顧瑩 黃歡 孫麗洲

(1.連云港市婦幼保健院 生殖遺傳科，江蘇 連云港 222006；2. 江蘇省婦幼保健院 產科，江蘇 南京 210036)

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染色體微陣列分析技術在胎兒遺傳病診斷中的應用

顧瑩1黃歡2孫麗洲2

(1.連云港市婦幼保健院 生殖遺傳科，江蘇 連云港 222006；2. 江蘇省婦幼保健院 產科，江蘇 南京 210036)

染色體微陣列分析(chromosomal microarray analysis,CMA)技術是一種通過對染色體進行全基因組掃描，發(fā)現(xiàn)染色體組的數(shù)目和結構異常的檢測技術。CMA以其高分辨率、高效率、高自動化操作等優(yōu)點，不僅能有效檢測傳統(tǒng)核型分析技術所能檢測的染色體數(shù)目異常及非平衡性結構異常，還能檢測染色體組亞顯微結構水平上不平衡重排引起的拷貝數(shù)變異(copy number variation,CNV)，成為現(xiàn)代臨床遺傳學常規(guī)診斷工具，并被引入到產前胎兒遺傳疾病檢測中。本文將就產前胎兒遺傳病、胎兒遺傳病檢測的技術回顧、CMA技術的發(fā)展及在胎兒遺傳病檢測中的應用、優(yōu)勢和面臨的挑戰(zhàn)等做一個詳細的綜述。

染色體微陣列分析；產前診斷；遺傳病；遺傳咨詢

遺傳病指人體遺傳物質(包括細胞核DNA和核外線粒體DNA)發(fā)生變異或可遺傳性修飾而導致的疾病，可由親代遺傳給子代，故稱遺傳病。在產前胎兒檢測的遺傳性疾病中主要包括染色體病、基因病、線粒體病等。目前已發(fā)現(xiàn)的人類染色體異常超過10 000種[1]，主要包括數(shù)目異常，如唐氏綜合征21號染色體比正常多一條，女性先天卵巢發(fā)育不全缺少一條X染色體；部分染色體大片段結構變異，羅氏易位等；染色體亞顯微結構的微缺失或重復，如17q21.31微缺失綜合征和22q1l.2微重復綜合征。染色體病對胎兒的危害尤其巨大，除極少數(shù)三體和性染色體異?？梢源婊钕聛?，大多數(shù)的染色體數(shù)目異常均以流產、死胎而告終，而染色體結構異常則是引起新生兒出生缺陷非常重要的原因，包括智力低下、發(fā)育遲緩、多器官畸形等[2]，而目前尚無有效的治療措施，因此需要及早準確檢測和積極干預。目前產前胎兒遺傳病的檢測主要集中在染色體病的檢測，本文將就最新的染色體病檢測技術染色體微陣列技術(chromosomal microarray analysis,CMA)在胎兒遺傳病檢測中的發(fā)展、應用及問題和前景進行綜述。

1 產前遺傳病診斷技術發(fā)展的回顧及問題

傳統(tǒng)產前診斷技術采用染色體G顯帶核型分析技術(karyotyping)。該技術始于20世紀70年代，可有效檢測出胎兒染色體的數(shù)目異常(如唐氏綜合征)和結構異常(如平衡/不平衡易位和倒位)，近40年來一直被認為是診斷染色體病的“金標準”。G顯帶核型分析技術需要細胞培養(yǎng)，需要較長檢測周期才能得到最終報告，為受檢者及家人帶來等待焦慮及很大困擾。染色體核型技術依賴于顯微鏡的分辨率和傳統(tǒng)顯帶技術，約10Mbp以上的重排可被發(fā)現(xiàn)，即使應用高分辨率的染色體顯帶技術也只能達到5Mb的分辨率。過低的分辨率無法對許多具有致病性的染色體亞顯微結構變異包括染色體微缺失或微重復作出診斷。20世紀80年代后期，熒光原位雜交(fluorescent in situ hybridization，F(xiàn)ISH)被引入產前診斷，該技術探針穩(wěn)定性好、技術相對簡單、診斷時間短、重復性好，檢測結果清晰直觀，不需培養(yǎng)細胞，能快速準確檢測非整倍體異常。然而FISH技術也面臨著信號重疊及操作者經驗不足易導致誤判，因探針有限只能對部分而非全部染色體進行檢測，只能檢測已知致病基因或可疑位點，不能區(qū)分正常和倒位、平衡易位攜帶者的胚胎[3,4]，無法很好地滿足產前診斷的需要。熒光定量PCR(quantitative fluorescent polymerase chain reaction,QF-PCR)與多重連接探針擴增(multiplex multiplexligation-dependent probe amplification，MLPA)技術也能快速準確分析小的染色體異常片段，如胎兒先心病時22q11.2微缺失的檢測，17p11.2區(qū)域的微重復和復制[5,6]。以上技術均針對特定的區(qū)域，在一定程度上解決了部分問題，但因無法進行全基因組基因檢測，應用上受到很大限制。因此發(fā)展更新的能夠對各個層次的染色體疾病都能高分辨率、高通量、高自動化、快速高效率而低費用的檢測技術已成為時代的需求。

