謝偉玲， 柴勝豐， 蔣運生， 唐健民， 鄒 蓉， 韋 霄

（1.廣西喀斯特植物保育與恢復(fù)生態(tài)學(xué)重點實驗室，廣西壯族自治區(qū)中國科學(xué)院廣西植物研究所， 桂林541006；2.廣西師范大學(xué)生命科學(xué)院， 桂林541004）

黃枝油杉（Keteleeria calcarea Cheng et L.K.Fu）系松科（Pinaceae）油杉屬（Keteleeria）常綠喬木［1］，是我國特有的珍稀瀕危樹種、國家三級保護植物［2］，主要分布于我國貴州南部、廣西北部和湖南江永縣等地。因其樹形美觀、耐干旱，可用于庭院和石山綠化；樹干通直、木材堅硬，可用于造船、建筑和家具等［3］，具有較高的研究價值和實用性。

ISSR是基于PCR技術(shù)、以簡單重復(fù)序列為引物的一種分子標記技術(shù)，1994年由Zietkiewicz等［4］提出，具有多態(tài)性水平高、產(chǎn)物特異性強、DNA用量少以及穩(wěn)定性好等優(yōu)點。已廣泛應(yīng)用于構(gòu)建遺傳圖譜、植物品種鑒定、遺傳多樣性和親緣關(guān)系以及基因定位等方面的研究［5－7］。

雖然ISSR分子標記技術(shù)原理簡單，但不同的物種適合的反應(yīng)條件不同。因此，在對黃枝油杉進行ISSR分析之前，首先要優(yōu)化ISSR－PCR反應(yīng)條件和程序。本試驗先運用正交設(shè)計進行初步篩選，再用單因素設(shè)計逐一優(yōu)化對ISSR－PCR擴增效果有影響的Mg2＋、Taq DNA 聚合酶、dNTP、引物、模板 DNA、循環(huán)次數(shù)及退火溫度。建立了黃枝油杉的最佳反應(yīng)體系和程序，為進一步研究黃枝油杉種群的遺傳多樣性奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

2014年9月至12月，分別在桂林臨桂縣沉橋村（L）、桂林恭城縣三江鄉(xiāng)（G）、賀州富川縣櫟尾村（F）、柳州融水縣都木（R）、河池南丹縣里湖鄉(xiāng)（N）、貴州平塘縣者密鎮(zhèn)（P）、貴州獨山縣堯棒鄉(xiāng)（D）共7個黃枝油杉分布地采集生長良好的、健康的黃枝油杉葉片，硅膠干燥保存。樣品經(jīng)廣西植物研究所蔣運生研究員鑒定。

1.2 試劑與儀器

ISSR－PCR 引物（引物855序列為：ACA CAC ACA CAC ACA CYT，Y＝C，T）、Mg2＋、dNTP、Taq DNA聚合酶、10×PCR buffer、DNA Marker S（生工生物工程（上海）股份有限公司）；PCR儀（美國BIORAD伯樂公司，Model：PTC－200）；NanoDrop 2000c超微量分光光度計（賽默飛世爾科技）；CDYY－6C型電泳儀（北京市六一儀器廠）；UVP凝膠成像系統(tǒng)；離心機（珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司）；DYCP－34型電泳槽（北京市六一儀器廠）。

1.3 方 法

1.3.1 黃枝油杉總DNA的提取

采用CTAB法提取黃枝油杉的總DNA，但在水浴前用－20℃預(yù)冷的丙酮洗2次［8］。用濃度為0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢驗DNA的質(zhì)量和完整性，DNA的純度和濃度用NanoDrop 2000c超微量分光光度計檢測，存儲在－20℃冰箱備用。

1.3.2 ISSR－PCR反應(yīng)體系正交試驗

用正交試驗設(shè)計（L16（45））來初步確定各因素之間擴增效果較好的水平組合，研究的5個因素分別為Mg2＋、Taq DNA 聚合酶、dNTP、引物、模板 DNA，每個因素設(shè)定4個梯度的濃度，具體見表1、表2。除表中的5個因素及其不同的濃度外，每個體系還含有2.5 μL 10×PCR buffer，其余的用滅菌的ddH2O補夠25 μL，每個處理設(shè)置3次重復(fù)，選用引物855（序列為ACA CAC ACA CAC ACA CYT，Y＝C，T）。

預(yù)擴增程序為94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，50℃退火45s，72℃延伸90s，以上3個步驟循環(huán)40次；最后72℃延伸7min。PCR擴增產(chǎn)物用濃度為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳1～1.5h，溴化乙錠（0.5μg／mL）染色20min，用UVP凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。

