姜晗，何巍，于安石，劉放

(沈陽醫(yī)學院附屬中心醫(yī)院消化內(nèi)科,遼寧沈陽110024)

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結(jié)腸癌組織中P16、CyclinD1和PKC-α的表達及意義

姜晗，何巍，于安石，劉放

(沈陽醫(yī)學院附屬中心醫(yī)院消化內(nèi)科,遼寧沈陽110024)

摘要目的：研究P16、CyclinD1和PKC-α在結(jié)腸癌組織中的表達及其與結(jié)腸癌臨床指標的關(guān)系。方法：采用免疫組織化學S-P染色方法檢測P16、CyclinD1和PKC-α在70例結(jié)腸癌組織及癌旁組織中的表達。結(jié)果：結(jié)腸癌組織中P16蛋白陽性表達率明顯低于癌旁組織，CyclinD1和PKC-α陽性表達率明顯高于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計學意義。結(jié)論：結(jié)腸癌的發(fā)生與CyclinD1、PKC-α高表達和P16低表達均有關(guān)，P16蛋白可作為結(jié)腸癌早期診斷、臨床生物學行為和預后評估的重要指標。

關(guān)鍵詞結(jié)腸癌；P16；CyclinD1；PKC-α

結(jié)腸癌的發(fā)病率和死亡率在我國消化系統(tǒng)惡性腫瘤中位居第3位[1],臨床上早期發(fā)現(xiàn)，早期診斷，準確評估預后至關(guān)重要，及時有效的治療，可以提高患者的生存率，改善預后，發(fā)現(xiàn)高度敏感、高度特異的相應標志物，對于挽救結(jié)腸癌患者生命，降低其死亡率尤為重要。P16是目前發(fā)現(xiàn)的第1個直接抑制惡性腫瘤發(fā)生的基因蛋白[2]。其蛋白產(chǎn)物是細胞周期G1期到S期的調(diào)節(jié)蛋白,多數(shù)消化道惡性腫瘤組織中細胞周期素D1(CyclinD1)頻發(fā)過度表達[3]。蛋白激酶C-α(PKC-α)是一類在細胞信號轉(zhuǎn)導，增殖調(diào)控和腫瘤發(fā)生中具有重要作用的絲/蘇氨酸蛋白激酶[4]。充分臨床研究數(shù)據(jù)證明消化道惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展與P16、CyclinD1和PKC-α關(guān)系密切。本研究利用免疫組化法檢測P16、CyclinD1和PKC-α在結(jié)腸癌組織中的表達，了解三者與結(jié)腸癌的關(guān)系，進而揭示其對結(jié)腸惡性腫瘤發(fā)病病因的意義。

1材料與方法

1.1實驗材料搜集沈陽醫(yī)學院附屬中心醫(yī)院普外科、消化科送檢病理教研室的2015年1月至7月術(shù)后結(jié)腸癌和相應的癌旁組織標本70例。其中男性患者37例，女性患者33例，年齡35～84歲，平均年齡為61歲。高分化33例，中分化21例，低分化17例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移39例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移31例。Duke’s分期：A期3例；B1期14例，B2期12例；C1期19例，C2期19例；D期3例(肝臟轉(zhuǎn)移)。

主要儀器：光學顯微鏡，石蠟切片機，染色缸，冰瓶高壓鍋等。

主要試劑：鼠抗人P16、鼠抗人CyclinD1單克隆抗體、SP試劑盒、DAB試劑盒購自北京中山生物制品有限公司，兔抗人PKC-α購自武漢博士德公司。

所有患者術(shù)前均未行放療和化療。標本均用 10%中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片，所有組織均經(jīng)病理學證實。

1.2實驗方法常規(guī)免疫組織化學S-P染色方法，CyclinD1經(jīng)微波抗原修復；P16、CyclinD1和PKC-α抗體的免疫產(chǎn)物均用過氧化物酶-DAB顯色，抗體效價分別為1∶40、1∶50、1∶50；免疫組化陰性對照采用一抗為PBS替代，陽性對照為試劑盒提供的人結(jié)腸癌對照片。

