王麗娜，高　飛，朱曉彤，高　萍，王松波，江青艷，習(xí)欠云，張永亮，吳仕林，束　剛(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，廣東廣州5064;廣州智特奇生物科技股份有限公司，廣東廣州50663)

不同有機(jī)酸對斷奶仔豬腸道厭氧培養(yǎng)微生物菌群的影響

王麗娜1，高飛1，朱曉彤1，高萍1，王松波1，江青艷1，習(xí)欠云1，張永亮1，吳仕林2，束剛1
(1華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，廣東廣州510642;2廣州智特奇生物科技股份有限公司，廣東廣州510663)

摘要:【目的】建立仔豬腸道微生物菌群調(diào)控的離體模型，并研究有機(jī)酸對斷奶仔豬腸道微生物菌群的影響.【方法】每次試驗(yàn)選取2頭40日齡杜×(長×大)仔豬，屠宰后取其空腸和回腸混合食糜，按照每管300 μL分裝于2 mL離心管，分別添加30 mmol·L－1不同有機(jī)酸(甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸、富馬酸、檸檬酸、苯甲酸、蘋果酸和山梨酸)，置于厭氧工作站中，厭氧培養(yǎng)4 h后提取食糜中基因組DNA，應(yīng)用絕對定量PCR技術(shù)測定食糜中乳桿菌屬Lactobacillus、雙歧桿菌屬Bifidobacterium、沙門菌屬Salmonella和大腸埃希菌Escherichia coli的數(shù)量變化.隨后進(jìn)一步選擇抑菌活性較強(qiáng)的甲酸、乙酸、丁酸、乳酸、檸檬酸研究其抑菌活性的濃度梯度效應(yīng).【結(jié)果和結(jié)論】成功建立了體外全食糜厭氧培養(yǎng)體系，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲酸、丁酸和檸檬酸能呈劑量依賴性地抑制細(xì)菌增殖，而乙酸對總菌數(shù)量影響不大;對益生菌而言，檸檬酸能顯著抑制乳桿菌屬和雙歧桿菌屬的增殖，但低劑量的乳酸(10 mmol·L－1)能顯著促進(jìn)乳桿菌屬和雙歧桿菌屬的增殖，且低劑量的乙酸(15 mmol·L－1)也能促進(jìn)雙歧桿菌屬的增殖;所選擇的有機(jī)酸在濃度達(dá)到10～15 mmol·L－1時，均能有效抑制病原菌(沙門菌和大腸埃希菌)的增殖.

關(guān)鍵詞:有機(jī)酸;斷奶仔豬;腸道微生物;厭氧培養(yǎng)

王麗娜，高飛，朱曉彤，等.不同有機(jī)酸對斷奶仔豬腸道厭氧培養(yǎng)微生物菌群的影響［J］.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2015，36(6):9-14.

優(yōu)先出版時間:2015-10-16

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動物腸道存在數(shù)量眾多和種類各異的微生物，既包括乳酸桿菌和雙歧桿菌等有益菌，也存在沙門菌和大腸埃希菌等致病菌或條件致病菌［1］.腸道內(nèi)正常微生物菌群不僅是腸道內(nèi)抵抗外來病原菌以及內(nèi)源條件致病菌的第一道防線，而且也是影響動物腸道發(fā)育和消化吸收功能的重要因素［2-3］.仔豬，尤其是從出生到斷奶前后的仔豬，由于腸道發(fā)育尚不成熟，其腸道微生態(tài)的平衡容易受到氣候、斷奶應(yīng)激和飼料等因素的影響，從而造成微生物菌群失調(diào)，病原微生物感染，進(jìn)而出現(xiàn)腹瀉甚至導(dǎo)致仔豬死亡［4］.因此，如何調(diào)節(jié)仔豬腸道微生物區(qū)系，改變有益菌和病原菌的比例，對養(yǎng)豬生產(chǎn)具有重要意義.

