王蕾 賀靜 朱寶生

(云南省第一人民醫(yī)院遺傳診斷中心、云南省出生缺陷與遺傳病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650032)

?

單基因遺傳病分子診斷的新策略和新方法

王蕾 賀靜 朱寶生*

(云南省第一人民醫(yī)院遺傳診斷中心、云南省出生缺陷與遺傳病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650032)

單基因遺傳病具有復(fù)雜的表型異質(zhì)性及遺傳異質(zhì)性，基因突變可涉及點(diǎn)突變、片段缺失/重復(fù)、整個(gè)基因的缺失/重復(fù)、以及動(dòng)態(tài)突變等眾多類別。分子診斷技術(shù)使得單基因遺傳病可在分子水平乃至單個(gè)堿基發(fā)生變異的情況下做出準(zhǔn)確診斷，然而其可靠性問(wèn)題成為備受矚目的技術(shù)難點(diǎn)。針對(duì)不同遺傳病使用不同的解決方案，是目前單基因遺傳病分子診斷的主流思想?；蛟\斷相關(guān)人員不僅要了解遺傳疾病致病基因及其突變特點(diǎn)，還要熟知各種檢測(cè)技術(shù)的特點(diǎn)，合理選擇。

單基因遺傳??；分子診斷；雜交；擴(kuò)增；測(cè)序

單基因遺傳病(monogenic disorders)是由位于同源染色體上的一對(duì)等位基因之一或者二者發(fā)生突變，導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)信息錯(cuò)誤或基因表達(dá)控制異常而出現(xiàn)的身體結(jié)構(gòu)發(fā)育異常和/或生理功能異常，該類疾病一般符合孟德爾遺傳方式，所以，又稱為孟德爾遺傳病(mendelian inherited diseases)[1]。大多數(shù)單基因遺傳病是罕見病，其中每一種在全球人口中的平均發(fā)生率在1/10 000～1/100 000[2]，多則在數(shù)千個(gè)新生兒中出現(xiàn)一例，少則數(shù)十萬(wàn)新生兒中出現(xiàn)一例；但對(duì)局部地區(qū)或者來(lái)自某些地區(qū)的特定人群而言，某些單基因遺傳病的平均發(fā)生率可能高達(dá)1%～2%，如在東南亞和云南南部的某些少數(shù)民族中，地中海貧血和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥的發(fā)生率就高達(dá)2%以上[3]。由于單基因遺傳病種類眾多，故即使每種疾病的患者不多，但總體受累人群卻不容小覷。據(jù)可靠估算，單基因遺傳病在全球人口中的發(fā)生率約為1%[4]，給千萬(wàn)個(gè)家庭及患者帶來(lái)極大的精神負(fù)擔(dān)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

1976年，美籍華裔科學(xué)家簡(jiǎn)悅威成功應(yīng)用液相DNA分子雜交技術(shù)實(shí)現(xiàn)了鐮形細(xì)胞貧血癥的基因診斷[5]，是人類遺傳病診斷開始進(jìn)入分子診斷時(shí)代的里程碑。繼形態(tài)學(xué)、生化學(xué)及免疫學(xué)診斷技術(shù)后，分子診斷飛速發(fā)展，該技術(shù)使得遺傳病可在分子水平乃至單個(gè)堿基發(fā)生變異的情況下做出準(zhǔn)確診斷。不僅可為患者提供可靠診斷，還可為表型正常的攜帶者提供遺傳咨詢。大致可分為分子雜交檢測(cè)技術(shù)、基因擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)和基因測(cè)序技術(shù)三大類。

1 分子雜交檢測(cè)技術(shù)

分子雜交檢測(cè)技術(shù)是通過(guò)已知基因序列的探針對(duì)靶序列進(jìn)行特異性的捕獲檢測(cè)。主要技術(shù)有斑點(diǎn)雜交(dot blot, DB)、反向斑點(diǎn)雜交(reverse dot blot, RDB)、Southern印跡、Northern印跡、Western印跡、熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)、基因芯片(gene chips)等。

