沈海燕 虞朝輝 陳春曉

●綜 述

共聚焦激光顯微內(nèi)鏡在炎癥性腸病中的應(yīng)用新進(jìn)展

沈海燕 虞朝輝 陳春曉

炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，BD）主要包括2種慢性腸道疾病—潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）和克羅恩?。–rohn′s disease，CD）。近期研究結(jié)果顯示，IBD的發(fā)生是攜帶易感基因的人體對共生微生物一次不恰當(dāng)?shù)难装Y反應(yīng)所致[1-2]。IBD在我國的發(fā)病率呈上升趨勢[3]，內(nèi)鏡檢查對診斷、監(jiān)測和評估疾病活動和程度起非常重要的作用。共聚焦激光顯微內(nèi)鏡（confocal laser endomicroscopy，CLE）可使體內(nèi)組織黏膜層在內(nèi)鏡下放大1 000倍[4]，實(shí)時觀察黏膜細(xì)胞和亞細(xì)胞水平的斷層掃描圖像，分析細(xì)胞核、腺體、毛細(xì)微血管的狀態(tài)，指導(dǎo)內(nèi)鏡下靶向活檢及組織學(xué)診斷；CLE可發(fā)現(xiàn)發(fā)育異常的病變并預(yù)測腫瘤、炎癥的高精度組織學(xué)變化；此外CLE還能預(yù)測生物制劑的治療反應(yīng)，已成為一種可以識別體內(nèi)炎癥黏膜細(xì)胞、評估黏膜炎癥活動的新方法[5]。

1 CLE的工作原理

首先，激光源發(fā)出488nm波長的激光束，激發(fā)被檢組織中的熒光物質(zhì)，不同方向的熒光物質(zhì)通過光源針孔及透鏡聚焦在觀察平面的某一點(diǎn)，該點(diǎn)反射光經(jīng)同一透鏡聚焦于觀察針孔形成點(diǎn)像，探測器通過針孔接收成像。這種成像方式之所以被稱為共聚焦成像是由于物鏡和會聚透鏡的焦點(diǎn)在同一光軸上。當(dāng)激光逐點(diǎn)掃描檢測組織時，針孔后的光電倍增管也逐點(diǎn)獲得對應(yīng)光點(diǎn)的共聚焦圖像并轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號傳輸至計(jì)算機(jī)，最終整個焦平面的共聚焦圖像在屏幕上清晰聚合。將焦平面依次設(shè)于檢測組織的不同層面上，即可逐層獲得組織相應(yīng)的光學(xué)橫斷面圖像，稱為“光學(xué)切片”。CLE在內(nèi)鏡檢查的同時還可以獲得黏膜不同層面的“光學(xué)切片”，因此被譽(yù)為“光學(xué)活檢”[6]。

2 CLE使用的對比劑

CLE是基于外源熒光劑應(yīng)用照明后組織成像顯影的。絕大多數(shù)研究常用10%熒光素鈉作為系統(tǒng)對比劑，靜脈注射數(shù)秒內(nèi)即可顯影，可在鏡下高分辨率清晰地顯示細(xì)胞及亞細(xì)胞水平的毛細(xì)血管形態(tài)、血管結(jié)構(gòu)、細(xì)胞形態(tài)等。但熒光素鈉對細(xì)胞核不顯影，故鹽酸吖啶黃作為一種局部熒光劑，常被作為系統(tǒng)檢查中細(xì)胞核顯影的補(bǔ)充使用劑。

3 CLE在炎癥性腸病中的應(yīng)用

3.1 在UC中的應(yīng)用 CLE可通過連續(xù)內(nèi)鏡下觀察評估細(xì)胞、腺窩、血管結(jié)構(gòu)，從而實(shí)時評估UC患者黏膜愈合狀況。Kiesslich等[7]、Watanabe等[8]已將CLE技術(shù)應(yīng)用于UC患者腸黏膜的實(shí)時炎癥活動性評估中。在UC中，腺窩結(jié)構(gòu)的改變是最主要的變化，主要表現(xiàn)為腺窩開口擴(kuò)大、腺窩無規(guī)律排列、腺窩間隔變大、腺窩結(jié)構(gòu)破壞及/或者腺窩融合、腺窩膿液伴熒光劑滲漏入內(nèi)腔（導(dǎo)致內(nèi)腔比周圍上皮細(xì)胞顯影更加明亮）。微血管的病變主要表現(xiàn)于膨脹、扭曲的分支血管。用CLE拍攝的圖像所提供的信息相當(dāng)于常規(guī)組織學(xué)檢查，且對于UC患者能比常規(guī)內(nèi)鏡檢查更好地區(qū)分活動和非活動期狀態(tài)[9-10]。

上皮細(xì)胞脫落是消化道黏膜正常生理過程，但過快的上皮細(xì)胞脫落可能導(dǎo)致黏膜屏障變化，每個細(xì)胞的脫落都會造成上皮間隙的形成[11],通過CLE觀察黏膜局部屏障功能的相關(guān)研究目前越來越受到重視。通過對腸黏膜屏障功能的評估可預(yù)測UC的復(fù)發(fā)，Kiesslich等[10]提出在普通白光內(nèi)鏡下黏膜愈合，但CLE觀察下存在局部黏膜屏障功能障礙的患者復(fù)發(fā)率更高，并且觀察回腸末端CLE下黏膜變化更有助于預(yù)測疾病復(fù)發(fā)風(fēng)險。

