齊欣欣應(yīng)旭旻

中醫(yī)藥對Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞分化的研究進(jìn)展

齊欣欣1應(yīng)旭旻2

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；T輔助細(xì)胞17；中醫(yī)藥

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）和T輔助細(xì)胞17（Th17）是新近發(fā)現(xiàn)的兩群CD4+細(xì)胞，研究[1-2]發(fā)現(xiàn)，自身免疫疾病患者Th17細(xì)胞明顯升高,而Treg細(xì)胞數(shù)量或者功能下降。兩者失衡與器官移植[3-4]、腫瘤[5]、炎癥[6-7]等有關(guān)。如何調(diào)控兩者的平衡是目前自身性免疫病的最有潛力的治療方法。本文就中醫(yī)藥領(lǐng)域?qū)ζ溲芯窟M(jìn)展作一綜述。

1 Treg和Th17

1.1 Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)及表面標(biāo)志 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞最早于1995年，日本學(xué)者Sakaguchi[8]通過實(shí)驗(yàn)，將CD4+單陽性T細(xì)胞轉(zhuǎn)移給T細(xì)胞缺陷小鼠，會(huì)發(fā)生多種自身免疫性疾病，若同時(shí)輸進(jìn)CD4+CD25+細(xì)胞后，則可抑制自身免疫疾病，因此，首次將這類細(xì)胞稱為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。轉(zhuǎn)錄因子Foxp3（叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白3）首次由Runkow于2001年報(bào)道，被稱為是Treg細(xì)胞的最敏感標(biāo)記[8-9]，它的表達(dá)及功能與Treg細(xì)胞密切相關(guān)[10-13]。Treg細(xì)胞可根據(jù)其來源、性質(zhì)等分為兩類，即胸腺來源的天然性Treg細(xì)胞（nTreg）和外周誘導(dǎo)來的Treg細(xì)胞（iTreg）[14-16]。

Th17細(xì)胞由于其高水平分泌白介素17（IL-17）而被命名。Langrish等[17]在定向基因敲除動(dòng)物模型中，小鼠IL-23基因缺失可抵抗自身免疫性腦脊髓膜炎（EAE）。Park等[18]對EAE典型自身免疫性疾病動(dòng)物模型的研究也發(fā)現(xiàn)，IL-23的缺失降低體內(nèi)IL-17+T細(xì)胞的比例，延緩病程。學(xué)者們逐漸將這類CD4+細(xì)胞命名為Th17細(xì)胞。視磺醛酸相關(guān)的孤兒受體（RORγt）可誘導(dǎo)編碼IL-17的表達(dá)，是Th17細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子[19]。

1.2 Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞分化和作用的關(guān)系 Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞表面的大部分趨化受體均相同，二者的分化都依賴TGF-β，大劑量的TGF-β可誘導(dǎo)初始T細(xì)胞分化為Treg[20]；而低劑量TGF-β聯(lián)合IL-6則利于分化為Th17細(xì)胞。Treg細(xì)胞分泌IL-4、IL-10、和TGF-β等[21]；除IL-17外，Th17細(xì)胞還分泌IL-21、IL-23，IL-6等。Treg細(xì)胞有抗炎，抑制自身反應(yīng)，維持免疫耐受的作用；Th17細(xì)胞則有介導(dǎo)自身炎癥和免疫性疾病的作用，二者在許多發(fā)病組織中均同時(shí)存在。Romagnani[22]通過研究發(fā)現(xiàn)，Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞起源相同，作用相關(guān)，抑制Th17細(xì)胞可促進(jìn)Treg細(xì)胞發(fā)育?？傊琓reg細(xì)胞與Th17細(xì)胞分化和作用呈相互抑制關(guān)系。