1.1 反向斑點(diǎn)雜交(RDB) Saiki等[6]于1989年最早發(fā)明RDB技術(shù)，并證實(shí)該技術(shù)在突變檢測(cè)中的確定性。1999年，Chan等[7]將該技術(shù)應(yīng)用于中國(guó)人群αCSα、αQSα、αCD59α和αCD30α4種非缺失型α-地中海貧血的突變檢測(cè)。RDB法為目前臨床常用的常規(guī)檢測(cè)方法，原理是將一系列可與疾病相關(guān)等位基因雜交的特異性寡核苷酸探針排列在尼龍膜上，經(jīng)擴(kuò)增、雜交、洗脫及顯色，最后判讀受檢樣品是否攜帶與膜上探針雜交的基因突變。其優(yōu)點(diǎn)在于可在一張雜交膜上同時(shí)檢測(cè)樣品中多種點(diǎn)突變，結(jié)果可靠、可重復(fù)性好、靈敏度高，且檢測(cè)時(shí)所耗樣品量少、經(jīng)濟(jì)方便，尤為適用于基因分型、已知基因序列的突變檢測(cè)。缺點(diǎn)是膜條制備時(shí)間長(zhǎng)，雜交操作繁雜、很難進(jìn)行大批量檢測(cè)。

1.2 熒光原位雜交(FISH) 1977年，Rudkin[8]發(fā)明了FISH技術(shù)，在原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上使用熒光素取代同位素標(biāo)記探針，更安全、快速、準(zhǔn)確、靈敏，且探針標(biāo)記更穩(wěn)定，能同時(shí)顯示多色，不但能對(duì)中期分裂相進(jìn)行分析，還能顯示于間期核中。其基本原理遵循堿基互補(bǔ)原則，將熒光標(biāo)記的已知探針與受檢樣品DNA進(jìn)行雜交，通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)實(shí)現(xiàn)受檢樣品DNA的定性、定位分析。FISH技術(shù)自20世紀(jì)70年代問(wèn)世以來(lái)已在臨床廣泛應(yīng)用，由于其直觀性、特異性已成為染色體微缺失/微重復(fù)診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，在分子領(lǐng)域主要適用于基因定位、腫瘤基因檢測(cè)等方面[9]。

1.3 微陣列基因芯片 微陣列基因芯片，簡(jiǎn)稱基因芯片，是由千萬(wàn)個(gè)DNA或寡核苷酸探針密集排列在小面積載體表面組成的微點(diǎn)陣列。在一定條件下，載體上的DNA或寡核苷酸探針可與來(lái)自樣品中序列互補(bǔ)的核酸片段雜交，通過(guò)檢測(cè)雜交信號(hào)實(shí)現(xiàn)樣品DNA序列分析[10]。該技術(shù)具有高通量、高分辨率、微型化、自動(dòng)化程度高等優(yōu)勢(shì)，可用于基因定位、已知突變檢測(cè)、DNA測(cè)序、遺傳圖譜構(gòu)建等[11]。但存在著芯片制作技術(shù)復(fù)雜、檢測(cè)應(yīng)用的芯片掃描儀成本高、檢測(cè)數(shù)據(jù)分析難度較高的問(wèn)題，阻礙了其應(yīng)用于基層醫(yī)院臨床檢測(cè)中。國(guó)產(chǎn)的遺傳性耳聾基因檢測(cè)芯片目前在臨床上應(yīng)用較多，它可以同時(shí)檢測(cè)GJB2、GJB3、SLC26A4和線粒體12S rRNA這4個(gè)基因中的9個(gè)基因突變熱點(diǎn)，是世界上第一個(gè)被批準(zhǔn)用于臨床診斷的基因芯片產(chǎn)品。

2 基因擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)