長期以來，抗生素一直被認(rèn)為是抑制豬腸道病原微生物的首選添加劑.但抗生素濫用所造成的藥物殘留和細(xì)菌耐藥性等問題也日益凸顯.近年來的大量動物試驗(yàn)研究表明，酸制劑在降低腸道pH、提高飼料蛋白消化率和抑制有害微生物生長等方面均發(fā)揮著重要的作用［5］，因而被認(rèn)為是能有效替代抗生素的飼料添加劑之一［6］.目前養(yǎng)殖生產(chǎn)中常用的酸制劑的種類和組合多樣，既包括各種單一有機(jī)酸及其鹽和無機(jī)酸，又包括各種復(fù)合酸［7］.由于動物活體試驗(yàn)存在干擾因素多，動物個體差異大和試驗(yàn)重復(fù)性差等限制，導(dǎo)致不同酸制劑以及不同酸制劑組合之間的效果往往難以進(jìn)行客觀的評價和系統(tǒng)性地比較.

為快速便捷地測定有機(jī)酸對有害微生物的抑菌效應(yīng)，研究人員多選擇標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)［8－9］.但標(biāo)準(zhǔn)菌株既不能完全代表腸道野生菌株，同時又忽略了腸道內(nèi)多種微生物之間的互作效應(yīng)，其研究結(jié)果往往也很難在活體動物試驗(yàn)中得到重復(fù)驗(yàn)證.因此，本試驗(yàn)利用體外厭氧共培養(yǎng)技術(shù)，分離培養(yǎng)仔豬小腸內(nèi)微生物，并利用16S rRNA定量分析食糜內(nèi)微生物菌群的數(shù)量.研究結(jié)果不僅可以為有機(jī)酸的效價分析提供有效的體外模型，而且對于養(yǎng)豬生產(chǎn)中有機(jī)酸種類和劑量的選擇同樣具有指導(dǎo)意義.

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

有機(jī)酸:甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸、富馬酸、檸檬酸、苯甲酸、蘋果酸和山梨酸，均為廣州吉祥生物科技有限公司產(chǎn)品，為分析純.

1.2試驗(yàn)動物和厭氧培養(yǎng)

每次選擇2頭35日齡健康斷奶仔豬(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)原種豬場)，于代謝籠中飼養(yǎng)(飼糧配方見表1) 5 d后，屠宰取其空腸和回腸內(nèi)食糜，放入冰浴的燒杯中，用保鮮膜封口后置于厭氧工作站(試驗(yàn)開始前用氮?dú)夂投趸蓟旌蠚怏w將厭氧工作站內(nèi)氧氣排盡，溫度調(diào)節(jié)至39℃)中，并攪拌混勻，按照每管300 μL食糜分裝于40個2 mL離心管中.40個離心管隨機(jī)分成4組，即未培養(yǎng)組、空白培養(yǎng)組、5 mg·mL－1氨芐青霉素組(5 mg·mL－1AMP)和10 mg·mL－1氨芐青霉素組(10 mg·mL－1AMP).其中，未培養(yǎng)組和空白培養(yǎng)組添加100 μL無菌生理鹽水，抗生素組添加不同劑量氨芐青霉素.除未培養(yǎng)組外，其余3組均厭氧培養(yǎng)4 h后立即置于－20℃保存?zhèn)溆?采用定量PCR檢測微生物菌群，每個處理設(shè)10個重復(fù).

1.3有機(jī)酸對全食糜厭氧培養(yǎng)體系微生物菌群的影響

按照“1.2”方法制備仔豬腸道食糜，分別采用30 mmol·L－1的甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸、富馬酸、檸檬酸、苯甲酸、蘋果酸和山梨酸培養(yǎng)食糜4 h.采用定量PCR檢測有機(jī)酸對食糜內(nèi)微生物菌群的影響.隨后選擇抑菌活性較強(qiáng)的甲酸、乙酸、丁酸、乳酸、檸檬酸，每種有機(jī)酸分別設(shè)置5、10、15、20、25和30 mmol·L－1濃度梯度，研究這些有機(jī)酸抑菌活性的濃度梯度效應(yīng).有機(jī)酸與食糜厭氧條件下共培養(yǎng)4 h后立即置于－20℃保存?zhèn)溆?每個處理設(shè)10個重復(fù).

