顧小花，徐俊，程欣欣，張巧全，時(shí)建銓

腦出血是威脅人類生命健康與安全的突發(fā)腦血管事件，而自發(fā)性腦出血又多在非外傷情況下出現(xiàn)，是無明顯誘因的腦大、小動(dòng)脈，靜脈和毛細(xì)血管自發(fā)性破裂引起的腦內(nèi)出血。自發(fā)性腦出血是一種多因素疾病，受環(huán)境和遺傳因素等多種因素共同作用，而腦淀粉樣血管病（cerebral amyloid angiopathy，CAA）是其重要的致病因素之一，發(fā)病率與年齡呈正相關(guān)。與CAA相關(guān)的免疫病理機(jī)制改變有多種，而由晚期糖基化終產(chǎn)物受體（receptor for advanced glycation end products，RAGE）、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1（low-density lipoprotein receptor related protein-1，LRP1）參與的β-淀粉樣蛋白（amyloid β，Aβ）的轉(zhuǎn)運(yùn)異常使大腦中Aβ聚集是否為其可能的病理機(jī)制，目前尚無確切結(jié)論。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 入組患者為2010-2011年因腦出血急診就診本院神經(jīng)外科，并于發(fā)病72 h內(nèi)行手術(shù)治療的患者，共46例，其中男27例，女19例，年齡31～81歲，平均（56±15）歲。所有患者入院后均行顱腦計(jì)算機(jī)斷層掃描（computed tomography，CT）/磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）、計(jì)算機(jī)斷層掃描血管造影（computed tomography angiography，CTA）檢查證實(shí)為自發(fā)性顱內(nèi)出血，且排除外傷、動(dòng)脈瘤、動(dòng)靜脈畸形、煙霧病、腫瘤等可能，患者無明確的抗凝及抗血小板聚集等相關(guān)藥物使用史，無明確的血液系統(tǒng)疾病史?；颊呷朐汉缶晟葡嚓P(guān)術(shù)前檢查，明確無明顯的手術(shù)禁忌，急診行手術(shù)治療，均給予“去骨瓣減壓+血腫清除術(shù)”治療，術(shù)后24 h復(fù)查頭顱CT血腫清除均較理想，術(shù)中留取血腫組織及腦組織碎片用作病理學(xué)檢查。

1.2 研究方法 用免疫熒光技術(shù)對(duì)腦組織切片進(jìn)行染色，先采用硫黃素T染色，在顯微鏡下觀測，得出ICH患者的皮層腦組織Aβ的表達(dá)情況，再采用CD34（兔抗人CD34抗體，武漢博士德生物工程有限公司，1∶1000）染色確定Aβ沉積的部位為血管壁，根據(jù)波士頓診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]，陽性者即硫黃素與CD34均強(qiáng)染則確診為CAA，陰性者即硫黃素未被染上者則確診為非CAA，分別將陽性與陰性者分為CAA-ICH組與非CAA-ICH組，進(jìn)行免疫熒光染色檢測LRP1與RAGE的表達(dá)情況。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)不重疊40倍視野，采用Image J分析軟件，分別計(jì)算每視野的LRPl和RAGE的平均灰度值，進(jìn)而求出每例標(biāo)本的平均灰度值。用平均灰度值代表LRPl和RAGE的表達(dá)水平。陽性區(qū)表達(dá)的強(qiáng)弱和灰度值呈正相關(guān)，灰度值越大則陽性表達(dá)越強(qiáng)，灰度值越小則陽性表達(dá)越弱。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料如符合正態(tài)分布采用（表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)量資料如不符合正態(tài)分布，采用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示，兩組間比較用Kruskal-Wallis H秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用頻數(shù)或百分位數(shù)表示，組間比較用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法，P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料結(jié)果 本研究納入的46例ICH腦組織樣本中，確診為CAA者為8例（其中男5例，女3例），占總數(shù)的17.39%，非CAA-ICH組共38例（其中男22例，女16例），CAA-ICH組與非CAA-ICH組患者一般資料比較及CAA-ICH組8例患者的基本資料分別見表1、表2。