臨床應(yīng)用最廣泛的單基因遺傳疾病分子診斷技術(shù)是聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)以及其衍生方法。如巢式PCR(nested PCR)、多重PCR(multiplex PCR)、三引物PCR(tri-primer PCR, TP-PCR)、逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR, RT-PCR)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(realtime fluorescence quantitative PCR, RTFQ-PCR/qPCR)、數(shù)字PCR(digital PCR, dPCR)[12]、變性高效液相色譜分析(denaturing high-performance liquid chromatograph, DHPLC)[13]、高分辨熔解曲線分析(high-resolution melting curve analysis, HRM)[14]、多重連接依賴探針擴(kuò)增(multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA)[15]等?，F(xiàn)今幾乎所有的基因突變檢測(cè)技術(shù)都是基于PCR發(fā)展的。

2.1 數(shù)字PCR dPCR是20世紀(jì)初發(fā)展起來(lái)的新型核酸分子定量檢測(cè)技術(shù)，較傳統(tǒng)定量PCR技術(shù)具有更高的準(zhǔn)確性、靈敏性及可重復(fù)性，可對(duì)大量背景分子中的微量模板進(jìn)行定量分析[12,16]。按分液技術(shù)不同分為三類：微孔板[17]、微流體芯片[18]和微滴式。由于dPCR的本質(zhì)是通過(guò)單分子擴(kuò)增將低豐度的基因信號(hào)從復(fù)雜背景中提取出來(lái)，故在無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷中可對(duì)受到大量母體背景DNA影響的低含量胎兒游離DNA進(jìn)行檢測(cè)。2010年，Chu等[19]首次將數(shù)字化PCR應(yīng)用于無(wú)創(chuàng)單基因疾病診斷，進(jìn)行單分子等位基因檢測(cè)并通過(guò)等位基因比值法推斷胎兒是否受累。Lam等[20]于2012年依據(jù)父源性的遺傳單倍型設(shè)計(jì)了針對(duì)珠蛋白及其外部SNP位點(diǎn)的探針來(lái)篩選可提供信息位點(diǎn)，并根據(jù)母源性單倍型將SNP分為α和β兩組，借助dPCR技術(shù)推斷胎兒基因型，成功分析2個(gè)β-地中海貧血家系。Tsui等[21]應(yīng)用dPCR檢測(cè)X染色體上的基因位點(diǎn)，在12個(gè)樣本中成功檢測(cè)出7例發(fā)生血友病基因突變的男胎。

2.2 變性高效液相色譜分析 DHPLC技術(shù)是通過(guò)分析異質(zhì)性雙鏈結(jié)構(gòu)從而對(duì)DNA序列變異進(jìn)行篩選。在不變性的溫度條件下可用于分離不同分子量的雙鏈DNA、分析具有長(zhǎng)度多態(tài)性的片段；在部分變性的條件下，突變型和野生型分別形成同源雙鏈，同時(shí)錯(cuò)配產(chǎn)生異源雙鏈，由于雜合與純合二倍體在柱中保留時(shí)間的差異而在色譜圖中呈現(xiàn)雙峰或多峰的洗脫曲線，以識(shí)別突變型[22]。該技術(shù)可分析SNP、檢測(cè)單個(gè)堿基置換、插入或缺失，具有自動(dòng)化程度高、敏感性和特異性較高等優(yōu)點(diǎn)。

2.3 高分辨熔解曲線分析 HRM技術(shù)是利用突變型片段與野生型片段加熱變性時(shí)熔解曲線形狀和位置的差異，從而區(qū)分突變樣本與正常樣本，不受突變堿基位點(diǎn)及類型的限制，既可掃描擴(kuò)增片段的未知突變又可進(jìn)行已知突變的基因分型[23]。該技術(shù)操作便捷、通量高、成本低，且特異性優(yōu)于其他突變初篩技術(shù)，如單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(SSCP)技術(shù)，適用于單堿基突變及小片段插入、缺失的檢測(cè)，但無(wú)法準(zhǔn)確檢測(cè)具體突變[24]。