表1　飼糧配方表(風(fēng)干基礎(chǔ))Tab.1 Diet formulations (air dry basis)

1.4引物設(shè)計

根據(jù)NCBI中GenBank發(fā)表的基因序列，用Primer Premier 5. 0軟件設(shè)計不同菌屬16S rRNA的上、下游引物(表2)，引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成.

1.5細(xì)菌DNA的提取

食糜解凍后，定量稱取300 mg于離心管中，加入50 μL溶菌酶，輕輕振蕩混勻，于37℃水浴放置30 min，隨后加入40 μL的0. 1 g·mL－1SDS和10 μL蛋白酶K，65℃水浴20 min后加入5 mol·L－1NaCl 100 μL于65℃水浴10 min.采用酚/三氯甲烷/異戊醇法提取DNA.所得DNA用體積分?jǐn)?shù)為75%的預(yù)冷乙醇洗滌沉淀并干燥，最后用含有終質(zhì)量濃度為20 μg·μL－1RNAase的滅菌TE Buffer溶解沉淀，于37℃水浴中孵育30 min.所得DNA樣品置于－20℃保存?zhèn)溆?

表2　熒光定量PCR引物一覽表Tab.2 Primer sequences used in real-time PCR analyses

1.6 16S rRNA定量分析

采用Mx3005P型實(shí)時熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增與分析，20 μL反應(yīng)體系包括基因組DNA 1 μL，上、下游引物(10 μmol·L－1) 1 μL，RealtimePCR Master Mix(含熒光染料SYBR green) 10 μL，ddH2O 8 μL.反應(yīng)程序?yàn)? 95℃預(yù)變性1 min; 95℃變性15 s，58～61℃退火15 s，72℃延伸30 s，共40個循環(huán)后結(jié)束.PCR產(chǎn)物膠回收后制作標(biāo)準(zhǔn)曲線.擴(kuò)增結(jié)果用Mx3005P型實(shí)時熒光定量PCR儀進(jìn)行分析并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線.細(xì)菌數(shù)量(以拷貝數(shù)計)采用下列公式計算:

式中，C表示各樣品根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到的DNA濃度，單位μg·μL－1; S表示待測細(xì)菌基因組DNA的定量PCR產(chǎn)物的堿基數(shù); V表示從單位質(zhì)量食糜中獲取的DNA溶液體積，單位μL.

1.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計

數(shù)據(jù)采用SPSS19. 0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，檢驗(yàn)試驗(yàn)數(shù)據(jù)的正態(tài)分布性，對不同處理組間的數(shù)值進(jìn)行單因素方差分析(Analysis of variance，ANOVA)和獨(dú)立t檢驗(yàn)(Independent samples t test).數(shù)值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示.

2　結(jié)果與分析

2.1斷奶仔豬腸道食糜厭氧培養(yǎng)效果鑒定

經(jīng)過4 h厭氧培養(yǎng)后，食糜中總菌和各菌屬的數(shù)量均急劇增加，添加5和10 mg·mL－1氨芐青霉素可極顯著抑制總菌、沙門菌屬和大腸埃希菌的數(shù)量(表3).氨芐青霉素對乳桿菌屬和雙歧桿菌屬也有顯著抑制作用，但抑菌活性相對較弱.上述結(jié)果表明該體外培養(yǎng)模型可用于后續(xù)試驗(yàn).

