文同△，　成志勇△

(1承德醫(yī)學(xué)院，河北 承德 067000； 2保定市第一醫(yī)院血液內(nèi)科，河北 保定 071000)

?

AG490對HEL細(xì)胞VEGF和HIF-1α表達(dá)的影響*

徐倩1, 2，趙亞玲1, 2，付建珠1, 2，谷蕾2，劉貴敏1, 2，梁文同2△，成志勇2△

(1承德醫(yī)學(xué)院，河北 承德 067000；2保定市第一醫(yī)院血液內(nèi)科，河北 保定 071000)

[摘要]目的： 探討JAK2抑制劑AG490對人紅白血病(HEL)細(xì)胞遷移及對VEGF和HIF-1α表達(dá)的影響。方法: 用不同濃度的AG490處理HEL細(xì)胞，CCK-8法檢測細(xì)胞活力，Hoechst 33342熒光染色檢測細(xì)胞凋亡，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡及周期，Transwell小室檢測細(xì)胞遷移能力，RT-PCR檢測JAK2的mRNA水平，Western blot檢測p-JAK2、VEGF和HIF-1α的蛋白水平。結(jié)果: AG490能夠抑制HEL細(xì)胞的活力，不同濃度(20、40、60、80和100 μmol/L)AG490作用HEL細(xì)胞48 h后，細(xì)胞活力分別為88%、75%、48%、10%和0.12%(P<0.05)；Hoechst 33342凋亡細(xì)胞染色顯示80 μmol/L AG490處理細(xì)胞48 h后，亮藍(lán)色凋亡細(xì)胞較對照組明顯增多(P<0.05)；流式結(jié)果顯示80 μmol/L AG490作用細(xì)胞48 h后，凋亡率上升；細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示20 μmol/L AG490處理細(xì)胞24 h后漏出細(xì)胞明顯低于對照組(P<0.05)；RT-PCR結(jié)果顯示不同濃度AG490處理HEL細(xì)胞48 h后JAK2 mRNA呈劑量依賴性減低；Western blot結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的p-JAK2、VEGF和HIF-1α蛋白水平較對照組明顯減低(P<0.05)。結(jié)論: AG490可通過抑制JAK2信號通路，抑制HEL細(xì)胞血管新生因子VEGF和HIF-1α的表達(dá)。

[關(guān)鍵詞]骨髓增殖性腫瘤； 血管生成； VEGF； HIF-1α

血管生成是涉及新生血管從預(yù)先存在的血管網(wǎng)發(fā)展的一個嚴(yán)格調(diào)節(jié)的過程。在實(shí)體腫瘤中，血管生成是腫瘤生長、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移至關(guān)重要的因素。有證據(jù)表明，在血液系統(tǒng)惡性腫瘤如白血病、多發(fā)性骨髓瘤、淋巴瘤、骨髓增殖性腫瘤等與實(shí)體瘤相似的腫瘤中具有高骨髓微血管密度(microvessel density，MVD)，因而考慮血管生成在血液系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)展中起重要作用[1]。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是促腫瘤血管新生的重要因子，以其對血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂活性而得名，通過其受體VEGFR與相應(yīng)刺激信號結(jié)合，能夠刺激有絲分裂活性和內(nèi)皮細(xì)胞增殖，增加血管通透性，并誘導(dǎo)血管擴(kuò)張及產(chǎn)生促血管活性因子，參與新生血管的形成[2]。缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-indu-cible factor-1α，HIF-1α)是存在于腫瘤中的缺氧應(yīng)答調(diào)控因子，在維持細(xì)胞能量代謝、腫瘤血管生成及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[3]。VEGF和HIF-1α在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，是目前已知的參與血管新生及腫瘤轉(zhuǎn)移的重要因子。國外研究報道，在JAK2V617F骨髓增殖性腫瘤患者中的MVD明顯高于正常人，同時VEGF和HIF-1α存在高表達(dá)，提出JAK2突變可能與VEGF和HIF-1α表達(dá)存在重要關(guān)系。本研究通過JAK2抑制劑AG490作用于JAK2V617F陽性人紅白血病(human erythroleukemia, HEL)細(xì)胞，觀察AG490對HEL細(xì)胞活力、遷移能力及對p-JAK2、VEGF和HIF-1α蛋白水平的變化，初步探討JAK2抑制劑對JAK2V617F陽性細(xì)胞VEGF和HIF-1α表達(dá)水平的作用機(jī)制，為抗血管新生治療骨髓增殖性腫瘤提供理論依據(jù)。