此外，CLE在定位活檢，尤其是減少無用的活檢和提高發(fā)育不良細(xì)胞的早期檢出率是有意義的。結(jié)腸直腸癌（CRC）是UC患者嚴(yán)重的并發(fā)癥，CRC占UC患者死因的10%～15%[12]。Jess等[13]報道的薈萃分析表明，在隨訪長達(dá)14年的人群隊(duì)列研究中，1.6%的UC患者被診斷出患有CRC。UC患者患CRC的風(fēng)險增加2.4倍。男性、年幼時即確診UC及廣泛的結(jié)腸炎等因素均增加CRC的風(fēng)險。因此長期UC患者需定期復(fù)查腸鏡以檢測有無早期細(xì)胞發(fā)育不良及癌變情況。CLE與染色內(nèi)鏡（CE）聯(lián)合檢查相對于白光內(nèi)鏡檢查，活檢組織數(shù)量可明顯減少，CE先判定需注意變化部位，然后再利用CLE精確判定組織結(jié)構(gòu)變化。常規(guī)UC患者白光內(nèi)鏡篩查有無組織學(xué)異常變化需活檢組織40～50塊，通過上述方法，每例患者雖然平均取活檢組織僅3.9塊，但是發(fā)育異常的檢出率提高了4倍以上[14]。

3.2 在CD中的應(yīng)用 既往內(nèi)鏡檢查多參照CD內(nèi)鏡指數(shù)(CDEIS)評估CD活動性。在一項(xiàng)54例CD病例對照研究中，運(yùn)用CLE進(jìn)行CD活動度及黏膜愈合的評估，提出依據(jù)黏膜描述制定的CLE下CD活動度評分標(biāo)準(zhǔn)（CDEAS）[15]，內(nèi)容包括隱窩、微小糜爛的出現(xiàn)、固有層血管暴露、杯狀細(xì)胞數(shù)量的改變、固有層細(xì)胞滲漏。因此可實(shí)時評估CD活動度，評判CD疾病進(jìn)程，并可評估對藥物治療的反應(yīng)。

抗腫瘤壞死因子（anti-TNF）藥物是難治性CD的主要治療藥物，但其價格昂貴。能否運(yùn)用CLE技術(shù)預(yù)測anti-TNF治療療效從而提高該藥應(yīng)用的效價比已日益得到重視。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)TNF-α?xí)黾蛹?xì)胞脫落及間隙形成。通過CLE的動態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，注射了TNF-α的小鼠出現(xiàn)大幅度細(xì)胞脫落，導(dǎo)致間隙屏障功能破壞。細(xì)胞脫落部位屏障功能的喪失導(dǎo)致上皮細(xì)胞通透性增加被推測為IBD一項(xiàng)重要發(fā)病機(jī)制[16]。在CLE內(nèi)鏡下檢測腸道腫瘤壞死因子(mTNF)活躍的免疫細(xì)胞，結(jié)果表明擁有高mTNF陽性細(xì)胞患者在后續(xù)anti-TNF的治療中，在第12周的短期應(yīng)答率達(dá)92%，顯著高于低mTNF陽性細(xì)胞患者15%的應(yīng)答率。上述臨床反應(yīng)的患者持續(xù)了1年的隨訪，并顯示mTNF陽性細(xì)胞活躍度的高低與在后續(xù)內(nèi)鏡檢查中黏膜愈合情況相關(guān)[17-18]。

4 小結(jié)和展望

既往IBD患者是否存在黏膜異常需要經(jīng)過組織學(xué)鑒定，現(xiàn)在該工作通過CLE也可完成。CLE可能會更有效的節(jié)約結(jié)腸相關(guān)性腫瘤檢測的可觀病理學(xué)成本，但該過程往往耗時且操作設(shè)備昂貴，而且它需要額外的組織病理學(xué)培訓(xùn)，操作過程中一般需要2位專業(yè)病理學(xué)專家參與才能更準(zhǔn)確判定組織病變的狀態(tài)，雖然可運(yùn)用于IBD患者的癌癥監(jiān)測，但因目前擁有該設(shè)備的機(jī)構(gòu)較少，所以較難普及。

結(jié)合目前CLE相關(guān)主要研究內(nèi)容，今后該技術(shù)應(yīng)用發(fā)展有望集中在以下方面：（1）黏膜愈合已成為IBD患者的治療目標(biāo)，隨著CLE發(fā)展，黏膜愈合的概念可能要被重新定義。（2）對于反復(fù)難治性UC患者可根據(jù)CLE下黏膜層細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能的實(shí)時情況預(yù)測病情發(fā)展及復(fù)發(fā)風(fēng)險，以期通過檢測黏膜愈合情況作出藥物減撤及臨床治療方案的調(diào)整。（3）對CD患者，今后有望通過在CLE下觀察mTNF陽性細(xì)胞的活躍度預(yù)測anti-TNF治療是否有效，在提高治療方案制定的準(zhǔn)確性同時也提高經(jīng)濟(jì)效益。（4）對于反復(fù)、重癥炎癥活動的高風(fēng)險IBD患者，可運(yùn)用CLE提高CRC檢出率，并減少無意義的過度組織活檢損傷。

隨著CLE的不斷發(fā)展，臨床期待借助其觀察黏膜屏障分子水平的變化，提高早期CD的確診率，提前發(fā)現(xiàn)UC患者CRC的癌前病變，從而早期控制疾病發(fā)展，降低致殘風(fēng)險。同時，借助CLE通過分子水平評估炎癥活動程度，以指導(dǎo)臨床藥物治療。

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2015-05-12）

（本文編輯：李媚）

310003 杭州，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科（沈海燕系在職研究生，現(xiàn)在嘉興市第二醫(yī)院消化內(nèi)科工作）

陳春曉，E-mail：13906523922@126.com