韓　偉，劉　曦，黃伯駿

(華東理工大學(xué) 中藥現(xiàn)代化工程中心，上海　200237)

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Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化枇杷葉熊果酸的提取工藝

韓偉，劉曦，黃伯駿

(華東理工大學(xué) 中藥現(xiàn)代化工程中心，上海200237)

摘要：以枇杷葉熊果酸得率為指標(biāo)，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、液固比、微波輻射時(shí)間和超聲時(shí)間4個(gè)對熊果酸得率影響較大的因素，采用Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)法對熊果酸的微波輔助超聲提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，建立多元回歸方程，并進(jìn)行預(yù)測分析.結(jié)果顯示：當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為78.5%、液固比為24.4 mL/g、微波時(shí)間為204 s、超聲時(shí)間為74 min時(shí)，熊果酸的得率為10.443%；乙醇體積分?jǐn)?shù)、微波輻射時(shí)間和超聲時(shí)間為熊果酸提取過程中的顯著因素，乙醇體積分?jǐn)?shù)、液固比和微波輻射時(shí)間的二次項(xiàng)對得率的響應(yīng)曲面有非常顯著的影響，超聲時(shí)間分別與乙醇體積分?jǐn)?shù)、液固比之間的交互作用顯著.

關(guān)鍵詞：枇杷葉；熊果酸；微波輔助超聲提取； Box-Behnken設(shè)計(jì)；響應(yīng)面

枇杷葉作為一種藥用歷史悠久的止咳、化痰、平喘藥[1]，具有清肺化痰、消炎鎮(zhèn)痛[2]、止咳止嘔、和胃降逆、提高免疫力[3]等多種功效.根據(jù)近年來的藥理研究表明，枇杷葉中所含的熊果酸是枇杷葉的主要活性成分，作為一種天然的弱酸性五環(huán)三萜類化合物，其具有保護(hù)肝臟[4]、降低血糖[5]、消炎止痛[6]、抗癌、抗氧化[7-8]、治療抑郁癥[9]等多種藥理作用，具有很大的藥用價(jià)值.目前已有的熊果酸的提取方法包括溶劑萃取法、熱回流法[10]、索氏提取法[11]、超臨界CO2提取法[12]等.

Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是一種評價(jià)指標(biāo)與因素間非線性關(guān)系、解決多變量問題的設(shè)計(jì)方法，其通過所得到的實(shí)驗(yàn)值，建立多元二次回歸方程，擬合因素與效應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，并通過方差分析與響應(yīng)面尋求最佳工藝參數(shù)，確定各因素對效應(yīng)值的影響以及不同因素之間的相互作用關(guān)系[13].該方法不需要連續(xù)進(jìn)行多次實(shí)驗(yàn)，因此在因素?cái)?shù)相同的情況下，實(shí)驗(yàn)組合數(shù)比中心組合設(shè)計(jì)和正交設(shè)計(jì)法更少、更經(jīng)濟(jì)，并且使用方便，條件預(yù)測性能優(yōu)良，廣泛應(yīng)用于中藥提取、分析檢測、化學(xué)合成以及生物工程等領(lǐng)域[14].本研究采用Box-Behnken響應(yīng)面法對微波輔助超聲提取枇杷葉熊果酸過程的主要參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，并對該工藝過程進(jìn)行預(yù)測.

1材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1主要原料與試劑

枇杷葉，產(chǎn)地浙江，購于上海華宇藥業(yè)有限公司；熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品，購于上海同田生物有限公司；香草醛、冰醋酸、高氯酸、無水乙醇，均為分析純，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司.

1.1.2主要儀器設(shè)備

紫外分光光度計(jì)(UV1900PC)，上海亞研電子有限公司；微波提取裝置(ER-692型)，中國電子器件工業(yè)總公司；超聲提取裝置(SK3310HP)，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；智能數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-4)，鞏義市予華儀器有限公司；恒溫干燥箱(101-0型)，滬南電爐烘箱廠；移液管、具塞刻度試管、三口燒瓶、量筒、比色皿、布氏漏斗等，上海壇玻玻璃儀器廠.

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1提取方法

稱取枇杷葉3 g置于250 mL三口燒瓶，加入乙醇溶液，在微波裝置提取后再置于超聲波裝置中提取，冰浴冷卻后，減壓抽濾，取濾液待測.

