Annexin A2在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜組織中的表達(dá)

陳揚(yáng)*

( 浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 杭州 311422)

摘 要目的：檢測(cè)膜聯(lián)蛋白（annexin）A2在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）滑膜組織中的表達(dá)，研究annexin A2與RA發(fā)生的相關(guān)性，期望能夠在基因水平早期診斷和治療RA，為明確RA的靶向性治療提供幫助。 方法：采用real-time PCR技術(shù)檢測(cè)annexin A2 mRNA在17例RA和15例骨性關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）滑膜組織標(biāo)本中的表達(dá)；采用蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE染色）對(duì)此32例滑膜組織標(biāo)本進(jìn)行了病理學(xué)觀察，從炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、纖維增生、滑膜細(xì)胞增生以及新生血管形成等4個(gè)方面加以評(píng)估。并比較兩組的annexin A2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量以及病理學(xué)觀察評(píng)估結(jié)果。結(jié)果：annexin A2 mRNA在所有RA及OA滑膜組織樣本中均有表達(dá)，但其在RA滑膜組織中的表達(dá)量顯著高于OA滑膜組織（P<0.05）；HE染色顯示RA組及OA組間炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維組織增生情況無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，但滑膜細(xì)胞增生及新生血管形成等病理改變存在顯著性差異（P＜0.05），光學(xué)顯微鏡下在RA組可見(jiàn)滑膜細(xì)胞大量增生，且新生血管豐富，而這些在OA組少見(jiàn)。 結(jié)論：annexin A2與RA的發(fā)生關(guān)系密切，它的高表達(dá)可能在RA滑膜組織的病理改變中起到重要作用，有助于我們了解RA發(fā)生的分子生物學(xué)途徑，進(jìn)而為臨床提供有針對(duì)性的治療措施。

關(guān)鍵詞類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 annexin A2 real-time PCR HE染色

Expression of annexin A2 in rheumatoid arthritis synovial tissue

CHEN Yang*

(First Clinical Medical College of Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 311422, China)

ABSTRACTObjective: To detect the expression of annexin A2 in rheumatoid arthritis synovial tissue, and to study the relationship between annexin A2 and the occurrence of rheumatoid arthritis (RA). Methods: The expression of annexin A2 mRNA in the synovial tissue samples of 17 cases of RA and 15 cases of osteoarthritis (OA) patients was detected by real-time PCR and their pathological observation was performed by HE staining, and four indicators such as inflammatory cell infiltration, fibrosis, synovial cell proliferation and angiogenesis were assessed. The levels of the relative expression of annexin A2 mRNA and the assessment results of pathological observation were compared between two groups. Results: Annexin A2 mRNA was expressed in both RA and OA synovial tissue samples but the amount of annexin A2 mRNA expression was significantly higher in the RA group than in the OA group (P＜0.05). HE staining showed that there were no significant differences in inflammatory cell infiltration and fibrous tissue hyperplasia but there were significant differences in pathological changes such as proliferation of synovial cells and neovascularization (P＜0.05). A large amount of synovial cell proliferation and rich angiogenesis could be found in the RA group but less in the OA group under optical microscope. Conclusion: There is a close relationship between annexin A2 and the occurrence of RA, and the high expression of annexin A2 mRNA may play an important role in pathological changes of RA synovial tissue, which can help us understand a way of molecule biology for the occurrence of RA.

KEY WORDSrheumatoid arthritis; annexin A2; real-time PCR; HE staining

類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以致殘性關(guān)節(jié)病變?yōu)橹鞯淖陨砻庖咝约膊。洳±硖卣髦饕憩F(xiàn)為滑膜細(xì)胞異常增殖和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，累及周身關(guān)節(jié)滑膜炎及血管翳形成，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致滑膜增厚，形成侵襲性血管翳，侵蝕軟骨與骨導(dǎo)致關(guān)節(jié)破壞，全世界約有1%的人患有此病，5～10年致殘率高達(dá)60%[1]。