2 單味中藥對Treg和Th17分化的研究

2.1 黃芪多糖 中藥黃芪補(bǔ)氣健脾，益衛(wèi)固表，藥理研究表明，黃芪多糖有抑制腫瘤生長，提高體液和細(xì)胞免疫，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子表達(dá)的作用。乙肝是由乙型肝炎病毒感染引起，注射乙肝疫苗是預(yù)防乙肝的有效措施，但副作用是體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答會(huì)受到抑制。研究發(fā)現(xiàn)[23]，小鼠肌肉分別注射乙肝疫苗、乙肝疫苗加黃芪多糖，7天后第二次免疫刺激后，收集血清，分離脾淋巴細(xì)胞。結(jié)果顯示，與單獨(dú)注射疫苗相比，加黃芪多糖組可以增加小鼠血清特異性抗體LgG水平，上調(diào)細(xì)胞TLR-4（Toll樣受體4）表達(dá)，下調(diào)TGF-β表達(dá)，降低Treg細(xì)胞數(shù)量。所以，TGF-β作為免疫抑制因子，黃芪多糖是通過抑制負(fù)調(diào)節(jié)信號，增強(qiáng)TLR-4固有信號通路調(diào)節(jié)免疫。

李承德等[24]通過黃芪多糖治療經(jīng)典OVA法大鼠哮喘模型，與模型組比較，經(jīng)黃芪多糖治療后，肺組織HE染色評價(jià)大鼠肺部炎癥表現(xiàn)較輕；瑞氏染色檢測BALF中炎癥細(xì)胞總數(shù)下降；電鏡觀察Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞損傷較輕；酶聯(lián)免疫技術(shù)檢測BALF中Th17細(xì)胞因子IL-17A、IL-25水平降低，而Treg細(xì)胞因子IL-35、IL-10水平升高。

2.2 黃芩苷 中藥黃芩清熱燥濕，瀉火解毒，其主要成分黃芩苷具有抗炎、抗氧化、抗過敏等藥理作用。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，給狼瘡腎炎小鼠予黃芩提取物灌胃，結(jié)果顯示，黃芩苷減少腎臟內(nèi)Th17細(xì)胞的滲透，抑制腎臟CCL20和CCR6（CC型趨化因子20及其受體6）的mRNA表達(dá)，同時(shí)保護(hù)狼瘡小鼠。在體外實(shí)驗(yàn)中，在Th17細(xì)胞分化過程中，IL-6是誘導(dǎo)RORγt表達(dá)的關(guān)鍵因子，黃芩苷抑制IL-6受體（IL-6R）mRNA表達(dá)，然而減少IL-6R表達(dá)并不伴隨STAT3 的mRNA降低；IL-21也是STAT3介導(dǎo)Th17分化過程的關(guān)鍵因子，而黃芩苷未能抑制IL-21R和STAT3 的mRNA表達(dá)。但是黃芩苷能影響STAT3磷酸化，因此，STAT3轉(zhuǎn)錄水平并不反映蛋白水平，黃芩苷可以影響STAT3的磷酸化水平而不影響轉(zhuǎn)錄水平。此外，文中發(fā)現(xiàn)黃芩苷抑制透明質(zhì)酸的激活也與其影響Th17細(xì)胞活動(dòng)有關(guān)。黃芩苷不僅抑制Th17細(xì)胞分化，同時(shí)證明它也是一個(gè)潛在治療Th17細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥性疾病的有效藥物[25]。

2.3 烏梢蛇Ⅱ型膠原蛋白 中藥烏梢蛇具有祛風(fēng)、通絡(luò)、止痙的功效。藥理研究表明其具有抗炎止痛作用。有課題組[26]對膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（CIA）運(yùn)用烏梢蛇Ⅱ型膠原蛋白（ZCⅡ）干預(yù)后，結(jié)果顯示，與CIA模型組比較，不同劑量ZCⅡ干預(yù)組關(guān)節(jié)炎及組織病理學(xué)評分降低；腸系膜淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞中Treg細(xì)胞的比率上升，Th17細(xì)胞比率下降；腸系膜淋巴細(xì)胞分泌TGF-β水平上升，分泌IL-17水平下降。作用機(jī)制可能為ZCⅡ進(jìn)入腸道后與淋巴結(jié)拱形區(qū)域內(nèi)的M細(xì)胞聚合，進(jìn)入與腸相關(guān)的淋巴組織，黏在巨噬細(xì)胞的表面，進(jìn)而激活小鼠體內(nèi)的以Treg細(xì)胞為主抑制性CD4+T細(xì)胞抑制Th17細(xì)胞的活化，破壞CIA小鼠的病理免疫狀態(tài)，重新調(diào)整小鼠淋巴結(jié)中Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞平衡，緩解關(guān)節(jié)炎癥。