本研究納入的46例ICH腦組織樣本中，確診為CAA者為8例，患者腦組織標(biāo)本CD34／硫黃素T雙重?zé)晒馊旧妶D1。

2.2 腦組織中LRPl和RAGE的表達(dá)情況 本研究納入的46例ICH腦組織樣本中，確診為CAA的8例患者腦組織標(biāo)本均有Aβ、RAGE、LRP1蛋白的共表達(dá)（陽性率100%），而在非CAA自發(fā)性腦出血患者中均無共表達(dá)。CAA患者腦組織標(biāo)本LRP1/硫黃素T及RAGE/硫黃素T雙重?zé)晒馊旧妶D2。

2.3 LRPl和RAGE在腦組織中的表達(dá)水平 兩組腦組織標(biāo)本中LRPl和RAGE的表達(dá)水平比較見表3，CAA-ICH組的LRP1表達(dá)水平較非CAA-ICH組顯著降低（P=0.031），CAA-ICH組的RAGE表達(dá)水平較非CAA-ICH組顯著升高（P=0.015），比較結(jié)果見圖3。

表1 CAA-ICH組與非CAA-ICH組一般資料比較

表2 CAA-ICH組患者基本資料

圖1 1例腦淀粉樣血管病患者腦組織標(biāo)本CD34/硫黃素T雙重?zé)晒馊旧?/p>

圖2 1例腦淀粉樣血管病患者腦組織標(biāo)本LRP1/硫黃素T及RAGE/硫黃素T雙重?zé)晒馊旧?/p>

3 討論

CAA是老年人常見的腦小血管病，通常分為散發(fā)性CAA和家族性CAA，散發(fā)性CAA病因不明，主要是由不可溶的Aβ和其他淀粉樣肽在軟腦膜和皮質(zhì)的動(dòng)脈、微動(dòng)脈和毛細(xì)血管壁的沉積，從而表現(xiàn)出一些臨床和病理特征[2]。目前研究認(rèn)為，CAA出血部位常在枕葉、顳葉后部或額葉的表淺部位，枕葉是CAA-ICH的特征性部位。本研究中，CAA相關(guān)腦葉出血多分布在頂、顳、枕、額葉，較少累及基底節(jié)。部分患者合并高血壓，考慮高血壓可能是CAAICH的促發(fā)因素，或是再發(fā)出血的誘導(dǎo)因素。目前研究認(rèn)為，高血壓可以加重CAA相關(guān)血管病變，尤其是纖維素樣壞死，從而導(dǎo)致CAA-ICH。在尸檢證實(shí)的CAA-ICH患者中，高血壓的患病率顯著高于不伴有ICH的CAA，進(jìn)一步提示高血壓與CAA-ICH密切相關(guān)。CAA好發(fā)于老年人（家族性CAA除外），其發(fā)病率及嚴(yán)重程度均隨年齡增長而顯著增加，女性發(fā)病率略高于男性[3]，本研究中，CAA-ICH患者主要集中于60歲以上老年人，男女發(fā)病率無明顯差異。

表3 兩組腦組織標(biāo)本中LRPl和RAGE的表達(dá)水平比較（M，P25-P75）

圖3 CAA-ICH組與非CAA-ICH組LRP1、RAGE平均灰度比較的箱式圖

CAA目前病因尚不清楚，主要病理特征是Aβ在腦內(nèi)的異常聚積。Aβ由分泌酶水解β淀粉樣前體蛋白（β-amyloid precursor protein，APP）產(chǎn)生，其代謝異常造成的Aβ片段聚集沉積引發(fā)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)是CAA的主要致病原因。在正常狀態(tài)下，Aβ可恒定地被分解、去除，在腦實(shí)質(zhì)中僅以可溶狀態(tài)微量存在。腦內(nèi)Aβ水平通過兩種途徑維持平衡：第一種途徑是Aβ的生成和降解，β、γ分泌酶參與Aβ的生成，而腦啡肽酶、胰島素降解酶參與Aβ的降解；第二個(gè)平衡是Aβ通過血腦屏障（blood brain barrier，BBB）的內(nèi)向與外向轉(zhuǎn)運(yùn)，存在于BBB上的LRP1與RAGE受體是一對(duì)作用相反的Aβ跨BBB轉(zhuǎn)運(yùn)體，大腦對(duì)Aβ的清除能力可能取決于兩者運(yùn)輸Aβ量的代數(shù)和[4]。各種原因使Aβ代謝平衡破壞，即變成高度不溶性的β淀粉樣蛋白沉著在細(xì)胞間，加上變性的神經(jīng)細(xì)胞突起和反應(yīng)性神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞形成斑塊，Aβ沉積在血管壁引起CAA。