但其發(fā)病原因至今仍未明確，不過(guò)可以肯定的是RA是多因子、多步驟、多階段的演進(jìn)過(guò)程[2]。因此尋找與RA發(fā)生發(fā)展相關(guān)的敏感因子對(duì)其早期診斷及治療有著重要意義。

annexin A2是一類(lèi)鈣依賴性膜磷脂結(jié)合蛋白，它參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡和遷移等重要生命過(guò)程[3]。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者發(fā)現(xiàn)annexin A2的高表達(dá)與RA的發(fā)生密切相關(guān)[4-5]，但其在RA發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制卻鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究應(yīng)用real-time PCR來(lái)評(píng)估RA滑膜組織中annexin A2 mRNA表達(dá)，HE染色觀察RA滑膜組織病理情況，判斷annexin A2的表達(dá)和RA的發(fā)生發(fā)展是否相關(guān)。為明確RA發(fā)生的分子生物學(xué)途徑提供思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨傷科2013年3月-2014年6月膝關(guān)節(jié)置換術(shù)切除的類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）滑膜組織標(biāo)本17例，骨性關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis, OA）滑膜組織標(biāo)本15例。每一個(gè)標(biāo)本的收集都取得了患者知情同意。所有RA患者均符合美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)（ACR）1987年修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]：①早起關(guān)節(jié)僵硬至少l h（≥6周）；②3個(gè)以上關(guān)節(jié)腫脹（≥6周）；③手關(guān)節(jié)或掌指關(guān)節(jié)或近端指間關(guān)節(jié)腫脹（≥6周）；④對(duì)稱性腫脹；⑤手的X線改變。⑥皮下結(jié)節(jié)；⑦類(lèi)風(fēng)濕因子陽(yáng)性。如具備4項(xiàng)以上指標(biāo)即可確診。所有OA患者均根據(jù)1995年美國(guó)風(fēng)濕病協(xié)會(huì)修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]，即：①一個(gè)月來(lái)大多數(shù)時(shí)間發(fā)生膝痛；②X線片示關(guān)節(jié)邊緣骨贅；③關(guān)節(jié)液檢查符合骨關(guān)節(jié)炎（清晰、黏稠、WBC＜2×109/L）；④年齡≥40歲；⑤晨僵≤30 min；⑥關(guān)節(jié)活動(dòng)時(shí)有關(guān)節(jié)摩擦音，診斷標(biāo)準(zhǔn)：①②確診或①③⑤⑥確診或①④⑤⑥確診。所有標(biāo)本離體后迅速放置于-80℃超低溫冰箱保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)主要儀器與試劑

主要儀器：iQ5 PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司）、臺(tái)式高速離心機(jī)（德國(guó)Heraeus公司）、超低溫冰箱（日本SANYO公司）、臺(tái)式恒溫振蕩器（江蘇太倉(cāng)實(shí)驗(yàn)儀器廠）、恒溫水浴箱（上海醫(yī)療器械七廠）、超凈工作臺(tái)（蘇州三興凈化公司）、紫外分光光度儀（美國(guó)Thermo公司）、切片機(jī)（德國(guó)Microm公司）等均由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供。

主要試劑：HE染色試劑盒（江蘇碧云天）；熒光定量試劑盒（SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ（Perfect Real Time））、RNA提取試劑（Takara RNAiso Plus）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptTM RT reagent）均購(gòu)自Takara公司。熒光定量PCR引物序列由生工生物工程（上海）有限公司設(shè)計(jì)并合成。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 annexin A2 mRNA表達(dá)的檢測(cè)

將收集的滑膜組織標(biāo)本放入-80 ℃冰箱保存待檢，提取總RNA時(shí)將標(biāo)本置于裝有液氮的研缽中研磨呈粉末狀，加入1 ml RNAiso plus（Takara公司），按說(shuō)明書(shū)操作提取RNA，并測(cè)定RNA的濃度、純度及完整性。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按照RT-reagent逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara公司）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，將逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系加到無(wú)RNase的PCR管內(nèi)，42 ℃ 40 min，95 ℃ 5 min，將獲得的cDNA保存于4 ℃冰箱備用。

