李嘉薇，王荔

動(dòng)脈粥樣硬化型是缺血性卒中的一個(gè)重要類型。動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）的病因不清楚，可能與血管的慢性進(jìn)行性炎癥病變有關(guān)，并以內(nèi)皮功能失調(diào)、血管壁膽固醇脂質(zhì)沉積及鈣化和細(xì)胞凋亡為特征，最終導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣斑塊形成、血管腔狹窄。其中血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂是AS早期改變和關(guān)鍵始動(dòng)因素[1]。

腫瘤壞死因子樣凋亡弱誘導(dǎo)劑（tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis，TWEAK）是近年發(fā)現(xiàn)的一種新的炎性細(xì)胞因子[2]。在AS的研究中發(fā)現(xiàn)其與動(dòng)脈內(nèi)皮功能失調(diào)、平滑肌細(xì)胞增殖遷移、粥樣斑塊慢性炎癥反應(yīng)及斑塊的不穩(wěn)定性有關(guān)[2]。血凝集素樣氧化型低密度脂蛋白受體-1（lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1，LOX-1）是氧化修飾低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）在內(nèi)皮細(xì)胞的特異性受體，對(duì)AS的進(jìn)展起促進(jìn)作用[3]。本研究旨在探討TWEAK對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）上LOX-1表達(dá)的影響，以及阿托伐他汀對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的抗炎作用，為進(jìn)一步研究TWEAK在AS中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及處理 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株（購(gòu)于無錫菩禾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司）培養(yǎng)于含10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（購(gòu)自杭州四季青生物材料有限公司）、10 000 μ/ml青霉素、10 000 μg/ml鏈霉素的1640培養(yǎng)液（購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司）中，放置于含5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3天用0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）消化細(xì)胞并傳代。待細(xì)胞融合時(shí)制成單細(xì)胞懸液，稀釋到1×106/mm3細(xì)胞數(shù)接種于6孔培養(yǎng)板中，次日待細(xì)胞貼壁后再用無血清1640培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h使細(xì)胞進(jìn)入休眠期，然后進(jìn)行干預(yù)。

1.2 主要試劑的配制 TWEAK工作液的配制：將TWEAK（購(gòu)自PeproTech公司）25 μg溶于250 μl的磷酸鹽緩存液（pH 7.5）中，即配制成0.1 mg/L濃度的工作液；再用1640培養(yǎng)液將工作液稀釋成需要濃度（為0、5、25、50 μl TWEAK工作液/50 ml 1640培養(yǎng)液）。阿托伐他汀原液的配制：阿托伐他汀原藥6 mg（購(gòu)自輝瑞制藥有限公司）用100%乙醇溶液0.5 ml溶解，再經(jīng)磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）稀釋至5 ml，即配制成1 mmol/L的溶液，根據(jù)所需濃度稀釋不同倍數(shù)（為10、50、100 μl阿托伐他汀原液/50 ml 1640培養(yǎng)液）。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 ①空白對(duì)照組：僅加入1640培養(yǎng)基2 ml。②TWEAK組：10 ng/ml組：加入終濃度為10 ng/ml TWEAK培養(yǎng)基混合液2 ml；50 ng/ml組：加入終濃度為50 ng/ml TWEAK培養(yǎng)基混合液2 ml；100 ng/ml組：加入終濃度為100 ng/ml TWEAK培養(yǎng)基混合液2 ml。③阿托伐他汀組：各組預(yù)先給予終濃度為0.2、1、10 μmol/L的阿托伐他汀培養(yǎng)基混合液2 ml，干預(yù)24 h，再加入100 ng/ml TWEAK干預(yù)24 h。各組細(xì)胞均孵育24 h后終止實(shí)驗(yàn)，收集細(xì)胞培養(yǎng)液離心15 min，取上清液并胰酶消化細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA。

1.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 采用熒光倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。

1.5 RT-PCR反應(yīng) 采用Trizol試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR循環(huán)。引物（購(gòu)自上海生工生物工程公司）序列：LOX-1上游引物5'-GCTTCACAGGAGTCAGAAAACG-3'，下游引物5'-TGAGCCCGAGGAAAATAGGT-3'；擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度207 bp。采用β-action為內(nèi)參照，上游引物5'-TAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3'，下游引物5'-TCACCTTCACCGTTCCAGTTT-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)151 bp。擴(kuò)增條件：95℃變性3 min，95℃解鏈7 s，57℃退火10 s，72℃延伸15 s，40個(gè)循環(huán)；結(jié)束反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，凝膠成像系統(tǒng)照相，由計(jì)算機(jī)自動(dòng)計(jì)算得出Ct值，用2-△△Ct方法進(jìn)行計(jì)算。