2.2不同種類有機(jī)酸對仔豬全食糜培養(yǎng)體系微生物菌群的影響

試驗(yàn)選取的10種有機(jī)酸對微生物菌群的影響如表4所示.結(jié)果發(fā)現(xiàn):與對照組相比，30 mmol·L－1甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸和山梨酸能提高乳桿菌屬數(shù)量2倍以上，而丁酸、乳酸和山梨酸能顯著提高雙歧桿菌屬數(shù)量1. 4～2. 0倍.對于病原菌，檸檬酸、甲酸、乙酸和蘋果酸表現(xiàn)出對大腸埃希菌和沙門菌屬較強(qiáng)的抑菌效應(yīng).與對照組相比，檸檬酸、甲酸、乙酸、蘋果酸、丁酸和乳酸處理組沙門菌數(shù)僅分別為對照組的5. 2%、7. 8%、10. 0%、10. 1%、12. 6%和17. 4%，大腸埃希菌數(shù)僅分別為對照組的5. 5%、11. 2%、12. 7%、 16. 1%、20. 2%和40. 0%.因此，30 mmol·L－1情況下綜合各種有機(jī)酸對有益菌和有害菌的效應(yīng)，甲酸和乙酸可以有效提高乳桿菌的數(shù)量，抑制有害菌的繁殖，但對雙歧桿菌沒有顯著的促進(jìn)作用;檸檬酸對有害菌具有最強(qiáng)的抑制作用，但是對有益菌也表現(xiàn)出抑制作用;只有丁酸和乳酸既能夠有效促進(jìn)有益菌的繁殖，又能較有效地抑制有害菌.

表3　斷奶仔豬腸道食糜體外厭氧培養(yǎng)效果1)Tab.3 The construction of in vitro anaerobic culture system for total chyme from the small intestine of weaned piglets

表4　不同種類有機(jī)酸對仔豬空腸和回腸中厭氧培養(yǎng)微生物菌群的影響1)Tab.4 The effects of organic acids on intestinal bacteria profiles in vitro anaerobic culture system

2.3有機(jī)酸調(diào)控仔豬全食糜培養(yǎng)體系微生物菌群的劑量效應(yīng)

為進(jìn)一步研究有機(jī)酸調(diào)控豬腸道微生物菌群的劑量效應(yīng)，試驗(yàn)選擇甲酸、乙酸、丁酸、乳酸和檸檬酸，分別設(shè)置6個濃度梯度進(jìn)行試驗(yàn).試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，甲酸、丁酸和檸檬酸能呈現(xiàn)劑量依賴性地抑制細(xì)菌增殖，而乙酸對總菌數(shù)量影響不大(圖1A).對益生菌而言，檸檬酸能顯著抑制乳桿菌屬和雙歧桿菌屬的增殖，但低劑量的乳酸(10 mmol·L－1)能顯著促進(jìn)乳桿菌屬和雙歧桿菌屬的增殖(圖1B、1C)，且低劑量的乙酸(15～20 mmol·L－1)也能促進(jìn)雙歧桿菌屬的增殖(圖1C).所選擇的5種有機(jī)酸在濃度達(dá)到10～15 mmol·L－1時，均能有效抑制病原菌(沙門菌和大腸埃希菌)的增殖(圖1D、1E).因此，體外厭氧培養(yǎng)條件下使用單一有機(jī)酸時:乙酸應(yīng)使用約15 mmol·L－1，丁酸約15 mmol·L－1，乳酸約10～15 mmol·L－1，檸檬酸只能使用約5 mmol·L－1.

圖1　不同濃度有機(jī)酸對斷奶仔豬全食糜培養(yǎng)體系微生物菌群的影響Fig.1　 The effects of different levels of concentration on organic acids on intestinal bacteria profiles in vitro total chyme anaerobic culture system

綜上所述，體外厭氧培養(yǎng)條件下使用單一有機(jī)酸調(diào)節(jié)微生物菌群，15 mmol·L－1乙酸和10～15 mmol·L－1乳酸是較好的選擇.