材料和方法

1主要試劑

RPMI-1640培養(yǎng)液(Gibco)；新生牛血清(杭州四季青公司)；熒光染料Hoechst 33342和AG490(Sigma)；CCK-8(Dojindo)；引物(北京賽百勝)；抗體(Santa Cruz)。

2細(xì)胞系及細(xì)胞培養(yǎng)

HEL細(xì)胞為JAK2V617F陽性，具有JAK-STAT信號通路活化的特征，購自上?？茖W(xué)院細(xì)胞庫。HEL細(xì)胞于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)液為加入10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液。根據(jù)細(xì)胞生長狀況，2～3 d換液1次，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3實(shí)驗(yàn)分組

將對數(shù)期細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，實(shí)驗(yàn)組根據(jù)加入AG490的不同濃度分為20 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L、80 μmol/L和100 μmol/L組。對照組不加入AG490。

4實(shí)驗(yàn)方法

4.2HEL細(xì)胞凋亡形態(tài)的觀察用Hoechst 33342染色檢測細(xì)胞凋亡。分別取48 h后對照組及80 μmol/L AG490處理組的HEL細(xì)胞，取100 μL細(xì)胞懸液，加入終濃度為10 mg/L的Hoechst 33342，避光染色15～20 min, 取40 μL細(xì)胞懸液滴于載玻片，熒光顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞形態(tài)。

4.3Transwell小室檢測細(xì)胞遷移取對數(shù)生長期HEL細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度5×104/L，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計分組上室分別加入含不同濃度AG490的細(xì)胞懸液200 μL(不含血清)，下室加入含10%小牛血清的1640培養(yǎng)基500 μL，每組3個復(fù)孔，孵育24 h后，取出Transwell小室，用下室培養(yǎng)液反復(fù)淋洗上室底面，在顯微鏡下觀察脫落及洗下的細(xì)胞數(shù)量。

4.4流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡取對數(shù)生長期HEL細(xì)胞，在6孔板中接種3 mL細(xì)胞懸液，約含1×105個細(xì)胞，按照實(shí)驗(yàn)分組分別加入不同濃度AG490，分別孵育0 h、24 h、48 h和72 h，收取細(xì)胞，0.5 mL PBS洗2次，1 000 r/min離心、棄去上清液，75%冰乙醇固定過夜，離心，棄上清，0.5 mL PBS洗1次，加入RNase 1 mL，37 ℃恒溫水浴30 min，1 000 r/min離心，棄上清，加入DNA抽提液1 mL，室溫靜置30 min，4 000 r/min離心5 min，棄上清。加入500 μL(0.1 g/L)的PI染液，置于4 ℃避光染色30 min，過濾網(wǎng)，上流式細(xì)胞儀檢測。

4.5RT-PCR檢測JAK2的mRNA表達(dá)收集對照組及實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，TRIzol提取各組細(xì)胞總RNA，電泳鑒定RNA純度及定量。根據(jù)Vazyme Hiscript 合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系20 μL，包括:細(xì)胞RNA 2 μg，RNasin 0.5 μL(50 U/μL)，隨機(jī)物1 μL(50 mg/L)，dNTP 2 μL(10 mol/L)，5×逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液4 μL，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶200 U，余用DEPC水補(bǔ)足至20 μL。在37 ℃中反應(yīng)60 min，95 ℃反應(yīng)5 min 后終止反應(yīng)。產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增或分裝稀釋，放置于-20 ℃，保存時間不超過6 個月。