2.4 川芎嗪 中藥川芎具有活血行氣、祛風(fēng)止痛的作用，為“血中氣藥”。川芎嗪是從中藥川芎中提取出來的一種生物堿，研究發(fā)現(xiàn)，川芎嗪是一種鈣離子拮抗劑，可以明顯抑制不同因素引起的平滑肌細(xì)胞的鈣離子內(nèi)流，影響氣道重建。支氣管哮喘是由嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、中性粒細(xì)胞以及T淋巴細(xì)胞等多種細(xì)胞共同參與的氣道慢性炎癥。研究[27]證明，在OVA誘導(dǎo)小鼠哮喘模型中，川芎嗪可以通過增加Treg細(xì)胞的功能及數(shù)量，進(jìn)而抑制Th17細(xì)胞的數(shù)量以及功能，減輕Th17細(xì)胞的應(yīng)答，降低IL-17細(xì)胞因子的分泌，從而起到預(yù)防及控制哮喘發(fā)作的作用。

2.5 青蒿素 青蒿素（Art）是從菊科植物黃花蒿葉中提取的一種含有過氧基團(tuán)的倍半萜內(nèi)酯，在臨床上已被廣泛用于治療瘧疾，具有高效低毒的特點(diǎn)。變應(yīng)性接觸性皮炎（ACD）主要為T細(xì)胞介導(dǎo)的遲發(fā)型超敏反應(yīng)。有課題組[28]以二硝基氟致敏和激發(fā)制作小鼠ACD模型，治療組局部青蒿素外涂后，IL-6、IL-17含量、RORγt及STAT3的活性表達(dá)比模型組明顯降低，而Foxp3表達(dá)升高；結(jié)果證明青蒿素能夠調(diào)節(jié)Treg/Th17細(xì)胞平衡，有良好的免疫抑制作用。研究還提示，高劑量Art可以誘導(dǎo)Treg細(xì)胞的產(chǎn)生，發(fā)揮免疫抑制作用，而較低劑量Art則增強(qiáng)免疫應(yīng)答。中藥的這種雙向免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)或許與藥物劑量以及機(jī)體狀態(tài)等因素有關(guān)。

2.6 雷公藤甲素 中藥雷公藤祛風(fēng)濕、活血通絡(luò)、消腫止痛。雷公藤甲素（TPT）是中藥雷公藤的主要成分，有強(qiáng)有效的免疫抑制和抗炎作用，常被用于腎臟移植患者。Zhang等[29]通過體外磁珠分選大鼠脾CD4+T，雷公藤甲素培養(yǎng)，流式細(xì)胞儀檢測，TPT增多了Toxp3的表達(dá)；大鼠腎臟移植模型中，受體大鼠接受TPT治療后存活時(shí)間比對照組長；同時(shí)在脾細(xì)胞中，TPT治療大鼠的Foxp3高于未予TPT治療大鼠。表明TPT能促進(jìn)CD4+細(xì)胞Toxp3+Treg細(xì)胞分化，TPT具有免疫抑制性。

Wang等[30]發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素能通過抑制Th17細(xì)胞分化兒減輕小鼠膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的癥狀。