2 CMA技術及優(yōu)勢

隨著分子技術的發(fā)展，一種全新的關于染色體變異檢測技術-染色體微陣列分析(chromosomal microarray analysis, CMA)技術，又稱為“分子核型”(molecular karyotyping)分析技術應運而生。基于微陣列的比較基因組雜交(arraybased comparative genomic hybridization,aCGH)技術和單核苷酸多態(tài)性微陣列(single nucleotide polymorphism array,SNP array)技術，CMA技術在染色體疾病的檢測中，尤其是對基因拷貝數(shù)變異(copy number variation,CNV)引起疾病的檢測中，顯示其巨大的優(yōu)勢。CMA的最大優(yōu)點在于其高分辨率，這不僅能夠如G顯帶技術一樣在全基因組范圍內有效、同時地檢測出染色體數(shù)目及多種染色體不平衡導致的遺傳病，并準確、客觀地界定亞顯微水平的CNV的區(qū)間及大小，而不用像核型分析那樣依賴對區(qū)帶強度的主觀觀察和判斷，其分辨率也比傳統(tǒng)核型分析高出近千倍。aCGH能識別200kb以下的微缺失及復制,而SNParray分辨率可達1.5kb，這是傳統(tǒng)染色體G顯帶核型分析無法做到的。同時，還可根據(jù)需求選擇或是訂制不同分辨率的芯片。其次是高效率，檢測范圍覆蓋整個基因組，aCGH檢測時間縮短至30小時內[7]，SNParray技術分析甚至有報道可以<10小時，有望在1天內完成檢測。SNParray可以追溯到胚胎額外的染色體來自父方或者母方，還可以明確非整倍體或單親二倍體(UPD，即同源染色體均來自同一個親本)的異常是由卵母細胞減數(shù)分裂期還是胚胎有絲分裂過程中的錯誤造成的。SNParray還帶有SNP分型的信息，可用以檢測雜合缺失(loss of heterozygosity，LOH)及>10%比例的嵌合體，而臨床上利用LOH 的信息可以對部分隱性遺傳病及印記基因疾病進行檢測。

CMA技術進入產前胎兒遺傳疾病檢測領域以來，由于其諸多方面的優(yōu)勢，從開始的質疑，再到逐漸能夠接受，到現(xiàn)在在某些領域已經成為一線的檢測手段。2009年，美國婦產科醫(yī)師協(xié)會(ACOG)首次推薦將aCGH作為產前超聲檢查顯示結構異常、但染色體核型分析結果正常胎兒的產前檢測方法[8]。2013年ACOG及美國母胎醫(yī)學學會(SMFM)發(fā)表臨床指南，指出在產前超聲檢查顯示結構異常的胎兒中，推薦CMA替代傳統(tǒng)的染色體核型分析技術[9]。在我國，染色體微陣列分析技術在產前診斷中的應用協(xié)作組于2014年形成《染色體微陣列分析技術在產前診斷中的應用專家共識》[10]，2016年7月，由中國醫(yī)師協(xié)會醫(yī)學遺傳學分會、中國醫(yī)師協(xié)會青春期醫(yī)學專業(yè)委員會臨床遺傳學組、中華醫(yī)學會兒科學分會內分泌遺傳代謝學組多個權威機構在《中華兒科雜志》發(fā)布了《染色體基因組芯片在兒科遺傳病的臨床應用專家共識》[11]，為CMA在我國的應用提供了指南。