PCR反應(yīng)體系為20 μL，JAK2的上游引物為5’-CAG CAA GTA TGA TGA GCA AGC TTT-3’，下游引物為5’-TGA ACC AGA ATA TTC TCG TCT CCA C-3’。內(nèi)參照β-actin的上游引物為 5’-CTG GCA CCA CAC CTT CTA CAA T-3’，下游引物為5’-AAT GTC ACG CAC GAT TTC CCG C-3’。JAK2擴(kuò)增片段產(chǎn)物長度101 bp,β-actin的擴(kuò)增片段長度382 bp。取cDNA 2 μL作為模板，建立20 μL反應(yīng)體系。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性45 s，60 ℃退火1 min，68 ℃延伸45 s，40 個循環(huán)。擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，全自動凝膠成像儀下分析。

4.6Western blot檢測p-JAK2、VEGF和HIF-1α的蛋白水平收集各組細(xì)胞，提取蛋白，根據(jù)蛋白定量結(jié)果，分裝蛋白，將分裝好的蛋白置于沸水中煮沸變性5 min，配電泳分離膠、濃縮膠，蛋白上樣，電泳使蛋白分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，配5%脫脂奶粉，37 ℃烤箱中封閉2 h，使用抗體稀釋液稀釋I抗，4 ℃孵育過夜，TTBS洗膜6次(每次5 min)，使用抗體稀釋液稀釋標(biāo)記 II 抗，37 ℃烤箱中孵育2 h，TTBS洗3遍，TBS洗1遍，化學(xué)發(fā)光液混合，應(yīng)用Alpha Innotech 系統(tǒng)對PVDF膜進(jìn)行掃描及圖像分析。

5統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組均數(shù)比較采用方差分析，組間兩兩比較選用q檢驗(yàn)，兩變量的相關(guān)程度用Pearson 直線相關(guān)分析法分析。所有數(shù)據(jù)均用SPSS 19.00統(tǒng)計軟件分析處理。

結(jié)果

1AG490對HEL細(xì)胞活力的影響

CCK-8結(jié)果顯示，不同濃度的AG490作用HEL細(xì)胞后，隨著時間推移，細(xì)胞活力逐漸下降，AG490作用48 h后，HEL細(xì)胞活力與對照組(95%)相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；隨著AG490藥物濃度增大，HEL細(xì)胞活力明顯下降，并呈時間依賴性，細(xì)胞活力明顯受到抑制，見圖1。

Figure 1.The HEL cell viability was detected by CCK-8 assay after treated with AG490 at different concentrations for different time. Mean±SD.n=5.

圖1CCK-8法檢測不同濃度AG490作用不同時間的細(xì)胞活力

2Hoechst 33342染色檢測細(xì)胞凋亡

Hoechst 33342染色后的HEL細(xì)胞，對照組細(xì)胞為淡藍(lán)色，細(xì)胞核內(nèi)DNA分布均勻，核呈圓形或卵圓形，無固縮、變形。AG490處理細(xì)胞核由于濃集而呈亮藍(lán)色，細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，核固縮、變形。80 μmol/LAG490處理細(xì)胞48 h后，亮藍(lán)色凋亡細(xì)胞較對照組明顯增多(P<0.05)，見圖2。

Figure 2.The apoptosis was detected by Hoechst 33342 staining after treated with AG490 (80 μmol/L) for 48 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol.

圖2Hoechst 33342染色檢測AG490作用48 h后HEL細(xì)胞的凋亡形態(tài)

3AG490對HEL細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，AG490處理的HEL細(xì)胞出現(xiàn)明顯凋亡，隨著AG490藥物濃度的增加及作用時間的延長，凋亡細(xì)胞比率逐漸上升，G0/G1期前出現(xiàn)典型的亞二倍體凋亡峰。80 μmol/L AG490作用細(xì)胞48 h后，凋亡率上升，見圖3。

Figure 3.The cell apoptosis was detected by flow cytometry. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol.