表1 ISSR－PCR反應(yīng)體系正交試驗的各因素與水平

表2 ISSR－PCR正交試驗L16（45）

1.3.3 ISSR－PCR反應(yīng)體系單因素試驗

根據(jù)正交試驗的結(jié)果初步選出擴增條帶最清晰的組合進行單因素試驗，以該組合為基礎(chǔ)，改變其中一個因素的濃度（改變的濃度采用相應(yīng)因素設(shè)定的6個梯度濃度），而其他因素及其濃度不變，每一個因素確定最佳濃度后，以該最佳濃度進行下一步研究，直到所有因素的最佳濃度被確定。每個因素設(shè)定6個梯度濃度，Mg2＋濃 度 為 3.0，2.5，2.0，1.5，1.0，0.5mmol／L；Taq DNA 聚合酶濃度為2.5，2.0，1.5，1.0，0.5，0.25U／25μL；dNTP 為 0.30，0.25，0.20，0.15，0.10，0.05 mmol／L；引物為1.4，1.2，1.0，0.8，0.6，0.4μmol／L；模板DNA為90，70，50，30，10，5ng。每個處理至少重復(fù)2次。

1.3.4 優(yōu)化ISSR－PCR反應(yīng)程序

通過正交試驗和單因素試驗確定反應(yīng)體系后，優(yōu)化退火溫度及循環(huán)次數(shù)。退火溫度的設(shè)定范圍為引物的理論退火溫度的正負5℃，如（51±5）℃，PCR儀便會自動形成12個溫度：56.0，55.7，55.0，54.0，52.8，51.6，50.4，49.2，48.0，47.0，46.3，46.0 ℃；循 環(huán) 次 數(shù) 設(shè)為50、45、40、35、30、25次。以上每個處理至少重復(fù)2次。

1.3.5 驗證反應(yīng)體系和程序

從黃枝油杉的每個居群中隨機選取2個個體的DNA樣品，用已確定的反應(yīng)體系及程序進行擴增，檢驗擴增效果的好壞及其穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR－PCR正交試驗結(jié)果

ISSR－PCR正交試驗結(jié)果見圖1。如圖1所示，組合1、2、5、6、13、16擴增條帶少，且強度弱；組合3、4、7擴增出來的條帶強度弱，而且背景模糊；雖然組合8、9、10、12、14、15的條帶較多，但強度弱，而且背景模糊，彌散難辨；組合11擴增出來的條帶多且效果好，背景清晰，條帶清晰可辨。故選用組合11進行下一步研究。即25μL的反應(yīng)體系中含有 Mg2＋1.0mmol／L、Taq DNA 聚合酶1.0U／25μL、dNTP 0.2mmol／L、引物1.0μmol／L、模板DNA 70ng。

圖1 ISSR－PCR正交試驗結(jié)果

2.2 Mg2＋濃度與ISSR－PCR擴增效果的關(guān)系

Taq DNA聚合酶在PCR反應(yīng)中的作用可直接受Mg2＋濃度的影響，而且非常敏感［9］。如圖2所示，組合1～3（Mg2＋0.5～1.5mmol／L）幾乎沒有擴增產(chǎn)物；隨著Mg2＋濃度升高，條帶數(shù)量和清晰度先是增加，后下降；當Mg2＋的濃度為2.0mmol／L時擴增出來的條帶最多，也最清晰，擴增效果最好，故選擇2.0mmol／L的Mg2＋濃度進行下一步研究。

圖2 不同Mg2＋濃度的ISSR－PCR擴增結(jié)果

2.3 dNTP濃度與ISSR－PCR擴增效果的關(guān)系

底物dNTP濃度過高，會導(dǎo)致聚合酶錯誤摻入，濃度過低，產(chǎn)物合成率低［10］。如圖3所示，每個處理都可以擴增出條帶，但dNTP濃度過高或過低的擴增條帶數(shù)量少而且強度弱，隨著dNTP濃度的逐漸升高，條帶的清晰程度與數(shù)量呈現(xiàn)先升后降的趨勢。濃度為0.10mmol／L時效果最好，故選擇0.10mmol／L為dNTP的最佳濃度。

圖3 不同dNTP濃度的ISSR－PCR擴增結(jié)果

2.4 Taq DNA聚合酶用量與ISSR－PCR擴增效果的關(guān)系

Taq DNA聚合酶用量過多，容易擴增出非特異性產(chǎn)物，而且成本高；但用量過少又會導(dǎo)致產(chǎn)物合成效率降低［10］。如圖4所示，25μL體系中，Taq DNA 聚合酶用量為0.25～1.0U時，幾乎沒有擴增產(chǎn)物；Taq DNA聚合酶用量大于2.0U時，擴增條帶少，背景模糊；故選擇1.5UTaq DNA聚合酶為最佳用量。

2.5 引物濃度與ISSR－PCR擴增效果的關(guān)系

引物濃度過低，擴增產(chǎn)物少；而濃度過高時，不僅成本較高，而且容易形成引物二聚體［11］。如圖5所示，每個處理均有擴增產(chǎn)物，引物濃度逐漸增加，擴增條帶的數(shù)目先逐漸增加后減少。引物濃度為0.4，0.6，0.8，1.4μmol／L時，擴增條帶少；當引物的濃度為1.0，1.2μmol／L時，雖然擴增出來的條帶數(shù)目相同，但前者的條帶和背景都較后者的清晰。故而選擇1.0 μmol／L的引物濃度繼續(xù)下一步研究。