3 CMA在產前診斷中的應用

3.1 CMA在產前診斷中臨床適應證及禁忌證 近年來，加拿大醫(yī)學遺傳學會(Canadian College of Medical Geneticists，CCMG)、美國婦產科醫(yī)師學院(American College of Obstetricians and Gynecologists，ACOG)及母胎醫(yī)學會(Society for Maternal-Fetal Medicine，SMFM)都為CMA技術在產前診斷中的應用發(fā)布了相關的指南[8,9,12]，而我國隨后于2014年底發(fā)布了《染色體微陣列分析技術在產前診斷中的應用專家共識》[10]，2016年7月發(fā)布了《染色體基因組芯片在兒科遺傳病的臨床應用專家共識》[11]，指導我國CMA技術的推廣和應用。根據(jù)這兩份共識，CMA技術在產前診斷中的臨床適應證及禁忌證如下：①產前超聲檢查發(fā)現(xiàn)胎兒結構異常是進行CMA檢查的適應證，建議在胎兒染色體核型分析的基礎上進行，如核型分析正常，則建議進一步行CMA檢查。②對于胎死宮內或死產、需行遺傳學分析者，建議對胎兒組織行CMA檢測，以提高其病因的檢出率。③對于胎兒核型分析結果不能確定染色體畸變情況時，建議采用CMA技術進行進一步分析以明確診斷。④CMA應用于評估早、中孕期胎兒丟失原因的研究數(shù)據(jù)積累不足，暫不推薦使用。⑤CMA技術(特指涵蓋SNP探針的平臺)對于異常細胞比例>30%的嵌合體檢測結果比較可靠，反之，對異常細胞比例<30%的嵌合體結果不可靠。

3.2 基本流程 根據(jù)2014年及2016年我國相關全文機構的兩份關于CMA使用的共識[10,11]及遺傳基因檢測的管理規(guī)范，產前CMA檢測的基本流程如下：

3.2.1 臨床醫(yī)生在開具CMA檢查申請單前，應對受檢者及家屬詳細告知檢測方法、芯片類型、可檢測的疾病、可能出現(xiàn)的檢測結果、檢測風險，在醫(yī)生與受檢者及家屬達成接受檢測的共識后，簽署知情同意書。

3.2.2 在具備相關資質的醫(yī)療機構采集羊水、絨毛及臍血等獲得胎兒細胞樣本及父母雙方外周血樣本。

3.2.3 在具有CMA檢測資質的醫(yī)療機構實驗室，根據(jù)檢測目的和要求選擇合適的芯片，進行CMA檢測。

3.2.4 對于實驗數(shù)據(jù)，需要結合相關專業(yè)數(shù)據(jù)庫、已報道病例和專業(yè)文獻等，利用相關專業(yè)軟件進行分析，出具檢測報告。

3.2.5 針對檢測后的遺傳咨詢，臨床醫(yī)生需針對檢測報告結果給家屬提供準確的遺傳咨詢：①基因型與表型的關系，疾病的遺傳方式：將已報道的攜帶類似CNV的患者主要表型與先證者進行對比，了解基因型與表型的關系；從CNV的來源，以及數(shù)據(jù)庫等綜合信息判斷，解釋先證者CNV的類型。②再發(fā)風險以及其子代的發(fā)生風險評估：根據(jù)CNV是否來自父母，或源于父母的染色體平衡易位，評估再發(fā)風險根據(jù)CNV的類型，評估先證者子代的發(fā)生風險。③疾病的自然進程以及必要的預防性措施：對已報道的類似CNV攜帶者文獻進行回顧，將此類患者的疾病進程，可能出現(xiàn)的疾病風險，以及應采取的預防措施告知監(jiān)護人。④產前診斷的方法：對已知的致病性CNV，告知可通過何種方法進行產前診斷及不同方法的優(yōu)缺點。⑤先證者確診對家族中其他成員的影響，是否有必要對家族中其他成員進行遺傳學檢測，為家族中可能的攜帶者進行遺傳咨詢和必要的遺傳學檢測。