2.4 多重連接依賴探針擴(kuò)增 MLPA技術(shù)是荷蘭學(xué)者Schouten等[15]于2002年在多重?cái)U(kuò)增探針雜交(multiplex amplifiable probe hybridization, MAPH)技術(shù)[25]的基礎(chǔ)上改進(jìn)設(shè)計(jì)的，其原理是對(duì)可與樣本DNA正確雜交并被連接酶連接的探針進(jìn)行擴(kuò)增和半定量分析。該技術(shù)融合了DNA探針雜交和PCR技術(shù)，且引入了連接依賴，其優(yōu)越性是特異性高、精確度高、重復(fù)性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便、通量高?；贛LPA技術(shù)可檢測(cè)出若干人類基因拷貝數(shù)的變異，故現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于存在基因缺失/重復(fù)突變的人類遺傳疾病的分子診斷，如假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥(Duchenne/Becker muscular dystrophy, DMD/BMD)、脊肌萎縮癥(spinal muscularatrophy, SMA)、DiGeorge綜合征(DiGeorge syndrome)等[26]。但遺憾的是該產(chǎn)品至今未申請(qǐng)中國(guó)的市場(chǎng)準(zhǔn)入，僅能少量用于科研工作，而不能應(yīng)用于基因診斷和產(chǎn)前診斷。

3 基因測(cè)序技術(shù)

基因測(cè)序技術(shù)作為現(xiàn)代生命科學(xué)研究的核心技術(shù)之一，不僅為遺傳信息的揭示和基因表達(dá)調(diào)控的基礎(chǔ)生物學(xué)研究提供重要數(shù)據(jù)，而且在疾病基因檢測(cè)與分子診斷等臨床應(yīng)用研究中發(fā)揮著重要作用。

3.1 Sanger測(cè)序法 1977年，英國(guó)生物化學(xué)家Sanger等[27]發(fā)明了雙脫氧鏈末端終止法(dideoxy chain-termination method)，可以檢測(cè)物種或細(xì)胞的核酸序列，通過(guò)與基因庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析被檢測(cè)物種或細(xì)胞的特性。Sanger測(cè)序法作為最經(jīng)典的測(cè)序方法廣泛應(yīng)用于基因組DNA、cDNA等多重復(fù)序列的檢測(cè)。但該技術(shù)通量低、成本高、耗時(shí)長(zhǎng)。1998年Ronaghi[28]發(fā)明了焦磷酸測(cè)序法，其基本原理是利用DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶、三磷酸腺苷雙磷酸酶的協(xié)同作用，檢測(cè)引物延伸過(guò)程中所釋放的熒光，通過(guò)峰值高低判斷與其匹配的堿基數(shù)量。該方法在通量、成本、耗時(shí)等方面優(yōu)于Sanger法，廣泛運(yùn)用于SNP位點(diǎn)、等位基因突變檢測(cè)等。但由于遺傳病的異質(zhì)性及較大片段基因的檢測(cè)需求，新一代測(cè)序技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。

3.2 第二代測(cè)序技術(shù)(next-generation sequencing，NGS) 單基因遺傳病具有明確的臨床、生化指征和/或已知突變熱點(diǎn)，則對(duì)靶區(qū)域進(jìn)行Sanger測(cè)序可精確高效做出分子診斷；然而篩選未知候選基因是一大難題。同時(shí)，利用連鎖分析和關(guān)聯(lián)分析定位遺傳病致病基因的傳統(tǒng)方法耗時(shí)費(fèi)力，且當(dāng)家系中受累親屬人數(shù)有限、或疾病遺傳不外顯或外顯不全，亦或是患者為自發(fā)突變，則連鎖分析法難以進(jìn)行[29]。新興的第二代測(cè)序技術(shù)是用內(nèi)切酶將基因組DNA處理成一定長(zhǎng)度范圍的DNA片段，然后進(jìn)行文庫(kù)制備并擴(kuò)增文庫(kù)DNA，測(cè)序過(guò)程可分為兩類：使用DNA聚合酶和熒光標(biāo)記或H+標(biāo)記的4種dNTP進(jìn)行單堿基擴(kuò)增延伸反應(yīng)的合成測(cè)序；采用DNA連接酶和熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針進(jìn)行雜交反應(yīng)的連接測(cè)序[30]。NGS可快速進(jìn)行大量靶基因篩選、人類全外顯子組測(cè)序、全基因組測(cè)序，通量更高、檢測(cè)更快[31]。