圖3流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

4AG490對HEL細(xì)胞遷移的影響

因細(xì)胞活力在20 μmol/L AG490作用24 h后與對照組比較無顯著差異，因此我們在20 μmol/L AG490實(shí)驗(yàn)組與對照組24 h后進(jìn)行細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示與對照組相比，20 μmol/L AG490作用HEL 24 h后，漏入下室的細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.01)。

5JAK2 mRNA表達(dá)水平的變化

RT-PCR結(jié)果顯示，不同濃度AG490作用48 h后，實(shí)驗(yàn)組JAK2的mRNA表達(dá)明顯減低，并隨著藥物濃度的增加呈逐漸減低趨勢，與對照組有統(tǒng)計學(xué)差異，見圖4。

6AG490處理HEL細(xì)胞后p-JAK2、VEGF和HIF-1α蛋白水平的變化

Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，隨著AG490濃度的加大，48 h后 HEL細(xì)胞的p-JAK2蛋白水平呈逐漸減低的趨勢，VEGF和HIF-1α的蛋白水平隨著藥物濃度的加大而逐漸下降，而對照組無明顯變化，見圖5。相關(guān)分析顯示VEGF與p-JAK2二者呈正相關(guān)性(r=0.991，P<0.01)；HIF-1α與p-JAK2亦呈正相關(guān)性(r=0.993，P<0.01)。

討論

JAK-STAT傳導(dǎo)通路在細(xì)胞生長、分化、免疫功能和造血中發(fā)揮重要生理、病理作用[4]。目前，越來越多的研究報道JAK2-STAT5在多種組織及細(xì)胞系中異常表達(dá)和活化，并與腫瘤的增殖、分化、凋亡、血管新生及腫瘤侵襲有密切關(guān)系。

骨髓增殖性腫瘤是一類起源于造血干細(xì)胞的血液系統(tǒng)惡性疾病，主要特點(diǎn)為骨髓中一系或多系細(xì)胞異常增殖[5]。研究報道，骨髓增殖性腫瘤患者大多存在JAK2V617F突變，此突變作為一種組成性激活酪氨酸激酶，在缺乏細(xì)胞因子的情況下自發(fā)性激活JAK2-STAT5信號通路[6-7]。

Figure 4.The mRNA expression level of JAK2 was measured by RT-PCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

圖4RT-PCR檢測細(xì)胞JAK2的mRNA水平

HEL細(xì)胞是JAIK2V617F突變陽性人紅白血病細(xì)胞，其JAK2-STAT5信號通路活化，而AG490可通過阻斷JAK2-STAT5通路抑制細(xì)胞增殖[8]，因此本研究選用JAK2抑制劑AG490，抑制其JAK2信號通路。Oku等[9]通過siRNA阻斷JAK2-STAT5，發(fā)現(xiàn)JAK2V617突變的骨髓增殖性腫瘤細(xì)胞增殖明顯受到抑制，同時也認(rèn)為JAK2V617F不僅磷酸化下游STAT5，可能同時激活Ras/MEK/ERK和PI3K/Akt通路，共同發(fā)揮促進(jìn)HEL細(xì)胞增殖及抑制凋亡作用。本研究結(jié)果顯示，不同濃度AG490作用于HEL細(xì)胞后，JAK2 的mRNA表達(dá)水平呈劑量及時間依賴性減低，同時p-JAK2的蛋白水平水平亦隨著藥物劑量的增大逐漸降低，表明JAK2信號通路受到抑制，AG490作用HEL細(xì)胞后，細(xì)胞活力明顯降低，凋亡細(xì)胞較對照組明顯增多，提示JAK2介導(dǎo)的信號通路有促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制凋亡作用，考慮可能的機(jī)制為JAK2V617F自發(fā)性激活下游的JAK2-STAT5、Ras/MEK/ERK和PI3K/Akt等通路，導(dǎo)致參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡的基因如Bcl-xL、Mcl-1、cyclin D1/D2和c-myc等表達(dá)上調(diào)有關(guān)。

Figure 5.The protein levels of p-JAK2, VEGF and HIF-1α were detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L.

圖5Western blot檢測細(xì)胞p-JAK2、VEGF和HIF-1α的蛋白水平

研究表明血管新生在血液系統(tǒng)腫瘤如白血病、多發(fā)性骨髓瘤、淋巴瘤中發(fā)揮重要作用，血管新生的程度目前已成為預(yù)測腫瘤患者的預(yù)后指標(biāo)。有研究顯示：在初治AML患者骨髓中，其MVD是正常人骨髓的2倍，經(jīng)治療緩解后患者M(jìn)VD較前明顯下降[10]。Panteli等[11]和Boveri等[12]研究報道骨髓增殖性腫瘤患者骨髓中微血管密度明顯高于正常人，同時存在VEGF及其受體VEGFR高表達(dá),微血管密度隨著VEGF表達(dá)增加逐漸增大[12]，并提出可能與JAK2V617F突變負(fù)荷密切相關(guān)[13]。