1.2.2分析方法

本實(shí)驗(yàn)采用香草醛-高氯酸顯色法對枇杷葉中的熊果酸質(zhì)量濃度進(jìn)行分析，并在545 nm下置于紫外-可見光分光光度計(jì)中進(jìn)行吸光度值的檢測.

1.2.3計(jì)算方法

依據(jù)1.2.2中的分析方法對枇杷葉中熊果酸物質(zhì)進(jìn)行檢測，得到相應(yīng)的吸光度值A(chǔ)，并利用標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計(jì)算出熊果酸質(zhì)量濃度，從而進(jìn)一步計(jì)算其得率：

其中：C為樣品中熊果酸的質(zhì)量濃度(mg/mL)，V為提取溶劑用量(mL)，M為枇杷葉的質(zhì)量(g)，n為溶液稀釋倍數(shù).

2結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

采用熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以相應(yīng)顯色試劑作空白對照，在545 nm的波長下進(jìn)行檢測，并以熊果酸質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)、吸光度(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示.

由圖1可知，其線性回歸方程為：A=42.947C+0.0118，線性濃度范圍為0.001 04~0.018 72 mg/mL，R2=0.9995，說明熊果酸質(zhì)量濃度C與吸光度值A(chǔ)具有良好的線性關(guān)系.并且經(jīng)過實(shí)驗(yàn)考察，具有良好的精密度、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性.

2.2Box-Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化熊果酸提取工藝

2.2.1Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

本文選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、液固比、微波輻射時(shí)間和超聲時(shí)間4個(gè)因素，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)，對這4個(gè)因素之間的交互作用進(jìn)行進(jìn)一步考察.其中，每個(gè)因素選取3個(gè)水平，分別用-1、0、1表示，然后對選定的4個(gè)因素進(jìn)行編碼，結(jié)果見表1.

表1　Box-Behnken設(shè)計(jì)的試驗(yàn)因素水平及編碼

同時(shí)，采用Design Expert-8設(shè)計(jì)軟件，選擇中心點(diǎn)重復(fù)試驗(yàn)為5次，設(shè)計(jì)交互作用試驗(yàn)29組，得到試驗(yàn)結(jié)果.

表2　Box-Behnken 設(shè)計(jì)的試驗(yàn)因素水平及編碼

2.2.2回歸方程的建立與方差分析

利用Design Expert-8軟件，以表2中枇杷葉中熊果酸得率為對象，建立多元回歸方程如下所示，并進(jìn)行方差分析.

Y=10.17+0.53X1-0.038X2+0.70X3+0.055X4-0.064X1X2-0.0085X1X3-0.12X1X4+

表3　擬合方程的方差分析和因素顯著性檢驗(yàn)

續(xù)表3

從表3中可知，F(xiàn)Model=121.74，PModel<0.0001，說明該二次回歸方程是極顯著的，模型F值發(fā)生噪聲的概率不到0.01%.F線性=26.50，P線性<0.0001，說明該擬合方程的線性關(guān)系顯著.F失擬=1.20，P失擬=0.0621>0.05，表明相對于純誤差，失擬現(xiàn)象不顯著，方程的擬合狀況良好，可用于分析和預(yù)測本文的提取工藝.

因此，根據(jù)上述分析，剔除二次回歸方程中影響不顯著的因素，得到簡化方程如下：

2.3響應(yīng)面分析

2.3.1乙醇體積分?jǐn)?shù)與液固比的響應(yīng)面曲線分析

由圖2可知，設(shè)定X3與X4為0時(shí)，得率(Y)隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)(X1)的增加而顯著增大.當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)(X1)較低時(shí)，得率(Y)隨著液固比(X2)的增加先增大而后減小，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)(X1)較高時(shí)，得率(Y)隨液固比(X2)的增加而減小.因此，在一定的微波時(shí)間和超聲時(shí)間下，適當(dāng)增加乙醇體積分?jǐn)?shù)與合適的液固比有利于熊果酸得率的增加.同時(shí)根據(jù)熊果酸得率的變化可以看出，乙醇體積分?jǐn)?shù)(X1)對得率(Y)的影響大于液固比(X2)，但二者的交互作用并不顯著.