3.3 基于NGS技術(shù)的高通量測(cè)序檢測(cè)

3.3.1 全外顯子組捕獲技術(shù)(whole exome sequencing，WES) 現(xiàn)今已報(bào)道的絕大多數(shù)全基因組研究都僅集中在整個(gè)基因組序列的2%編碼區(qū)，且大約85%的已知孟德爾遺傳病致病基因都位于蛋白質(zhì)編碼區(qū)域[32]。近年來(lái)全外顯子組捕獲技術(shù)的發(fā)展為遺傳病快速診斷創(chuàng)造了條件。2009年，Ng等[33]對(duì)4例無(wú)親緣關(guān)系Freeman-Sheldon綜合征患者及8例正常個(gè)體進(jìn)行外顯子組捕獲和第二代測(cè)序，在世界上首次證實(shí)外顯子組捕獲—第二代測(cè)序在確定罕見致病基因方面具有可行性和應(yīng)用價(jià)值。隨后Ng等[34]利用相同的方法策略檢測(cè)出Miller綜合征的致病基因DHODH，這也是國(guó)際上首次成功應(yīng)用外顯子組捕獲—第二代測(cè)序技術(shù)檢出遺傳病的未知致病基因。該技術(shù)所需樣本數(shù)量少、通量高、耗費(fèi)低，大大推進(jìn)了人類單基因遺傳病的分子診斷。

外顯子組捕獲集中于外顯子區(qū)域的測(cè)序，不能獲得完整的基因組信息，如啟動(dòng)子區(qū)、增強(qiáng)子區(qū)、microRNAs編碼區(qū)等；其次，外顯子組捕獲過(guò)程中存在打斷再拼接，讀長(zhǎng)較短將導(dǎo)致大的插缺難以拼接，故DNA結(jié)構(gòu)變異無(wú)法檢測(cè)；再者，難以檢出位于高度同源區(qū)的變異體，易出現(xiàn)假陽(yáng)性、假陰性結(jié)果[35]。

3.3.2 分子倒位探針平行測(cè)序(MIPs) 分子倒位探針(molecular inversion probes, MIPs)技術(shù)所采用的探針是與基因組靶點(diǎn)互補(bǔ)的單鏈DNA分子，可與基因組靶點(diǎn)雜交并將其捕獲。MIPs探針由兩側(cè)向內(nèi)部共包含7個(gè)基本結(jié)構(gòu)[36-38]：位于兩端的2段與目的基因互補(bǔ)的序列；向內(nèi)為2段對(duì)所有MIPs通用的PCR引物序列，可視為探針釋放位點(diǎn)，通常還包含一個(gè)限制酶切位點(diǎn)；以及一段探針特異性標(biāo)簽序列和一個(gè)限制酶切位點(diǎn)，作為標(biāo)簽釋放位點(diǎn)。當(dāng)探針的互補(bǔ)序列與基因組靶點(diǎn)結(jié)合后環(huán)化，在內(nèi)切酶Ⅰ的作用下釋放探針形成倒位序列，然后以通用引物完成靶序列富集，內(nèi)切酶Ⅱ處理釋放Tag標(biāo)簽序列，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)目的基因測(cè)序。該技術(shù)具有高通量、高靈敏度、高準(zhǔn)確性，目前多重MIPs分析技術(shù)已可在同一體系檢測(cè)超過(guò)55 000個(gè)基因座[36]，適用于大規(guī)模檢測(cè)。分子倒位探針平行測(cè)序技術(shù)已廣泛應(yīng)用于SNP分型、拷貝數(shù)變異檢測(cè)、等位基因失衡分析等。