有證據(jù)表明， VEGF相關(guān)的通路是新血管生成和招募內(nèi)皮祖細(xì)胞的最相關(guān)的調(diào)節(jié)器。VEGF是目前認(rèn)為促進(jìn)血管新生最重要的因子，其表達(dá)受內(nèi)在和外在因素的調(diào)控，其中組織缺氧是VEGF重要的刺激因素，HIF-1α可通過與VEGF mRNA結(jié)合誘導(dǎo)VEGF表達(dá)，目前已發(fā)現(xiàn)腫瘤內(nèi)缺氧和HIF-1α是觸發(fā)血管新生的關(guān)鍵因素[2]。通常情況下，血管生成是由內(nèi)源性抗血管生成及促血管生成因子的平衡保持，在HIF-1α和VEGF受到異常刺激時，VEGF及其受體可通過自分泌或旁分泌途徑刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)血管新生及腫瘤轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果表明，HEL細(xì)胞中的p-JAK2呈高水平，同時存在促血管新生因子VEGF和HIF-1α表達(dá)增加。在應(yīng)用JAK2抑制劑AG490后，JAK2 mRNA表達(dá)及p-JAK2蛋白水平明顯減低，呈劑量和時間依賴性，隨著JAK2表達(dá)的降低，VEGF和HIF-1α蛋白表達(dá)水平亦明顯下降，與JAK2表達(dá)呈正相關(guān)性。結(jié)果表明抑制JAK2突變可抑制HEL細(xì)胞分泌VEGF和HIF-1α，下調(diào)VEGF和HIF-1α蛋白表達(dá)水平，與國外研究結(jié)果相一致。Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AG490作用于HEL細(xì)胞24 h后，進(jìn)入下室細(xì)胞明顯減少，與對照組有明顯差異，提示降低骨髓增生性腫瘤患者VEGF和HIF-1α蛋白表達(dá)水平可抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，其作用機(jī)制可能為AG490通過抑制JAK2磷酸化，進(jìn)一步導(dǎo)致STAT活化受抑，干擾下游靶基因與VEGF、HIF-1α啟動基因結(jié)合，下調(diào)VEGF和HIF-1α蛋白表達(dá)，從而引起二者參與的血管生成受到抑制及細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力下降[14]。

綜上所述，AG490通過抑制HEL細(xì)胞JAK2信號通路，抑制血管新生因子VEGF和HIF-1α的表達(dá)，進(jìn)而參與抑制血管新生作用。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Medinger M， Passweg J. Angiogenesis in myeloproliferative neoplasms, new markers and future directions[J]. Memo, 2014, 7:206-210.

[2]Song G, Li Y, Jiang G. Role of VEGF/VEGFR in the pathogenesis of leukemias and as treatment targets[J]. Oncol Rep, 2012, 28(6):1935-1944.

[3]Amelio I, Inoue S, Markert EK, et al.TAp73 opposes tumor angiogenesis by promoting hypoxia-inducible factor 1α degradation[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2015, 112(1):226-231.

[4]Quintás-Cardama A,Verstovsek S. Molecular pathways: Jak/STAT pathway: mutations, inhibitors, and resistance[J]. Clin Cancer Res, 2013, 19(8):1933-1940.

[5]成志勇，黃月華，梁文同，等.骨髓增殖性腫瘤中JAK2V617F 突變與Ⅰ型細(xì)胞因子受體相關(guān)性研究[J]. 中國全科雜志,2012, 15(9):1019-1022.

[6]郭慧梅，潘崚，賀建輝，等. 骨髓增殖性腫瘤患者血栓栓塞的相關(guān)因素[J]. 腫瘤防治研究, 2013, 40(10):958-960.

[7]成志勇，李士輝，楊琳，等. 干擾素α對JAK2V617F陽性的骨髓增殖性疾病的影響[J]. 實(shí)用腫瘤雜志, 2008, 23(4):318-321.