1.6 ELLSA測(cè)定 酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定細(xì)胞上清液中LOX-1含量（試劑盒購(gòu)自Bia-Swamp公司）。收集每組細(xì)胞液離心取上清液40 μl加入酶標(biāo)板中，再加生物素標(biāo)記的LOX-1抗體10 μl，并進(jìn)行溫育洗滌加酶等步驟，最終在酶標(biāo)儀上進(jìn)行吸光度檢測(cè)。以光密度（optical density，OD）值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品的OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出樣品LOX-1的濃度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取均值。對(duì)計(jì)量資料進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，正態(tài)分布計(jì)量資料以表示，多組間正態(tài)分布計(jì)量資料的比較和兩兩比較采用方差分析用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 HUVECs的形態(tài)學(xué)觀察 在倒置顯微鏡下觀察貼壁前細(xì)胞呈圓形或類圓形，單個(gè)或成團(tuán)存在。約2 h后開始貼壁生長(zhǎng)。貼壁后，呈梭形及多角不規(guī)則形的單層細(xì)胞集落。細(xì)胞透光性強(qiáng)，邊緣模糊，可見核及顆粒，呈典型鋪路石樣生長(zhǎng)（圖1）。無血清培養(yǎng)基孵育24 h后，形態(tài)無明顯變化。干預(yù)24 h后，只有TWEAK（100 ng/ml）組有細(xì)胞回縮，部分細(xì)胞脫落（圖2）。其余各組細(xì)胞形態(tài)無明顯變化。提示過高濃度TWEAK可能對(duì)細(xì)胞有損傷。

圖1 未加干預(yù)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）形態(tài)（×10）

圖2 腫瘤壞死因子樣凋亡弱誘導(dǎo)劑（TWEAK）100 ng/ml組HUVECs形態(tài)（×10）

2.2 TWEAK以及阿托伐他汀預(yù)先干預(yù)后各組細(xì)胞LOX-1 mRNA的表達(dá) 在培養(yǎng)的HUVECs中加入不同濃度的TWEAK（0、10、50、100 ng/ml）培養(yǎng)24 h，PCR結(jié)果表明，各組2-△△Ct值分別為（0.883±0.195）、（1.123±0.275）、（1.610±0.291）、（2.180±0.437）；與空白對(duì)照組相比，10 ng/ml TWEAK干預(yù)組LOX-1 mRNA的表達(dá)增加，差異有顯著性（P＜0.001）；隨著TWEAK濃度的增加LOX-1 mRNA表達(dá)增加，在10、50、100 ng/ml TWEAK組間比較，差異有顯著性（P＜0.001）。不同濃度阿托伐他?。ńK濃度為0.2、1、10 μmol/L）干預(yù)后各LOX-1 mRNA 2-△△Ct值分別為（1.430±0.328）、（1.236±0.248）、（1.091±0.218）；與100 ng/ml TWEAK組比較，0.2 μmol/L阿托伐他汀干預(yù)組LOX-1表達(dá)下降，差異有顯著性（P＜0.001）；且隨著阿托伐他汀濃度的增加LOX-1表達(dá)下調(diào)，不同濃度組間比較，差異有顯著性（P＜0.001）（圖3）。

2.3 TWEAK以及阿托伐他汀預(yù)先干預(yù)后細(xì)胞上清液中LOX-1蛋白量的表達(dá) 同空白對(duì)照組相比，給予10 ng/ml TWEAK 24 h后，細(xì)胞上清液中LOX-1蛋白濃度有所升高，差異有顯著性（P＜0.001）；不同濃度TWEAK干預(yù)組兩兩組間比較，差異均有顯著性（P＜0.001）；同100 ng/ml TWEAK組相比，0.2 μmol/L阿托伐他干預(yù)后，再用100 ng/ml TWEAK培育，細(xì)胞上清液中LOX-1表達(dá)有所下調(diào)，差異有顯著性（P＜0.001）；不同濃度阿托伐他汀干預(yù)組組間LOX-1蛋白表達(dá)水平比較，差異有顯著性（P＜0.001）（表1）。

表1 細(xì)胞培養(yǎng)液中的LOX-1蛋白表達(dá)水平（±s）

表1 細(xì)胞培養(yǎng)液中的LOX-1蛋白表達(dá)水平（±s）

注：a：與對(duì)照組比較，P＜0.001；b：不同濃度組組間比較，P＜0.001

圖3 熒光定量PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果：各組細(xì)胞LOX-1 mRNA在207 bp處出現(xiàn)熒光條帶