annexin A2基因擴(kuò)增上游引物：5’-TCTACTGTTCACGAAATCCTGTG-3’，下游引物：5’-AGTATAGGCTTTGACAGACCCAT-3’，擴(kuò)增長(zhǎng)度：90 bp。內(nèi)對(duì)照GAPDH上游引物：5’-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3’，下游引物：5’-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3’，擴(kuò)增長(zhǎng)度：143 bp。熒光定量PCR反應(yīng)按Takara公司產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)操作：將cDNA用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，95 ℃預(yù)變性3 min，然后95 ℃ 10 s、60 ℃（退火溫度根據(jù)不同引物而不同）退火30 s；總共48個(gè)循環(huán)。熔解曲線：從55 ℃開(kāi)始，每30 s升高0.5 ℃，直到95 ℃，循環(huán)一次。實(shí)驗(yàn)總共重復(fù)3次。

所有反應(yīng)信息資料由iQ5 PCR儀收集，Ct值通過(guò)該P(yáng)CR儀內(nèi)置的相對(duì)定量分析軟件來(lái)測(cè)量和計(jì)算，轉(zhuǎn)錄水平通過(guò)比較閾值法計(jì)算[8]，計(jì)算方法是，△△Ct=實(shí)驗(yàn)組△Ct（目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值）-對(duì)照組△Ct（目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值）。計(jì)算2—△△Ct作為目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.2 滑膜組織病理觀察

解凍RA組及OA組滑膜組織，于40%福爾馬林溶液中保存，常規(guī)脫水、浸蠟、包埋、切片、HE染色。光學(xué)顯微鏡下觀察兩組滑膜增生、新生血管、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維組織增生等病理學(xué)變化，根據(jù)Tsubaki等[9]相

關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行評(píng)分（表1）。

表1 各組滑膜HE染色評(píng)分的4項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件包，兩組annexin A2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量以及HE染色評(píng)分結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組數(shù)據(jù)間差異分析采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 annexin A2 mRNA的表達(dá)

real-time PCR擴(kuò)增內(nèi)參照GAPDH、RA及OA滑膜組織中的annexin A2基因，結(jié)果表明擴(kuò)增為特異性擴(kuò)增，產(chǎn)物為目的基因，而不是引物二聚體，定量準(zhǔn)確。經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)所有RA及OA滑膜組織樣本均有annexin A2 mRNA的表達(dá)，其相對(duì)表達(dá)量以（x±s）表示（表2）。經(jīng)兩組間獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)annexin A2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量在RA滑膜組織中明顯高于OA滑膜組織，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 annexin A2 mRNA在滑膜組織中的表達(dá)量

2.2 HE染色觀察滑膜組織病理情況

正常情況下，由1～2層滑膜細(xì)胞及滑膜下層組成滑膜襯里層，且只有少量纖維組織和血管，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。RA組及OA組均有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，且有纖維組織增生，但OA組少見(jiàn)滑膜細(xì)胞增生及新生血管形成，而RA組光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)滑膜細(xì)胞大量增生，可達(dá)8層以上，且新生血管豐富（圖1）。兩組HE染色評(píng)分經(jīng)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維組織增生情況無(wú)顯著性差異（P＞0.05），但是滑膜細(xì)胞增生及新生血管形成等病理改變存在顯著性差異（P＜0.05，表3）。

圖1 OA組與RA組滑膜組織病理切片對(duì)比

表3 各組滑膜組織HE染色評(píng)分（x ±s）

3 討論

annexin A2以往多見(jiàn)于其與惡性腫瘤、血液病及抗磷脂綜合征等疾病的相關(guān)性研究報(bào)道，而近年來(lái)Salle等[4]國(guó)內(nèi)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)RA患者中存在annexin A2的高表達(dá)，提示其與RA的發(fā)展密切相關(guān)。而Goulding等[10]早在1995年的研究報(bào)道中指出在包括內(nèi)襯層的類(lèi)風(fēng)濕標(biāo)本染色后，在血管周?chē)徒M織間質(zhì)的巨噬細(xì)胞內(nèi)，annexin A2有著與annexin A1類(lèi)似的分布，尤以血管周?chē)姆植甲顬橥怀觥Ｍ瑫r(shí)Bo等[11]通過(guò)對(duì)人類(lèi)關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞的差異蛋白質(zhì)組分析提示annexin A2可能成為治療RA的新靶點(diǎn)。本研究表明，annexin A2 mRNA在RA和OA的滑膜組織中均有表達(dá)，但其表達(dá)量在RA滑膜組織中明顯高于OA滑膜組織，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。RA和OA在滑膜病變過(guò)程中均有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和纖維組織增生，但RA滑膜組織同時(shí)存在大量滑膜細(xì)胞的增生以及血管翳的形成，且這種病理改變差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此本研究更進(jìn)一步證實(shí)了annexin A2與RA發(fā)生及發(fā)展的相關(guān)性。