2.7 黃連素 中藥黃連廣泛用于泄瀉、消渴等中醫(yī)內(nèi)科病癥，黃連素提取于其根部，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)有抗炎，免疫調(diào)節(jié)的作用。1型糖尿病是β細(xì)胞破壞，胰島素絕對缺乏的自身免疫性疾病，在其發(fā)病過程中，Th1細(xì)胞是重要的致病因子，近來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞也是也是促胰島炎癥的重要因素。有研究發(fā)現(xiàn)[31]，在th17細(xì)胞分化過程中，ERK是負(fù)性調(diào)節(jié)通道，黃連素通過激活ERK1/2信號通路，下調(diào)STAT3磷酸化和RORγt表達(dá)，抑制Th17細(xì)胞分化；此外，通過抑制P38和允NK信號通路，下調(diào)STAT1 和STAT4活動(dòng)，抑制Th1細(xì)胞分化?？傊?，在1型糖尿病NOD小鼠模型中，黃連素通過調(diào)節(jié)MAPK信號通路來抑制Th17細(xì)胞和Th1細(xì)胞分化，為臨床應(yīng)用提供更多現(xiàn)代藥理研究依據(jù)。

Qin等[32]黃連素能調(diào)控Th1細(xì)胞和Th17細(xì)胞反應(yīng)而減輕變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎（EAE）。

3 復(fù)方中藥及中成藥對Treg和Th17分化的研究

整體觀念和辨證論治是中醫(yī)基礎(chǔ)理論的基本觀點(diǎn)。中醫(yī)復(fù)方及中成藥對于治療疾病、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫具有自己的特色。

3.1 補(bǔ)腎益髓膠囊（BSYS） 大量數(shù)據(jù)表明Treg/Th17細(xì)胞失衡是自身免疫性腦脊髓膜炎（EAE）發(fā)病的一個(gè)至關(guān)重要因素。EAE的治療主要是激素和免疫抑制劑，傳統(tǒng)中藥不僅治療復(fù)雜的臨床癥狀，而且副作用少，補(bǔ)腎益髓膠囊滋陰化痰，理氣活血。有課題組[33]通過建立小鼠模型，BSYS治療后，流式檢測分析脾臟Th17和Treg細(xì)胞變化，免疫印記法觀測腦和脊髓中兩者的蛋白表達(dá)。與模型組對比，治療組可不同程度地降低Th17細(xì)胞同時(shí)提高Treg細(xì)胞比率及蛋白表達(dá)。在補(bǔ)腎益髓膠囊的藥物組成中，生地黃、何首烏、連翹同樣有上述作用，因此認(rèn)為，補(bǔ)腎益髓膠囊作用于EAE是與其多種成分的聯(lián)合作用密切相關(guān)。

3.2 清腸化濕方 在潰瘍性結(jié)腸炎中常表現(xiàn)為免疫系統(tǒng)功能紊亂。其中，Thl7細(xì)胞和Treg細(xì)胞的作用相反，通過不同的特征性細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄途徑執(zhí)行相應(yīng)的功能[34]。陸玥琳等[35]用三硝基苯磺（TNBs）造模成功后，清腸化濕方（黃連、黃芩、煨木香、炒白芍、生地榆、白芷、徐長卿、生甘草）治療，結(jié)果顯示，治療組小鼠結(jié)腸組織中IL-17表達(dá)低于模型組；RORγt蛋白表達(dá)較模型組明顯降；Foxp3蛋白表達(dá)較模型組升高。清腸化濕方可能通過下調(diào)RORγt表達(dá)抑制Thl7細(xì)胞分化及IL-17產(chǎn)生，通過上調(diào)Foxp3表達(dá)促進(jìn)Treg細(xì)胞形成，抑制效應(yīng)T細(xì)胞過度的炎癥反應(yīng)。

4 小結(jié)

Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞比例平衡在自身免疫疾病、炎癥、腫瘤、移植排斥等發(fā)揮重要作用，漸漸成為免疫學(xué)和腫瘤學(xué)研究的熱點(diǎn)。我國傳統(tǒng)中醫(yī)藥對改善和治療這些疾病較好作用。但是，對其中的治療機(jī)制研究尚不完善，因此需要不斷探索研究更多中醫(yī)藥對Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞方面的作用機(jī)制，更好地應(yīng)用于臨床。

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（收稿：2015-05-26 修回：2015-08-24）

1浙江中醫(yī)藥大學(xué)（杭州 310053）；2杭州市急救中心（杭州 310021）

應(yīng)旭旻，E-mail：xmyin@163.com；Tel：15805710588