1.3結(jié)果判定標準P16陽性主要表達在細胞漿及細胞核，CyclinD1陽性主要表達在細胞核，PKC-α陽性主要表達在細胞漿及細胞核，以細胞中相應部位出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細胞。參照Fromowitz方法，在高倍鏡下對細胞內(nèi)反應如下評分：(1)無著色為0，淡黃色為1，棕黃色為2，棕褐色為3[5]；(2)陽性范圍：< 5%為0，5% ～25 %為1，26%～50% 為2，51%～70%為3，>70%為4[6]。兩項結(jié)果相加<2為陰性(-)，2～3為弱陽性(+)，4～5為中度陽性(++)，6～7為強陽性(+++)[7]。

1.4統(tǒng)計學方法采用SPSS 18.0軟件包進行數(shù)據(jù)處理。組間比較采用χ2檢驗，P﹤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1P16在結(jié)腸癌組織中的表達及與臨床指標的關(guān)系結(jié)腸癌組織中P16陽性表達率為41.4%(29/70),明顯低于癌旁組織[65.7%(46/70)]，并與Duke’s分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P﹤0.05)。見表1。

表1　P16在結(jié)腸癌組織中的表達與臨床指標的關(guān)系

2.2CyclinD1在結(jié)腸癌組織中的表達及與臨床指標的關(guān)系CyclinD1在結(jié)腸癌組織中陽性表達率為62.9%(44/70)，明顯高于癌旁組織[47.1%(33/70)]，在Duke’s分期高、分化程度低、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織中CyclinD1表達明顯升高(P﹤0.05)。見表2。

表2　CyclinD1在結(jié)腸癌組織中的表達及與臨床指標的關(guān)系

2.3PKC-α在結(jié)腸癌組織中的表達及與臨床指標的關(guān)系結(jié)腸癌組織中PKC-α陽性表達率為65.7%(46/70)，明顯高于癌旁組織[38.5%(27/70)]，并隨著Duke’s分期高和分化程度低、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯上調(diào)(P<0.05)。見表3。

表3　PKC-α在結(jié)腸癌組織中的表達及與臨床指標的關(guān)系

2.4結(jié)腸癌組織中P16、CyclinD1和PKC-α表達的相關(guān)性對結(jié)腸癌組織中P16、CyclinD1和PKC-α的表達進行相關(guān)性的分析，結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織中CyclinD1和PKC-α具有明顯的正相關(guān)性；P16和CyclinD1及PKC-α之間，均無明顯相關(guān)性(P>0.05)。

2.5P16、CyclinD1和PKC-α在結(jié)腸癌組織中表達的病理結(jié)果P16、CyclinD1及PKC-α的免疫組化結(jié)果見圖1～3。

圖1　中分化結(jié)腸癌組織中P16表達(免疫組化染色×400)P16陽性主要表達在細胞漿及細胞核

圖2　中分化結(jié)腸癌組織中CyclinD1表達(免疫組化染色×400) CyclinD1陽性主要表達在細胞核

圖3　中分化結(jié)腸癌組織中PKC-α表達(免疫組化染色×400)PKC-α陽性主要表達在細胞漿及細胞核

3討論

人體細胞的正常生長依賴于細胞周期中各種調(diào)節(jié)因子的平衡調(diào)控，任何一種調(diào)控因子發(fā)生紊亂將導致細胞異常增殖 ，從而誘發(fā)腫瘤[8]。已經(jīng)證實，結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展過程涉及到多種基因的調(diào)控，細胞周期過程中癌基因蛋白的激活與抑癌基因蛋白的失活等是造成細胞惡性增殖、轉(zhuǎn)化的重要因素。研究發(fā)現(xiàn)，P16、CyclinD1及PKC-α均為重要的細胞周期蛋白，任何因素導致這些蛋白異常表達時，引起細胞周期調(diào)節(jié)失控，導致腫瘤的發(fā)生和惡性演進[9]。