[8]任艷玲，佟紅艷. 高三尖杉酯堿聯(lián)合AG490 對HEL 細(xì)胞JAK2-STAT5相關(guān)信號通路的影響[J]. 中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志, 2011, 19(5):1117-1120.

[9]Oku S, Takenaka K, Kuriyama T, et al. JAK2 V617F uses distinct signaling pathways to induce cell proliferation and neutrophil activation[J]. Br J Haematol, 2010, 150(3): 334-344.

[10]Negaard HF, Iversen N, Bowitz-Lothe IM, et al. Increased bone marrow microvascular density in haematological malignanciesis associated with differential regulation of angiogenic factors[J]. Leukemia, 2009, 23(1):162-169.

[11]Panteli K, Zagorianakou N, Bai M, et al.Angiogenesis in chronic myeloproliferative diseases detected by CD34 expression[J]. Eur J Haematol, 2004, 72(6):410-415.

[12]Boveri E, Passamonti F, Rumi E, et al. Bone marrow microvessel density in chronic myeloproliferative disorders: a study of 115 patients with clinicopathological and molecular correlations[J]. Br J Haematol, 2009, 140(2):162-168.

[13]Medinger M, Skoda R, Gratwol A, et al. Angiogenesis and vascular endothelial growth factor/receptor expression in myeloproliferative neoplasms: correlation with clinical parameters and JAK2-V617F mutational status[J]. Br J Haematol, 2009, 146(2):150-157.

[14]侯大喬，王海琳，靳亞妮. AG490對人宮頸癌Hela細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲性的影響及機(jī)制[J]. 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2009,30(24):3022-3025.

(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅森)

*[基金項(xiàng)目]廣東省科技計劃(No. 2014A020212126)

Effect of AG490 on expression of VEGF and HIF-1α in HEL cellsXU Qian1, 2, ZHAO Ya-ling1, 2, FU Jian-zhu1, 2, GU Lei2, LIU Gui-min1, 2, LIANG Wen-tong2, CHENG Zhi-yong2

(1ChengdeMedicalCollege,Chengde067000,China;2DepartmetofHematology,TheFirstHospitalofBaoding,Baoding071000,China.E-mail:liangwentong1967@sina.com;dzczy@sohu.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the effect of AG490 on the expression of VEGF and HIF-1α, and the capacity of invasion in human erythroleukemia (HEL) cells. METHODS: The HEL cells were treated with AG490 at different concentrations. The cell viability was detected by CCK-8 assay. The apoptosis was detected by Hoechst staining. The apoptosis and the cell cycle were analyzed by flow cytometry. The capacity of migration was evaluated by Transwell assay. The mRNA expression level of JAK2 was measured by RT-PCR. The protein levels of p-JAK2, VEGF and HIF-1α were determined by Western blot. RESULTS: The HEL cell viabilities were 88%, 75%, 48%, 10% and 0.12% after treated with AG490 at 20, 40, 60, 80 and 100 μmol/L for 48 h, respectively. The results of Hoechst staining showed that brilliant blue cells in 80 μmol/L AG490 group was significantly increased compared with control group for 48 h. The apoptosis rate of 80 μmol/L AG490 group was significantly increased compared with control group at 48 h after AG490 treatment. The number of membrane-permeating HEL cells in 20 μmol/L AG490 group at 24 h after AG490 treatment was significantly lower than that in control group (P<0.05). The mRNA level of JAK2 decreased in a concentration-dependent manner after the HEL cells were treated with different concentrations of AG490 for 48 h. The protein levels of p-JAK2, VEGF and HIF-1α were lower in AG490 treatment groups than those in control group (P<0.05). CONCLUSION: AG490 inhibits the expression of VEGF and HIF-1α in HEL cells by inhibiting JAK2 pathway.

[KEY WORDS]Myeloproliferative neoplasms; Angiogenesis; VEGF; HIF-1α

通訊作者△Tel: 020-87334871; E-mail: ethanyu@sina.com

[收稿日期]2015- 08- 18[修回日期] 2015- 09- 11

[文章編號]1000- 4718(2015)12- 2164- 05

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.12.008

[中圖分類號]R730.23

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A