本研究的著力點(diǎn)在于Aβ的第二條代謝途徑，LRP1是一種細(xì)胞表面蛋白，主要表達(dá)在血管壁上，特別是血管平滑肌細(xì)胞中，因含有與低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）受體相同的重復(fù)序列，故稱LRP1。近年相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，特定條件敲除血管平滑肌細(xì)胞中LRP1的APP/PS1小鼠，Aβ積累加劇[5]。既往研究表明，LRP1介導(dǎo)Aβ從腦內(nèi)進(jìn)入外周血液循環(huán)，Aβ和LRP1之間相互結(jié)合，以內(nèi)吞或胞飲作用通過BBB進(jìn)入外周血液，LRP1障礙導(dǎo)致Aβ的外流降低，因而使Aβ在腦中沉積增加[6]。本研究也發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于非CAA-ICH組，CAAICH組中LRP1表達(dá)水平顯著減低。RAGE為細(xì)胞表面免疫球蛋白超家族中的一員，由404個(gè)氨基酸組成，人類表達(dá)RAGE蛋白的基因位于第6號(hào)染色體的短臂上，特點(diǎn)是維持與組織中配體的并置，其可在納摩爾（nmol）水平結(jié)合可溶的Aβ，介導(dǎo)外周血液中的Aβ通過BBB進(jìn)入腦內(nèi)，RAGE的下調(diào)能抑制Aβ的內(nèi)流。與富含Aβ環(huán)境中觀察到的LRP1抑制相反，過度的Aβ數(shù)量通過陽性負(fù)反饋機(jī)制上調(diào)RAGE的表達(dá)[7]。在CAA患者的腦組織中，Aβ與小膠質(zhì)細(xì)胞的RAGE結(jié)合，促使小膠質(zhì)細(xì)胞向淀粉樣斑塊遷移、增殖，激活NF-κB并分泌巨噬細(xì)胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor，M-CSF），引起炎癥反應(yīng)。由于RAGE與Aβ相互作用，受體表達(dá)增加，使RAGE介導(dǎo)的Aβ內(nèi)流增加，導(dǎo)致Aβ異常聚積[7-8]。本組研究中，測出RAGE在CAA-ICH組中表達(dá)顯著升高，表明在CAA-ICH組患者中，Aβ上調(diào)RAGE表達(dá)增加，導(dǎo)致Aβ從腦小血管向腦實(shí)質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)/沉積增多。綜上所述，CAA-ICH組患者的LRP1表達(dá)降低，RAGE表達(dá)升高可能導(dǎo)致Aβ的轉(zhuǎn)運(yùn)異常，從而促進(jìn)了CAA的形成。

CAA中Aβ沉積導(dǎo)致血管破裂的確切發(fā)病機(jī)制尚不清楚，有研究發(fā)現(xiàn)，與不伴有ICH的CAA相比，CAA-ICH患者常存在CAA血管病變合并癥，這可能與出血的易感性有關(guān)。這些合并癥包括微小動(dòng)脈瘤膨脹擴(kuò)張，纖維素樣壞死，血管壁的同心樣分裂（“雙管”樣表現(xiàn)），微量出血；在少數(shù)病例中，可見血管閉塞和血管炎[9]。因此可能的機(jī)制為：Aβ在血管壁迅速整合、聚集，導(dǎo)致細(xì)胞骨架松散，甚至發(fā)生崩解，細(xì)胞出現(xiàn)的損傷、水腫，細(xì)胞膜的膽固醇和脂質(zhì)的流動(dòng)性減弱[10]，引起血管內(nèi)彈力層破裂受損、纖維素樣壞死，血管脆性增加，形成微動(dòng)脈瘤，最終導(dǎo)致破裂自發(fā)性的出血。目前引起LRP1、RAGE異常表達(dá)的原因尚不明確，而LRP1、RAGE對(duì)腦淀粉樣變性程度與腦出血的相關(guān)性需進(jìn)一步探討。