本研究可見，結(jié)腸癌組織中P16蛋白陽性表達率明顯低于癌旁組織，臨床分期A、B期高于臨床分期C、D期；在高分化組陽性表達率明顯低于中低分化組；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組明顯高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組。由此提示，結(jié)腸癌發(fā)生和發(fā)展與P16蛋白表達下調(diào)有關(guān)，有文獻報道，結(jié)腸癌組織分化程度、Duke’s分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等與P16蛋白表達密切相關(guān)。它是直接作用于細胞周期的抑癌因子，將細胞周期控制和癌基因兩個曾經(jīng)獨立的研究領(lǐng)域連接在一起，有可能成為癌癥基因治療的新方向?？煽紤]將P16蛋白作為判斷結(jié)腸癌惡性程度的一個臨床指標。CyclinD1、PKC-α在結(jié)腸癌中的過度表達，與結(jié)腸癌的分化程度、轉(zhuǎn)移相關(guān)。二者隨分化程度的降低、臨床分期越高、轉(zhuǎn)移的發(fā)生而出現(xiàn)表達量上調(diào)，在結(jié)腸癌的發(fā)生及發(fā)展中CyclinD1、PKC-α過表達關(guān)系密切。通過檢測CyclinD1、PKC-α變化，可以幫助判斷臨床結(jié)腸惡性腫瘤患者腫瘤轉(zhuǎn)移及惡性度、判斷預后有著極其重要意義，為臨床結(jié)腸癌治療和評估預后提供有力幫助。

綜上所述，本實驗運用了免疫組織化學S-P染色方法研究了P16、CyclinD1和PKC-α在結(jié)腸癌及癌旁組織中的表達及其意義。CyclinD1和PKC-α明顯相關(guān)，P16和CyclinD1及PKC-α之間均無明顯相關(guān)。P16蛋白的表達下降及CyclinD1和PKC-α蛋白的過度表達可能導致細胞異常增殖為結(jié)腸癌的生物學行為的指標，為幫助臨床結(jié)腸癌患者的治療及進一步評估結(jié)腸癌患者的預后，進而采用更加有效的治療措施有著重大意義。由于本實驗經(jīng)費和實驗條件的限制，無法進一步從基因水平研究它們的作用機制，待今后條件允許后進一步完善。

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Expression of P16,CyclinD1 and PKC-α in Colon Carcinoma Tissue and Its Significance

JIANG Han,HE Wei,YU Anshi,LIU Fang

(Departrent of Gastroenterology,The Central Hospital Affiliated to Shenyang Medical College,Shenyang 110024，China)

AbstractObjective:To study the expressions of P16, CyclinD1 and PKC-α in colon caranoma tissues, and the their relationships with clinical index of colon carcinoma.Method:S-P immunohistochemical staining was used to detect the expressions of P16, CyclinD1 and PKC-α in 70 case of colon carcinoma tissues and adjacent tissues.Results:Possitive rate of P16 protein expression in colon carcinoma tissue was obviously lower than that in adjacent tissue，positive rate of CyclinD1 and PKC-α expressions were obviuosly higher than that in adjacent tissues.There were significant differences.Conclusions:The occurrence of the colon carcinoma has relation with high expressions of CyclinD1 and PKC-α, and the low expression of P16.P16 protein can be used as the important index of early diagnosis of colon carcinoma, clinical biological behavior and prognostic evaluation.

Key wordscolon carcinoma；P16；CyclinD1；PKC-α

收稿日期2015-07-19

doi:10.3969/j.issn.1008-2344.2015.04.007

中圖分類號R135.35

文獻標識碼A

文章編號1008-2344(2015)04-0215-03

作者簡介姜晗(1979—)，男(漢)，主治醫(yī)師，研究方向：臨床腫瘤病理學.E-mail:jianghan2002@163.com

基金項目沈陽醫(yī)學院科技基金項目(No.20142047)