3.3 芯片的類型及選擇 選擇合適的芯片是檢測成功的先決條件。目前可供選擇的CMA芯片已有多個系列，主要由Agilent、Affymetrix、Illumina3家公司生產，安宇等[4]在他們的綜述中詳細總結介紹了這3家公司目前主流的染色體陣列檢測芯片。根據(jù)2016年7月我國專家的共識[11]，可參照以下標準結合實際需求選擇合適的芯片：①芯片探針應涵蓋復發(fā)性基因組病(recurrent genomic disorders)及常見微缺失/微重復綜合征區(qū)域，并覆蓋亞端粒區(qū)域。②全基因組的芯片(非靶向芯片)應可以檢出>400 kb的CNV。③芯片探針應包括能檢出已知印跡區(qū)域的純合區(qū)(absence of heterozygosity，AOH)，及能評估血緣關系水平的全基因組SNP探針。④分辨率并非越高越好，需結合臨床設計合適的芯片。⑤對已知致病性基因，在全基因組檢測中需要針對這些基因增加探針密度以提髙診斷的敏感性和準確性。⑥針對重復序列，良性的拷貝數(shù)多態(tài)位點和(或)會呈現(xiàn)假陽性重復或缺失導致不能真實反映樣本CNV的區(qū)域，可不設計芯片探針。

3.3 檢測結果分析及判讀 CMA檢測結果可以通過軟件相對容易得到，但對檢測結果的分析及判讀卻是CMA檢測的難點。對結果分析主要依靠CNV相關的數(shù)據(jù)庫。自2006年第一張人類基因組CNV圖譜的1447個CNV及2010年Yim等[13,14]新增2077個CNV以來，已有多個CNV相關數(shù)據(jù)建立，如國際公共良性CNVs數(shù)據(jù)庫( database of genomic variants，DGVs) 、國際公共病理性CNVs 數(shù)據(jù)庫( database of chromosomal imbalance and phenotype in humans using ensembl resources，DECIPHER) 、人類遺傳學細胞遺傳學微陣列委員會在線數(shù)據(jù)庫(international standard cytogenomic array consortium，ISCA) 、人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(online mendelian inheritance in man，OMIM)為主要代表，且其中CNV的的量及相關信息隨著研究的發(fā)展仍在不斷增長中。這些數(shù)據(jù)庫提供了大量的CNV與相關表型的關聯(lián)信息，CMA檢測的結果可以對照這些數(shù)據(jù)庫中信息進行分析并做出進一步的判讀。

對檢測出來的CNV通過以上數(shù)據(jù)庫的檢索分析其來源、大小、所包含基因及其功能以及CNV數(shù)據(jù)庫中有關該畸變的信息并參考各個臨床檢測中心的病例報道、病例分析、病例對照分析等資料，按照美國ACMG的指南，CNVs可分為致病的(pathogenic)CNVs、可能致病的(possibly pathogenic)CNVs、未知意義的(variant unknown significance，VUS)CNVs、可能良性的(likely benign)CNVs和良性的(benign)CNVs。一般簡單的將新生、罕見、相對較大、含有臨床相關基因及與已確定的綜合征有關的CNV劃分為病理性CNV，遺傳自健康雙親，或者普遍存在于正常人中未表現(xiàn)出病理學表型的CNV被定義為良性CNV，其余CNV被認為為VUS，VUS約占CNV總量的3.4%[15]。VUS為結果的分析和判讀帶來了很大問題，為目前CMA檢測分析的一大難點。

3.4 應用實例 CMA技術自誕生以來，在遺傳性疾病及腫瘤研究等諸多領域廣泛應用并取得豐碩成果，但在產前胎兒遺傳病檢測領域，尤其在國內起步相對較晚。早期的報道病例相對分散且樣本量少，更多是對該技術的驗證探索。2005年Rickman等[16]采用包含600個大片段插入克隆的靶向診斷微陣列以不同的分辨率利用盲法研究30份從羊膜腔穿刺術(AC)和絨毛膜穿刺術(CVS)提取的胎兒DNA樣本，絕大多數(shù)樣本都獲得了與傳統(tǒng)G顯帶核型分析一致的結果，不一致的微缺失不能為G顯帶技術識別。Trilochan等[17]用57例孕婦樣本對aCGH與常規(guī)的G顯帶技術做了核型分析對比，一致度達到98%。這兩例報道表明CMA技術可以適用于胎兒的遺傳病檢測。Ignatia等[18]則用aCGH對超過100份樣本僅用7天時間就完成檢測并給出報告，顯示了CMA的高效率。國內相關報道文獻較少，常亮等[19]采用SNP array及染色體核型分析對2012年7月至2013年12月在北京大學第三醫(yī)院婦產科就診的產前診斷為高危孕婦141例進行的對比分析，發(fā)現(xiàn)染色體核型分析異常率為6.4%，SNP array異常率為11.3%，兩種方法聯(lián)合檢測異常率12.1%，兩種檢測技術檢測出的異常核型率比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.039)，染色體核型分析結合SNParray技術能有效提高遺傳病的產前診斷檢出率。同年，吳曉麗等[20]采用染色體微陣列技術對88離染色體核型分析正常的先天性心臟病(CHD)胎兒進行了遺傳病學檢測，發(fā)現(xiàn)14例(16%)胎兒CNV結果為致病性CNV，取得了良好的效果。Hillman等[21,22]對近年一些CMA在胎兒產前檢測文獻做了Meta分析，結果表明CMA在產前胎兒遺傳病檢測中具有比常規(guī)G顯帶技術更高的檢出率、更高的分辨率和更高的效率。