2.3.2乙醇體積分?jǐn)?shù)與微波輻射時(shí)間的響應(yīng)面曲線分析

圖2　Y=F(X1,X2)的響應(yīng)面曲線圖與等值線圖

由圖3可知，設(shè)定X2與X4為0,得率(Y)隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)(X1)的增加而增大，同時(shí)得率(Y)也隨著微波時(shí)間(X3)的增加而呈上升趨勢.因此，在一定的液固比和超聲時(shí)間下，增加乙醇濃度與延長微波時(shí)間均可以提高熊果酸的得率.同時(shí)乙醇體積分?jǐn)?shù)(X1)與微波時(shí)間(X3)對得率(Y)的影響均十分顯著，但是二者的交互作用并不顯著.

2.3.3乙醇濃度與超聲時(shí)間的響應(yīng)面曲線分析

圖3　Y=F(X1, X3)的響應(yīng)面曲線圖與等值線圖

由圖4可知，設(shè)定X2與X3為0.當(dāng)超聲時(shí)間(X4)較短時(shí)，得率(Y)隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)(X1)的增加而顯著增大，當(dāng)超聲時(shí)間(X4)較長時(shí)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)(X1)的增加，得率(Y)先迅速增加而后趨于平緩，最后呈下降趨勢.當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)較低(X1)時(shí)，得率(Y)隨著超聲時(shí)間(X4)的增加而小幅增加，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)(X1)較高時(shí)，得率(Y)隨著微波時(shí)間(X3)的增加而基本保持不變，甚至略微下降.因此，在一定的液固比和微波時(shí)間下，適當(dāng)?shù)卦黾右掖俭w積分?jǐn)?shù)，并且選擇合適的超聲時(shí)間，可有效地提高熊果酸得率.并且乙醇體積分?jǐn)?shù)(X1)對得率(Y)的影響大于超聲時(shí)間(X4)，二者的交互作用顯著.

2.3.4液固比與微波輻射時(shí)間的響應(yīng)面曲線分析

圖4　Y=F(X1, X4)的響應(yīng)面曲線圖與等值線圖

由圖5可知，設(shè)定X1與X4為0.當(dāng)微波時(shí)間(X3)較短時(shí)，得率(Y)隨著液固比(X2)的增加先增大后減小，但變化不顯著；當(dāng)微波時(shí)間(X3)較長時(shí)，隨著液固比(X2)的增加，得率(Y)基本保持不變.同時(shí)，得率(Y)均隨著微波時(shí)間(X3)的增加而增加，并且增幅明顯.因此，在一定的乙醇體積分?jǐn)?shù)和超聲時(shí)間下，合適的液固比與較長的微波時(shí)間均對枇杷葉中熊果酸的提取有利.并且微波時(shí)間(X3)對得率(Y)的影響大于液固比(X2)，二者無顯著的交互作用.

2.3.5液固比與超聲時(shí)間的響應(yīng)面曲線分析

圖5　Y=F(X2, X3)的響應(yīng)面曲線圖與等值線圖

由圖6可知，設(shè)定X1與X3為0.當(dāng)超聲時(shí)間(X4)較短時(shí)，得率(Y)隨液固比(X2)的增加先增大后減小，但變化不明顯；當(dāng)超聲時(shí)間(X4)較長時(shí)，隨著液固比(X2)的增加，得率(Y)先保持不變，而后呈下降趨勢.當(dāng)液固比(X2)較小時(shí)，得率(Y)隨著超聲時(shí)間(X4)的增加而增大，當(dāng)液固比(X2)較大時(shí)，得率(Y)基本無變化.因此，在一定的乙醇濃度和微波時(shí)間下，為了提高枇杷葉熊果酸的得率應(yīng)選擇適中的液固比與超聲時(shí)間.并且液固比(X2)對得率(Y)的影響小于超聲時(shí)間(X4)，二者的交互作用較為顯著.