CAA的發(fā)病率被顯著低估。典型的CAA相關(guān)性出血發(fā)生在腦葉區(qū)域，經(jīng)常破入蛛網(wǎng)膜下腔，并經(jīng)常發(fā)生在夜間。而高血壓性腦出血通常在日間活動(dòng)時(shí)發(fā)生，好發(fā)于腦深部。一般合并認(rèn)知功能減退的老年人，出現(xiàn)非外傷性、非高血壓性出血，同時(shí)影像學(xué)提示腦表淺部位出血特別是多發(fā)腦葉出血的患者，應(yīng)該考慮到本病。梯度回波磁共振成像及磁敏感加權(quán)序列可被應(yīng)用于檢測無癥狀性腦微出血（該疾病典型特征），為活體診斷可疑CAA提供了依據(jù)，顯著提高了CAA的檢出率[11-12]。本研究提示CAA是ICH的重要病因之一，CAA相關(guān)的免疫-血管因子RAGE、LRP1蛋白異常表達(dá)，在ICH發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。不足之處在于樣本數(shù)量較少，需要大樣本的研究進(jìn)行驗(yàn)證。

1 Charidimou A，Martinez-Ramirez S，Reijmer YD，et al. Total magnetic resonance imaging burden of small vessel disease in cerebral amyloid angiopathy：An imaging-pathologic study of concept validation[J].JAMA Neurol，2016 Jun 27.

2 Yamada M. Cerebral amyloid angiopathy：emerging concepts[J]. J Stroke，2015，17：17-30.

3 Yamada M. Risk factors for cerebral amyloid angiopathy in the elderly[J]. Ann N Y Acad Sci，2002，977：37-44.

4 莊志清，閆福嶺. 慢性低氧對(duì)小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)RAGE和LRP-1表達(dá)的影響[J]. 中華腦血管病雜志(電子版)，2009，3：4-8.

5 Kanekiyo T，Liu CC，Shinohara M，et al. LRP1 in brain vascular smooth muscle cells mediates local clearance of Alzheimer's amyloid-β[J]. J Neurosci，2012，32：16458-16465.

6 施詠梅，張志珺. 低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白與Alzheimer病[J]. 中華腦血管雜志(電子版)，2007，1：138-142.

7 Cai Z，Liu N，Wang C，et al. Role of RAGE in Alzheimer's disease[J]. Cell Mol Neurobiol，2016，36：483-495.

8 Yan SS，Chen D，Yan S，et al. RAGE is a key cellular target for Abeta-induced perturbation in Alzheimer's disease[J]. Front Biosci (Schol Ed)，2012，4：240-250.

9 李曉秋，韓雅玲，陳會(huì)生. 10例淀粉樣腦血管病相關(guān)腦葉出血的臨床病理分析[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2015，40：530-534.

10 唐亞娟，趙繼宗，李永，等. 自發(fā)性腦出血與淀粉樣腦血管病相關(guān)性研究[J]. 中華醫(yī)學(xué)雜志，2010，90：1016-1019.

11 張楚楚，孫永安，程欣欣，等. 磁敏感成像對(duì)腦淀粉樣血管病導(dǎo)致腦出血的診斷價(jià)值探討[J]. 中華老年心腦血管病雜志，2013，15：1253-1256.

12 Auriel E，Charidimou A，Gurol ME，et al. Validation of clinicoradiological criteria for the diagnosis of cerebral amyloid angiopathy-related in fl ammation[J].JAMA Neurol，2016，73:197-202.