單基因遺傳病具有復(fù)雜的表型異質(zhì)性及遺傳異質(zhì)性，基因突變可涉及點(diǎn)突變、片段缺失/重復(fù)、整個(gè)基因的缺失/重復(fù)、以及動(dòng)態(tài)突變等眾多類別，針對(duì)不同遺傳病使用不同的解決方案，是目前單基因遺傳病分子診斷的主流思想。隨著分子遺傳學(xué)診斷技術(shù)的飛速發(fā)展，基因診斷新技術(shù)將廣泛應(yīng)用于出生缺陷與遺傳病診斷中?；蛟\斷相關(guān)人員不僅要了解遺傳疾病致病基因及其突變特點(diǎn)，還要熟知各種檢測(cè)技術(shù)的特點(diǎn)，合理選擇。

[1] 傅松濱. 醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)[M].第3版. 北京:北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社, 2013.

[2] 馬端, 周文浩, 黃國(guó)英. 罕見病并不罕見[J]. 中國(guó)循證兒科雜志, 2011, 6(2): 83-86.

[3] Jie Zhang, Bao-Sheng Zhu, Jing He, et al. The spectrum of α- and β-thalassemia mutations in Yunnan Province of Southwestern China [J]. Hemoglobin, 2012, 36(5): 464-473.

[4] Genes and human disease [R/OL]. http://www.who.int/genomics/public/geneticdiseases/en/index2.html.[2014-01-16]

[5] Kan YW, Golbus MS, Dozy AM. Prenatal diagnosis of alpha-thalassemia. Clinical application of molecular hybridization[J]. N Engl J Med, 1976, 295 (21): 1165 -1167.

[6] Saiki RK, Walsh PS, Levenson CH, et al. Genetic analysis of amplified DNA with immobilized sequence-specific oligonucleotide probes[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1989, 86: 6230-6234.

[7] Chan V, Yam I, Chen FE, et al. A reverse dot-blot method for rapid detection of non-deletion alpha thalassaemia[J]. Br J Haematol, 1999, 104: 513-515.

[8] Rudkin GT, Stollar B. High resolution detection of DNA-RNA hybrids in situ by indirect immuno fluorescence[J]. Nautre, 1977, 265: 472-473.

[9] Manzur A, Muntoni F. Diagnosis and new treatments in muscular dystrophies[J]. J Neurol Neurosurg Psychiatry, 2009, 80(7): 706-714.

[10] Miller MB, Tang YW. Basic concepts of microarrays and potential applications in clinical microbiology[J]. Clin Microbiol Rev, 2009, 22(4): 611-633.

[11] Yoo SM, Choi JH, Lee SY, et al. Applications of DNA microarray in disease diagnostics [J]. J Microbiol Biotechnol, 2009, 19(7):635-646.

[12] Hindson CM, Chevillet JR, Briggs HA, et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR[J]. Nature Methods, 2013, 10(10): 1003-1005.

[13] Crépin M, Pigny P, Escande F, et al. Evaluation of denaturing high performance liquid chromatography for the mutational analysis of the MEN1 gene[J]. J Mol Endocrinol, 2006, 36(2): 369-376.

[14] Wittwer CT, Reed GH, Gundry CN, et al. High-resolution genotyping by amplicon melting analysis using LCGreen[J]. Clin Chem, 2003, 49: 853-860.

[15] Schouten JP, McElgunn CJ, WaaOer R, et a1. Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligationdependent probe amplification[J]. Nucleic Acids Res, 2002, 30(12): e57.

[16] Hudecova I. Digital PCR analysis of circulating nucleic acids[J]. Clinical Biochemistry, 2015, 48(15): 948-956.

[17] Vogelstein B, Kinzler KW. Digital PCR[J]. Proc Natl Acad Sci USA. 1999, 96(16): 9236-9241.

[18] Liu J, Hansen C, Quake SR. Solving the “world-to-chip’’ interface problem with a microfluidic matrix[J]. Anal Chem, 2003, 75(18):4718-4723.

[19] Chu T, Bunce K, Hogge WA, et al. Statistical considerations for digital approaches to non-invasive fetal genotyping[J]. Bioinformatics, 2010, 26(22): 2863-2866.