2.3.6微波輻射時(shí)間與超聲時(shí)間的響應(yīng)面曲線分析

圖6　Y=F(X2, X4)的響應(yīng)面曲線圖與等值線圖

圖7可知，設(shè)定X1與X2為0,得率(Y)隨著微波時(shí)間(X3)的增加而增大，但是超聲時(shí)間(X4)對得率(Y)的影響很小.因此，在一定的乙醇體積分?jǐn)?shù)和液固比下，較長的微波時(shí)間十分有利于提高枇杷葉熊果酸的得率，并且微波時(shí)間(X3)對得率(Y)的影響遠(yuǎn)大于超聲時(shí)間(X4)，二者的交互作用不顯著.

2.4提取工藝的優(yōu)化與驗(yàn)證

圖7　Y=F(X3, X4)的響應(yīng)面曲線圖與等值線圖

根據(jù)Design Expert-8軟件的計(jì)算結(jié)果可得微波輔助超聲提取枇杷葉熊果酸的最佳工藝參數(shù)與理論得率，結(jié)果如表4.

表4　提取工藝參數(shù)的優(yōu)化

根據(jù)提取工藝參數(shù)優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)和重復(fù)性考察，得到熊果酸的平均得率(即真實(shí)最佳得率)為10.443%，SD=0.159，RSD=1.527%(<3%)，與理論得率10.639%相差1.841%(<3%)，結(jié)果表明Design Expert-8對于熊果酸得率的預(yù)測具有較高的準(zhǔn)確率，因此可以很好地優(yōu)化枇杷葉熊果酸的提取工藝條件.

3結(jié)論

1) 本研究選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)、液固比、超聲時(shí)間和微波時(shí)間4個(gè)對熊果酸得率影響較大的因素進(jìn)行Box-Behnken設(shè)計(jì)，建立相應(yīng)的二次回歸方程.通過方差分析和響應(yīng)曲面分析發(fā)現(xiàn)，乙醇體積分?jǐn)?shù)、微波輻射時(shí)間和超聲時(shí)間為熊果酸提取過程中的顯著因素，并且它們的二次項(xiàng)對熊果酸得率的響應(yīng)面曲線有非常顯著的影響.同時(shí)，超聲時(shí)間分別與乙醇體積分?jǐn)?shù)、液固比之間的交互作用顯著.

2) 通過Box-Behnken設(shè)計(jì)對枇杷葉熊果酸提取工藝的重要影響因素進(jìn)行優(yōu)化：乙醇體積分?jǐn)?shù)為78.5%，液固比為24.4 mL/g，微波輻射時(shí)間204 s，超聲時(shí)間74 min，由此得到的熊果酸得率的平均值為10.443%，與實(shí)驗(yàn)預(yù)測值僅相差1.841%，表明該設(shè)計(jì)方法可用于熊果酸提取工藝的分析和預(yù)測，并具有較高的可靠性.

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(編輯崔思榮)

Optimal Extraction of Ursolic Acid from Loquat Leaves by

Box-Behnken Design and Response Surface Method

HAN Wei,LIU Xi,HUANG Bo-jun

(Engineering Center for Tradition Chinese Medicine Modernization，

East China University of Science and Technology，Shanghai 200237，China)

Abstract:Taking the ursolic acid yield of loquat leaves as an index and four factors including ethanol concentration,liquid-solid ratio,microwave radiation time and ultrasonic time as the most influential parameters,this paper established the multiple regression equation with predictive analysis to optimize the microwave-assisted ultrasonic extraction by Box-Behnken design and response surface method.The result showed that the best yield of ursolic acid was up to 10.443% with ethanol concentration at 78.5%,liquid-solid ratio of 24.4 mL/g,ultrasonic time of 74 min and microwave radiation time of 204 s.Meanwhile, the ursolic acid yield was significantly influenced by ethanol concentration, microwave radiation time and ultrasonic time during the extraction process.The response surface was dramatically affected by ethanol concentration,liquid-solid ratio and microwave radiation time.The interactions were prominent among ultrasonic time, ethanol concentration and liquid-solid ratio.

Key words:loquat leaves; ursolic acid; microwave-assisted ultrasonic extraction; Box-Behnken design; response surface

中圖分類號：R284.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1674-358X(2015)01-0001-08

作者簡介：韓偉(1968-)，男，江蘇寶應(yīng)人，教授，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事天然產(chǎn)物的提取、分離及功能研究.

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(20006003)；華東理工大學(xué)本科教育教學(xué)改革項(xiàng)目(2013)

收稿日期：2014-11-08