陳威丞　芮　蕾溫漢春朱繼金.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管研究所，廣西　南寧　5300;.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院急診科，廣西　南寧　5300

血管緊張素Ⅱ?qū)θ诵呐K微血管內(nèi)皮細(xì)胞神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1表達(dá)和分泌的影響

陳威丞1芮蕾2溫漢春2朱繼金2
1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管研究所，廣西南寧530021;
2.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院急診科，廣西南寧530021

【摘要】目的:探討血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)對(duì)人源性心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HCMECs)的影響。方法:在正常培養(yǎng)條件下，將100 nmol/L AngⅡ加入細(xì)胞中，與HCMECs共孵育12h，用蛋白印跡法檢測(cè)和細(xì)胞酶聯(lián)免疫法分別檢測(cè)神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1(NRG－1)的蛋白表達(dá)和神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1亞集(NRG－1β)分泌情況。結(jié)果:與空白組比較，AngⅡ處理組的NRG－1的蛋白表達(dá)和NRG－1β的分泌降低(P＜0.05)。結(jié)論: AngⅡ能減少HCMECs的NRG－1的表達(dá)和NRG－1β分泌。

【關(guān)鍵詞】人源性心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞;神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白－1;血管緊張素Ⅱ;表達(dá)影響

Effects of angiotensinⅡon expression and secretion of neuregulin－1 in human cardiac microvascular endothelial cells

CHEN Wei－cheng1，RUI Lei2，WEN Han－chun2，ZHU Ji－jin2
1．Institute of Cardiovascular Diseases of the first Affilated Hospital，Guangxi Medical University，Naning 530021，China;
2．Department of Emergency of the First Affiliated Hospital，Guangxi Medical University，Nanning 530021，China

Abstract:Objective To study the effects of angiotensinⅡ(AngⅡ)on expression of neuregulin－1(NRG－1)and secretion of NRG－1β in human cardiac microvascular endothelial cells(HCMECs)．Methods Under normal culture conditions，the 100 nmol/L AngⅡadded into the HCMECs，and detected expression and secretion of NRG－1 with Western blot and ELISA after 12 hours incubation．Results In AngⅡtreatment group，the expression of NRG－1 and the secretion level of NRG－1β significantly decreased compared with the control group(P＜0.05)．Conclusion AngⅡcould reduce the expression of NRG－1 and the secretion of NRG－1β．

Key words:HCMECs; NRG－1; angiotensinⅡ; effect expression

NRG－1是表皮生長(zhǎng)因子家族的成員之一，是一個(gè)穿膜多肽生長(zhǎng)因子的子集，屬于表皮生長(zhǎng)因子家族，表達(dá)于神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、乳腺、腸和腎臟。NRG－1通過(guò)酪氨酸激酶受體(ErbB2、ErbB3和ErbB4)介導(dǎo)其生物學(xué)效應(yīng)，ErbB2雖然不與NRG－1直接結(jié)合，但可與ErbB3和ErbB4結(jié)合后形成異源二聚體，NRG－1可通過(guò)反式磷酸化過(guò)程引起ErbB2形成異源二聚體發(fā)生磷酸化，從而促進(jìn)下游信號(hào)通路傳導(dǎo)，激活其下游信號(hào)通路促絲裂原活化蛋白激酶和磷脂酰肌醇－3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)途徑。微血管內(nèi)皮細(xì)胞是位于循環(huán)血液與組織液之間的單層上皮細(xì)胞，構(gòu)成血管通透性的物理屏障，保證血管內(nèi)外的物質(zhì)交換。NRG－1在血管生成和心力衰竭中起著不可缺少的作用。近期研究表明[1]，聚乳酸聚乙醇酸共聚物微粒裝載NRG－1和酸性纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子可以用來(lái)改善急性心肌梗死后的心臟功能，是通過(guò)增加血管生成，抑制心肌重構(gòu)。