近年來，大樣本(大于1000例)多中心的研究為CMA技術應用于臨床產前診斷提供了科學依據(jù)。Shaffer等[23,24]對2004～2011年收集的5003例產前診斷樣本(包括羊水、絨毛、臍血和流產組織)采用aCGH技術進行了檢測，發(fā)現(xiàn)含有臨床產前診斷意義的病理性CNVs檢出率為5.3%，其中71%的CNVs都小于10Mb，這些變異通常無法通過染色體核型分析檢測出來。而如果單純考慮aCGH檢測的結果，則有臨床意義的CNVs檢出率上升為6.5%，產前超聲異常的樣本檢出率則增加到7.6%，死胎的檢出率高達8.2%，相比之下高齡妊娠婦女的檢出率只有0.3%。在染色體核型正常但在產前超聲檢測中發(fā)現(xiàn)存在單個器官異?；蚨鄠€器官異常的病例中，有臨床產前診斷意義的病理性CNVs檢測率分別為5.6%和9.5%[24]。Wapner等[15]在美國國家兒童健康和人類發(fā)育研究所(NICHD)資助下，采用前瞻性雙盲試驗設計，對來源于29個產前診斷中心的4406個(樣本來源為CVS和羊水穿刺)進行了aCGH檢測。結果發(fā)現(xiàn)染色體核型正常但含有結構異常的樣本中，有臨床意義的CNVs檢出率為6%，僅核型正常的個體CNVs檢出率為2.5%，高齡妊娠婦女檢出率為1.7%，唐氏綜合征篩查陽性的檢出率為1.6%。其他一些研究組也取得了類似的結果[25-28]。大樣本多中心的前瞻性研究表明CMA可以作為產前診斷標準檢測的一部分應用于臨床，對于侵入性產前診斷，特別是超聲提示胎兒結構異常者，CMA的應用可以明顯提高有臨床意義的微缺失和微重復檢測率。

4 CMA的在產前診斷應用中的局限和展望

任何新技術都有其自身的局限性，CMA也不例外。CMA無法檢出平衡性染色體重排如平衡易位、到位和大多數(shù)的基因內點突變及DNA甲基化異常[29]。不同檢測平臺間檢測同一樣本的結果存在一些差異[30,31]，檢測中常有一些臨床意義不明的VUS難以判讀和解釋，這種情況往往會導致孕婦及其家屬的焦慮，甚至是錯誤的終止妊娠。另外CMA對技術要求較高，需要昂貴的熒光顯微鏡和影像分析系統(tǒng)，同時芯片造價也比較昂貴，導致最后整體檢測價格較高，使得該技術的廣泛應用受到限制。

相信通過醫(yī)療機構、科研機構的權威專家共同制定適合我國國情的CMA產前指南和技術規(guī)范及質控標準，對各數(shù)據(jù)庫資源進行整合與共享，指導CMA技術在臨床科學合理規(guī)范化使用，探索臨床意義不明確的VOUS，建立中國人自己的CAN專業(yè)數(shù)據(jù)庫，對CMA檢測結果的分析與檢測前后的臨床咨詢制定科學合理的診療方案。

盡管CMA有其自身的局限性，也面臨著諸多的挑戰(zhàn)，但目前大量的研究顯示CMA在產前診斷尤其超聲異常的胎兒遺傳學診斷中成為優(yōu)先推薦的方法。

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編輯：熊詩詣

10.13470/j.cnki.cjpd.2016.03.011

R714.53

A

2016-07-21)