3　討論與結(jié)論

3.1不同有機(jī)酸對腸道有害菌的影響

多數(shù)研究顯示，有機(jī)酸在抑制腸道病原菌(大腸埃希菌、沙門菌)方面作用顯著［10-12］，本研究待篩選的10種酸所用濃度為30 mmol·L－1，換算成質(zhì)量分?jǐn)?shù)后結(jié)果與部分文獻(xiàn)的結(jié)果也基本一致［6，13］，但關(guān)于有機(jī)酸作用效果的報道仍存在差異，主要原因包括有機(jī)酸種類的不同、添加劑量存在差異.有學(xué)者認(rèn)為有機(jī)酸抑制病原菌的機(jī)制主要有2個方面，首先是有機(jī)酸電離產(chǎn)生的氫離子，可以通過降低消化道pH間接減少細(xì)菌數(shù)量;其次，有機(jī)酸在某些復(fù)雜的酶作用下直接進(jìn)入細(xì)菌的細(xì)胞從而抑制革蘭陰性菌［14－15］.現(xiàn)有的有機(jī)酸中，已有研究表明富馬酸、檸檬酸、蘋果酸和乳酸主要通過改變pH來抑菌，而甲酸、乙酸、丙酸和山梨酸等則可以進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)，從而殺滅或抑制細(xì)菌［16］.本文中的甲酸和乙酸等對大腸埃希菌和沙門菌的抑菌活性明顯高于乳酸和富馬酸等，說明甲酸和乙酸等直接添加在體外培養(yǎng)食糜中，可能同時通過兩方面不同的機(jī)制發(fā)揮抑菌作用，因而表現(xiàn)出更強(qiáng)的抑菌活性.此外，有機(jī)酸電離氫離子的部位對其抑菌活性也有不同的影響.Gauthier等［17］則將腸道細(xì)菌分為pH敏感型(大腸埃希菌等) 和pH不敏感型(乳酸桿菌和雙歧桿菌).研究表明，未解離狀態(tài)的有機(jī)酸能夠穿透某些細(xì)菌的細(xì)胞膜，在細(xì)菌體內(nèi)發(fā)生解離，釋放出氫離子和陰離子.細(xì)胞內(nèi)pH降低，無法耐受細(xì)胞內(nèi)外pH變化的pH敏感型細(xì)菌則會由于消耗大量能量用來維持正常pH而被殺滅［18］.由此可以推測，由于檸檬酸的pKa值較低，將保留更多的未解離狀態(tài)，從而可能產(chǎn)生更強(qiáng)的抑菌活性.

3.2不同有機(jī)酸對仔豬腸道有益菌的影響

本文研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，短鏈脂肪酸和乳酸能顯著提高乳桿菌屬數(shù)量，而丁酸、乳酸和山梨酸則對雙歧桿菌屬增殖有明顯的促進(jìn)效應(yīng).陳寶江等［19］通過試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，添加酸化劑后，回腸中乳酸桿菌、厭氧菌數(shù)量呈上升趨勢，且隨著添加劑量增加，乳酸桿菌隨之上升.而且多數(shù)報道也指出，添加單一有機(jī)酸或者復(fù)合酸化劑后，腸道內(nèi)乳酸桿菌數(shù)量呈上升趨勢［20-21］，這主要是由于腸道pH降低，抑制有害微生物的活動和繁殖，從而促使有益菌繁殖［22］，由此可見，不同種類和配比的酸化劑對仔豬腸道微生物區(qū)系的影響也不盡相同.

目前對有機(jī)酸的研究大多是通過動物試驗(yàn)的方式來進(jìn)行，添加的有機(jī)酸也都通過不同的工藝方式進(jìn)行加工處理，常用的酸化劑的加工工藝有吸附混合、流化床包衣和脂埋等技術(shù)，而隨著工藝的改進(jìn)，酸化劑的使用效果將不受飼料因素影響，且緩釋性能得到極大的提高，從而導(dǎo)致不同研究中的添加劑量差異很大［23］.本文通過體外研究模型，篩選出每種酸的最佳處理濃度，以期為生產(chǎn)實(shí)踐中添加劑量的選擇提供參考.而生產(chǎn)實(shí)踐中，通過合理設(shè)置酸化劑的組合是增加腸道有益菌，降低病原菌，改善腸道健康的有效途徑.