有研究報(bào)道annexin A2可能通過(guò)TLR4激活巨噬細(xì)胞[12]，從而上調(diào)炎癥反應(yīng)；AIIt作用于人單核源性巨噬細(xì)胞后可導(dǎo)致促分裂原活化蛋白激酶快速磷酸化和NF-κB的激活[13]，并促進(jìn)TNF-α、IL-1β和IL-6等大量可趨化白細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌。這些均暗示annexin

A2對(duì)炎癥反應(yīng)進(jìn)展有級(jí)聯(lián)放大作用。本研究表明其相對(duì)表達(dá)量在RA滑膜組織中明顯高于OA滑膜組織，且這種差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。RA和OA在滑膜病變過(guò)程中均有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，因此表明annexin A2與RA和OA可能在滑膜炎性改變存在較大的相關(guān)性，但annexin A2 在RA滑膜組織中的高表達(dá)并沒(méi)有引起兩組滑膜組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的顯著性差異，其在RA滑膜組織炎性反應(yīng)中所起的具體作用機(jī)制值得進(jìn)一步研究，尤其是annexin A2的各種存在形式在炎癥反應(yīng)中所起的不同作用。

本研究發(fā)現(xiàn)RA滑膜組織同時(shí)存在大量血管的增生以及血管翳的形成，且有研究指出annexin A2與血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表達(dá)相關(guān)聯(lián)[14]，而VEGF亦是促進(jìn)RA滑膜血管翳形成的最重要的細(xì)胞因子[15]。Nagashima等[16]通過(guò)免疫組化技術(shù)發(fā)現(xiàn)，VEGF在RA的滑膜襯里巨噬樣滑膜細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞和關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中表達(dá)。由此說(shuō)明annexin A2在RA的特異性的病理變化中起到較為關(guān)鍵的作用。

annexin A2參與細(xì)胞增殖，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、浸潤(rùn)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均有不同程度相關(guān)[17]，而RA累及周身關(guān)節(jié)的增生性和侵蝕性滑膜炎的臨床特點(diǎn)極類(lèi)似于“局限性惡性腫瘤”的增生性和破壞性病變，呈進(jìn)行性發(fā)展[18]，由此進(jìn)一步表明了annexin A2在RA滑膜組織中的高表達(dá)在RA病理改變中的獨(dú)特意義。

總之，annexin A2與RA發(fā)生關(guān)系密切，其可能通過(guò)調(diào)控炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，促進(jìn)滑膜細(xì)胞增殖，參與滑膜血管翳形成，以及刺激破骨細(xì)胞分化成熟，從而導(dǎo)致關(guān)節(jié)的破壞，造成關(guān)節(jié)功能障礙，甚至致殘。但其在RA發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸中的具體作用途徑仍有待進(jìn)一步的探索和拓展。我們相信隨著對(duì)annexin A2與RA發(fā)展關(guān)系的深入研究及闡明，annexin A2有望被用于類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的早期檢測(cè)、輔助診斷及治療的靶向分子，進(jìn)而為臨床提供有針對(duì)性的治療措施。

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收稿日期：（2015-02-02）

作者簡(jiǎn)介：*陳揚(yáng)（1989-），男，在讀碩士研究生。研究方向：骨傷外科。E-mail：chen19891022@126.com

文章編號(hào)：1006-1533(2015)09-0045-04

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

中圖分類(lèi)號(hào)：R593.22