1　材料和方法

1.1儀器與試劑人源性心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞株(編號(hào)6000)，胎牛血清25ml(編號(hào)8248)，雙抗(編號(hào)0106)，纖維連接蛋白原液(編號(hào)0103)，內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)添加劑(編號(hào)0113)，胰酶(編號(hào)0113)(上述試劑全購(gòu)自美國(guó)Sciencell公司)，DMEM低糖培養(yǎng)基(編號(hào)31600－034，購(gòu)自Gibco公司)，NRG－1抗體(編號(hào)MAB3771，購(gòu)自美國(guó)RD公司)，內(nèi)參抗體GAPDH(編號(hào)FL－335: ZS25778，購(gòu)自中國(guó)中杉金橋公司)，人源性NRG－1β酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法試劑盒(編號(hào)119－14819，購(gòu)自美國(guó)RayBiotech公司)，超低溫冰箱(DW－86L388型中國(guó)海爾公司)，5% CO2培養(yǎng)箱(編號(hào)3110，購(gòu)買于美國(guó)Thermo Electron公司)。

1.2HCMECs培養(yǎng)細(xì)胞復(fù)蘇前準(zhǔn)備一瓶含有纖維膜的培養(yǎng)瓶(復(fù)蘇前2h在空培養(yǎng)瓶25cm，加入4ml無(wú)血清的培養(yǎng)基，然后加入25μl纖維連接蛋白原液，放入37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)2h以后取出液體，造纖維膜成功)取人源性心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞株常規(guī)復(fù)蘇后，本研究室常規(guī)傳代培養(yǎng)，每瓶培養(yǎng)瓶都用25μl纖維連接蛋白原液，造出纖維膜，37°C、5%CO2培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)成單層達(dá)80%到90%的培養(yǎng)面積，用0.25%胰酶消化，傳代，用5、6代HCMECs用于實(shí)驗(yàn)。

1.3蛋白免疫印跡檢測(cè)NRG－1蛋白表達(dá)收集各組細(xì)胞分別裝入到小EP管中，加入裂解液和PMSF提取細(xì)胞總蛋白，Bradford法測(cè)定蛋白的濃度，取蛋白樣品10 %聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，待電泳完畢，NRG－1用100mA的電流轉(zhuǎn)膜，內(nèi)參轉(zhuǎn)60min，NRG－1轉(zhuǎn)90min，將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，在室溫下用脫脂奶粉封閉后，分別加入鼠抗人多克隆抗體NRG－1(1∶500)，4°C孵育過(guò)夜，漂洗后加二抗(1∶5000)，37℃孵育1h，漂洗后去暗室X光膠片曝光，加入ECL發(fā)光劑，暗房顯影，用Quantity One軟件分析目標(biāo)條帶的灰度值，以目標(biāo)條帶灰度值與內(nèi)參條帶灰度值的比值作為目的基因蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.4酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)NRG－1β蛋白的分泌收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液分別裝入到3KD的millipore蛋白離心管中，在角度轉(zhuǎn)子離心機(jī)中溫度調(diào)定為4°C，用5000離心力離心

1h，剩余大概250μl左右，放入－80℃冰箱備用。使用前將所有的試劑和樣品放在室溫中0.5h，將準(zhǔn)備好的100μl標(biāo)準(zhǔn)品和樣品分別加入到相應(yīng)的孔中，蓋好以后，在室溫中輕輕搖動(dòng)孵育2.5h，棄去溶液，用已經(jīng)準(zhǔn)備好的300μl洗滌液洗4次，最后一次洗滌要把洗滌液完全移去，然后加入100μl制備好生物素標(biāo)記抗體到每個(gè)孔中，在室溫中輕輕搖動(dòng)孵育1h，棄去溶液，用每次300μl洗滌液洗4次，棄去溶液并加入制備好的HRP溶液到每個(gè)孔中，在室溫中輕輕搖動(dòng)孵育45min，棄去溶液，每次用300μl洗滌液洗4次，然后加入100μl TMB到每個(gè)孔中，避光輕輕搖動(dòng)在室溫里孵育30min，加入50μl終止液到每孔，在450nm讀數(shù)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。主要試驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)自3次以上重復(fù)試驗(yàn)，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，對(duì)主要指標(biāo)進(jìn)行正態(tài)性分布檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的多組間樣本比較采用單因素ANOVA檢驗(yàn)，用LSD方法進(jìn)行兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1光鏡下細(xì)胞形態(tài)觀察倒置顯微鏡下觀察HCMECs生長(zhǎng)成一個(gè)融合單層，細(xì)胞的形態(tài)呈菱形和多邊形。如圖1。

圖1　第6代HCMECs

圖2　蛋白免疫印跡檢測(cè)各組NRG－1蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較

2.2蛋白免疫印跡檢測(cè)NRG－1蛋白相對(duì)表達(dá)量與空白組(0.26±0.02)pg/ml相比，AngⅡ處理組(0.11± 0.01)pg/ml能下調(diào)NRG－1的表達(dá)，如圖2。