3 討論

AS是一種多因素疾病，其特征是慢性炎癥和過度的細(xì)胞增殖。有研究表明TWEAK/Fn14軸參與了動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的啟動(dòng)、進(jìn)展、破裂和隨后的血栓形成過程。TWEAK可表達(dá)于正常和病理血管壁，但其受體成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)早期反應(yīng)蛋白14（fibroblast growth factor-inducible 14，F(xiàn)n14）在健康的動(dòng)脈壁幾乎不表達(dá)，而在頸動(dòng)脈、股動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中高表達(dá)[4-6]。以往研究提示，AS患者頸動(dòng)脈可溶性釋放減少，且動(dòng)脈粥樣斑塊中可見TWEAK和巨噬細(xì)胞、增殖的平滑肌細(xì)胞伴隨出現(xiàn)[7]?？扇苄訲WEAK與其受體Fn14結(jié)合后還可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖。本研究可看到，過高濃度的TWEAK組可出現(xiàn)細(xì)胞脫落。

此外，TWEAK/Fn14相互作用可誘導(dǎo)黏附分子和趨化因子在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)，TWEAK可誘導(dǎo)白介素-6（interleukin-6，IL-6）、IL-8（interleukin-8）、單核細(xì)胞趨化蛋白（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）及基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）等在AS中起重要作用的炎癥介質(zhì)的表達(dá)[8]。已有報(bào)道顯示TWEAK可調(diào)節(jié)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞的大小，這一發(fā)現(xiàn)與TWEAK可調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞攝取脂質(zhì)能力有關(guān)[9]。LOX-1是E類清道夫受體，可介導(dǎo)血管細(xì)胞攝取氧化低密度脂蛋白，最早在內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)[10]。LOX-1能促使巨噬細(xì)胞攝取ox-LDL，其在AS中扮演重要角色。本研究證明正常體外培養(yǎng)的HUVECs細(xì)胞有少量LOX-1的表達(dá)。而許多炎性因子可刺激內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞表達(dá)LOX-1，如IL-1、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等炎性因子能上調(diào)平滑肌細(xì)胞LOX-1的表達(dá)[11]。這些炎性因子可通過上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞中LOX-1的表達(dá)，進(jìn)一步增加細(xì)胞攝取ox-LDL，誘導(dǎo)形成泡沫細(xì)胞。本研究結(jié)果顯示TWEAK可上調(diào)LOX-1 mRNA及蛋白的表達(dá)，且隨TWEAK刺激濃度增加LOX-1表達(dá)量也隨之增加，具有一定的濃度依賴性。

阿托伐他汀是一種羥甲基戊二酸單酰輔酶A（HMG-CoA）還原酶抑制劑，除可降低血清膽固醇外，還包括調(diào)節(jié)內(nèi)皮功能障礙，抑制炎癥反應(yīng)，抗氧化作用，穩(wěn)定斑塊和抗血栓作用等[12]。既往研究發(fā)現(xiàn)他汀類藥物能下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞多種炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，包括IL-1、IL-6、TNF-α、TNF-β等[13]，且這些細(xì)胞因子的表達(dá)都受到核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）的調(diào)控。而TWEAK/Fn14可激活NF-κB細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑，繼發(fā)性激活各種炎性細(xì)胞因子[14]。本實(shí)驗(yàn)顯示最低濃度的阿托伐他汀對(duì)TWEAK引起的LOX-1表達(dá)有下調(diào)作用，隨著濃度的增高表現(xiàn)出較好的調(diào)節(jié)作用。由此推斷，TWEAK可能通過NF-κB信號(hào)路徑參與了AS的進(jìn)展，其通過上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞中LOX-1的表達(dá)，促使其攝取ox-LDL，加速動(dòng)脈粥樣硬化，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣斑塊形成。阿托伐他汀能夠抑制NF-κB活性，抑制炎性因子作用，起到抗炎效應(yīng)。他汀類藥物還可下調(diào)Fn14的表達(dá)，降低Fn14與其受體TWEAK結(jié)合所致的促炎應(yīng)答效應(yīng)[15]。在動(dòng)脈粥樣硬化的治療方面抑制TWEAK在血管內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)可能是一種新的治療策略。同時(shí)本研究尚存在一些不足：①缺乏阿托伐他汀抗炎效應(yīng)的陽性對(duì)照組；②沒有運(yùn)用蛋白質(zhì)印記法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)LOX-1蛋白的表達(dá)情況。因此，有待進(jìn)一步研究。

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