[20] Lam KW, Jiang P, Liao GJ, et al. Noninvasive prenatal diagnosis of monogenic diseases by targeted massively parallel sequencing of maternal plasma: application to β-thalassemia[J]. Clin Chem, 2012, 58(10): 1467-1475.

[21] Tsui NB, Kadir RA, Chan KC. Noninvasive prenatal diagnosis of hemophilia by microfluidics digital PCR analysis of maternal plasma DNA[J]. Blood, 2011, 117(13): 3684-3691.

[22] Liu W, Smith DI, Rechtzigel KJ, et al. Denaturing high performance liquid chromatography (DHPLC) used in the detection of germline and somatic mutations[J]. Nucleic Acids Res, 1998, 26(6): 1396-1400.

[23] Reed GH, Kent JO, Wittwer CT. High-resolution DNA melting analysis for simple and efficient molecular diagnostics[J]. Pharmacogenomics, 2007, 8(6): 597-608.

[24] Reed GH, Wittwer CT. Sensitivity and specificity of single-nucleotide polymorphism scanning by high-resolution melting analysis[J]. Clin Chem, 2004, 50: 1748-1754.

[25] White S, Kalf M, Liu Q, et al . Comprehensive detection of genomic duplications and deletions in the DMD gene ,by use of multiplex amplifiable probe hybridization [J]. Am J Hum Genet, 2002, 71: 365-374.

[26] Liborio Stuppia, Ivana Antonucci, Giandomenico Palka, et al. Use of the MLPA assay in the molecular diagnosis of gene copy number alterations in human genetic diseases[J]. Int J Mol Sci, 2012, 13: 3245-3276.

[27] Sanger F, Nicklen S, Coulson AR. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1977, 74(12): 5463-5467.

[28] Ronaghi M, Uheln M, Nyren P. A sequencing method based on real-time pyrophosphate[J]. Science, 1998, 281(5375): 363.

[29] Franke L, van BH, Fokkens L, et al. Reconstruction of a functional human gene network, with an application for prioritizing positional candidate genes[J]. Am J Hum Genet, 2006, 78: 1011-1025.

[30] Mardis ER. Next-generation DNA sequencing methods[J]. Annu Rev Genomics Hum Genet, 2008, 9(1): 387-402.

[31] Metzker ML. Sequencing technologies-the next generation[J]. Nat Rev Genet, 2010, 11(1): 31-46.

[32] Botstein D, Risch N. Discovering genotypes underlying human phenotypes: past successes for Mendelian disease, future approaches for complex disease[J]. Nat Genet, 2003, 33(Suppl): 228-237.

[33] Ng SB, Turner EH, Robertson PD, et al. Targeted capture and massively parallel sequencing of 12 human exomes[J]. Nature, 2009, 461(7261): 272-276.

[34] Ng SB, Buckingham KJ, Lee C, et al. Exome sequencing identifies the cause of a mendelian disorder [J]. Nat Genet, 2010, 42(1): 30-35.

[35] Gilissen C, Hoischen A, Han G Brunner, et al. Disease gene identification strategies for exome sequencing[J]. Eur J Hum Geneti, 2012, 20: 490-497.

[36] Turner EH, Ng SB, Nickerson DA, et al. Method for genomic partitioning[J]. Annu Rev Genomics Hum Genet, 2009,10: 263-284.

[37] Hardenbol P, Banér J, Jain M, et al. Multiplexed genotyping with sequence-tagged molecular inversion probes[J]. Nat Biotechnol, 2003, 21(6): 673-678.

[38] Hardenbol P, Yu F, Belmont J, et al. Highly multiplexed molecular inversion probe genotyping: over 10,000 targeted SNPs genotyped in a single tube assay[J]. Genome Res, 2005, 15(2): 269-275.

編輯：宋文穎

10.13470/j.cnki.cjpd.2016.03.002

國(guó)家自然科學(xué)基金(81260415)、云南省衛(wèi)生領(lǐng)軍人才項(xiàng)目(L-201201)

R714.55

A

2016-07-22)

*通信作者：朱寶生，E-mail：bszhu@aliyun.com