2.3酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)NRG－1β蛋白的分泌與空白組(378.71±12.96)pg/ml相比，AngⅡ處理組(306 ±16.78)pg/ml能下調(diào)NRG－1β的分泌，如圖3。

圖3　酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)各組NRG－1β蛋白的分泌

3　討論

本研究發(fā)現(xiàn)，AngⅡ明顯減少HCMECs的NRG－1表達(dá)和NRG－1β分泌。

在成人心臟中，NRG－1主要由內(nèi)皮細(xì)胞和微血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)和釋放，而在大的冠狀動(dòng)脈、靜脈及主動(dòng)脈卻不表達(dá)。內(nèi)皮功能不全的一個(gè)重要的特征是一氧化氮/內(nèi)皮素水平導(dǎo)致的內(nèi)皮收縮舒張血管功能異常。在各種病理因素的作用下，內(nèi)皮細(xì)胞可以分泌多種內(nèi)源性活性物質(zhì)促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊和血栓的形成。有研究證實(shí)，冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮功能失調(diào)與脂質(zhì)斑塊形成有關(guān)[2]。有大量的實(shí)驗(yàn)研究表明，心內(nèi)膜和冠狀微血管中的心臟血管內(nèi)皮細(xì)胞直接影響心臟的機(jī)械性能、生長(zhǎng)和相鄰的心肌的節(jié)律。這些影響可能是由擴(kuò)散物質(zhì)引起的(如氧化氮，前列腺素和內(nèi)皮素－1)，然而近期研究表明是NRG－1介導(dǎo)這些調(diào)節(jié)的[3]。內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞之間的非旁分泌相互作用，涉及血管內(nèi)皮依賴性的電化學(xué)梯度[4]。內(nèi)皮細(xì)胞的活化和隨后的功能障礙發(fā)生相應(yīng)于生理和病理生理的刺激，并且在心血管穩(wěn)態(tài)和疾病的早期[3]。NRG1－ErbB信號(hào)在心臟的發(fā)育及維持人類成年心臟結(jié)構(gòu)和功能的完整性中有不可或缺的作用，現(xiàn)在一些動(dòng)物研究已經(jīng)證明[5]，在急性心肌損傷和慢性心力衰竭期間重組NRG1的治療效果，它能改善動(dòng)物的心功能，提高動(dòng)物的存活率。在高糖的狀態(tài)下和誘導(dǎo)糖尿病的大鼠模型中已證實(shí)可以降低NRG－1的表達(dá)，這項(xiàng)發(fā)現(xiàn)支持我們的研究結(jié)果，AngⅡ能明顯降低HCMECs的NRG－1表達(dá)和NRG－1β分泌，心力衰竭的患者由于RAAS的過(guò)度激活，體內(nèi)AngⅡ持續(xù)處于高水平狀態(tài)，AngⅡ可抑制HCMECs表達(dá)NRG－1，導(dǎo)致機(jī)體NRG－1持續(xù)處于低水平

狀態(tài)導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡，加大心肌細(xì)胞數(shù)量的減少;可促使機(jī)體發(fā)生病理反應(yīng)，造成心臟的損傷;并可促進(jìn)平滑肌增生，也導(dǎo)致血管狹窄。我們的研究證實(shí)了當(dāng)AngⅡ增高的時(shí)候，AngⅡ能明顯降低HCMECs的NRG－1表達(dá)和NRG －1β分泌，影響心臟的功能。臨床上慢性心力衰竭的患者給予血管緊張素受體拮抗劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑類及β受體阻滯劑能明顯改善生存率，這或許與促進(jìn)NRG－1的表達(dá)有關(guān)。

本研究證實(shí)，AngⅡ能降低HCMECs的NRG－1表達(dá)和NRG－1β分泌，推測(cè)可在心力衰竭的病人中通過(guò)增加NRG －1來(lái)提高心臟的功能，但這需要大量的臨床試驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步證實(shí)。

參考文獻(xiàn)

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收稿日期:( 2014.11.08)

基金項(xiàng)目:國(guó)家臨床重點(diǎn)?？平ㄔO(shè)項(xiàng)目(衛(wèi)辦醫(yī)政函[2012]649號(hào))。

【文章編號(hào)】1007－8517(2015)03－0018－03

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

【中圖分類號(hào)】R541.6