3.3結(jié)論

綜上所述，本試驗(yàn)采用仔豬食糜離體厭氧培養(yǎng)體系，研究各種有機(jī)酸對腸道微生物菌群的影響，并初步篩選確定了體外厭氧培養(yǎng)條件下使用單一有機(jī)酸調(diào)節(jié)微生物菌群，15 mmol·L－1乙酸和10～15 mmol·L－1乳酸是較好的選擇.研究結(jié)果為進(jìn)一步優(yōu)化仔豬用有機(jī)酸制劑的配比提供了直接的試驗(yàn)依據(jù).

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【責(zé)任編輯柴焰】

Effects of different organic acids on anaerobically cultured intestinal microflora in weaned piglets

WANG Lina1，GAO Fei1，ZHU Xiaotong1，GAO Ping1，WANG Songbo1，JIANG Qingyan1，XI Qianyun1，ZHANG Yongliang1，WU Shilin2，SHU Gang1
(1 College of Animal Science，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China; 2 Guangzhou Wisdom Bio-Technology Co.，Ltd.，Guangzhou 510663，China)

Abstract:【Objective】A research model of piglet intestinal microbial flora regulation was established in vitro.The effect of organic acids on intestinal microflora of piglets was studied.【Method】In this study，for each experiment，two 40-day-old Duroc×(Landrace×large) weaned piglets were slaughtered，and the mixed chyme of jejunum and ileum was aliquoted as 300 μL every tube to 2 mL centrifuge tube，then anaerobically cultured without or with 30 mmol·L－1organic acid (including formic acid，acetic acid，propionic acid，butyric acid，lactic acid，fumaric acid，citric acid，benzoic acid，malic acid and sorbic acid，respectively).Genome DNA in chyme was extracted after 4 h anaerobic culture，and the numbers of the genus Lactobacillus，Bifidobacterium，Salmonella and Escherichia coli in the chyme were detected using the method of absolute quantitative PCR.Then five organic acids (formic acid，acetic acid，butyric acid，lactic acid and citric acid) which had a stronger antibacterial activity were selected for further studybook=10,ebook=282of its concentration gradient effects on antibacterial activities.【Result and conclusion】The total chyme anaerobic culture system was successfully established in vitro.As a result，formic acid，butyric acid，and citric acid present dose dependently inhibited the proliferation of bacteria，but acetic acid had no obvious effects on the number of total bacteria.As for probiotics，citric acid could significantly inhibit the proliferation of Lactobacillus and Bifidobacterium.However，the low dose of lactic acid (10 mmol·L－1) could significantly promote the proliferation of Lactobacillus and Bifidobacterium，and the low dose of acetic acid (15 mmol·L－1) could also promote Bifidobacterium proliferation.At the concentration levels of 10－15 mmol·L－1，all of the organic acids tested in this study effectively inhibited the proliferation of pathogenic bacteria (Salmonella and E.coli).The results of this study provide a simple and effective model for optimizing the species and optimal dose of acidifier used in pig production，and when microflora is regulated with single organic acid under the anaerobic condition，15 mmol·L－1acetic acid and 10－15 mmol·L－1lactic acids are good choices.

Key words:organic acid; weaned piglet; intestinal microflora; anaerobic culture

基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金(31272447) ;企業(yè)委托課題:豬用抗生素替代品——新型高效有機(jī)酸制劑的研發(fā)

作者簡介:王麗娜(1982—)，女，講師，博士，E-mail: wanglina@ scau.edu.cn;通信作者:束剛(1979—)，男，副教授，博士，E-mail: shugang@ scau.edu.cn

收稿日期:2014-12-09

文章編號:1001-411X(2015) 06-0009-06

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類號:S811.2