圖4 不同Taq DNA聚合酶用量的ISSR－PCR擴增結(jié)果

圖5 不同引物濃度的ISSR－PCR擴增結(jié)果

圖6 不同模板DNA濃度的ISSR－PCR擴增結(jié)果

2.6 模板DNA濃度與ISSR－PCR擴增效果的關(guān)系

過低含量的模板DNA，沒有擴增產(chǎn)物或擴增產(chǎn)物不穩(wěn)定；模板含量過高，非特異性產(chǎn)物合成率增加［12］。如圖6所示，除10ng／25μL沒有擴增產(chǎn)物外，其余處理均有擴增產(chǎn)物。處理1、處理5、處理6（5，70，90ng／25μL）擴增條帶較少，強度較弱；處理3、處理4（30，50 ng／25μL）擴增效果相當，選擇30ng／25μL為模板DNA最佳濃度。

2.7 循環(huán)次數(shù)與ISSR－PCR擴增效果的關(guān)系

如圖7所示，PCR擴增反應(yīng)循環(huán)25次時，沒有擴增產(chǎn)物或擴增產(chǎn)物的量很少，導(dǎo)致檢測不出來；當循環(huán)次數(shù)為30、35、40、45時，擴增產(chǎn)物的量較少，而且擴增條帶少，強度弱；當循環(huán)次數(shù)為50次時，擴增產(chǎn)物的量足夠，擴增條帶數(shù)目較多，故選擇50次為最佳循環(huán)次數(shù)。

2.8 引物的退火溫度與ISSR－PCR擴增效果的關(guān)系

如圖8所示，過低或過高的引物退火溫度擴增出來的條帶數(shù)量都較少，而且條帶強度弱，背景模糊；退火溫度為50.4℃時，擴增條帶最多，主帶明顯，副帶清晰。故選擇50.4℃為該引物的最適退火溫度。同樣地，通過溫度梯度篩選的方法確定其他引物的最佳退火溫度。

圖8 引物的不同退火溫度的ISSR－PCR擴增結(jié)果

2.9 ISSR－PCR反應(yīng)體系的驗證

圖7 不同循環(huán)次數(shù)的ISSR－PCR擴增結(jié)果

從黃枝油杉7個居群分別隨機選取2個個體的DNA樣品對優(yōu)化獲得的最佳反應(yīng)體系及擴增程序進行檢驗，結(jié)果見圖9。由圖9可見：除貴州平塘縣者密鎮(zhèn)居群（P）沒有擴增出條帶，其余各居群均有擴增產(chǎn)物。沒有擴增產(chǎn)物的部分樣品，可能的原因是加入反應(yīng)體系的DNA很少或者沒有，導(dǎo)致擴增產(chǎn)物很少，檢測不出來，或者沒有擴增產(chǎn)物。有擴增產(chǎn)物的樣品，擴增效果較好，條帶數(shù)目、清晰度均較佳，可見建立的反應(yīng)體系和擴增程序不僅穩(wěn)定，還具有較高的檢測能力。

圖9 不同居群的黃枝油杉樣品擴增效果

3 討 論

雖然ISSR分子標記具有多態(tài)性水平高、產(chǎn)物特異性強、穩(wěn)定性好、DNA用量少等優(yōu)點，但是ISSR擴增易受Taq DNA聚合酶、Mg2＋、引物、退火溫度等因素的影響，不同的物種，各組分所需的濃度也不同。因此，在對一個物種進行遺傳多樣性分析前有必要對反應(yīng)體系和程序進行優(yōu)化，以保證擴增出來的條帶清晰、重復(fù)性好。前人大多數(shù)是采用單一的單因素設(shè)計法或正交設(shè)計法來優(yōu)化ISSR－PCR反應(yīng)體系。精細地研究各因素的影響是單因素設(shè)計的優(yōu)點，但不能分析各因素之間的相互作用；快速地分析各因素之間的相互作用是正交設(shè)計法的一大優(yōu)點，但其處理水平有限，而且結(jié)果不夠精細［13－15］，而且工作量大。本研究將這2種方法結(jié)合起來使用，恰能互補，既可以精細地研究各因素的影響，還考慮到了各因素之間的相互作用，使結(jié)果更精確、更可靠，從而快速準確地建立了黃枝油杉ISSR－PCR反應(yīng)體系，即25μL體系中含2.0mmol／L的 Mg2＋、1.5UTaq DNA 聚合酶、0.10mmol／L 的dNTP、1.0μmol／L的引物、30ng的模板 DNA 以及2.5μL 10×PCR buffer，其余的用滅菌的ddH2O補夠25μL。

此外，ISSR－PCR擴增效果還受擴增程序中的循環(huán)次數(shù)和引物的退火溫度的影響。在一定范圍內(nèi)，循環(huán)次數(shù)增加，產(chǎn)物合成率也隨之增加［10］。但循環(huán)次數(shù)過多，非特異性產(chǎn)物合成率也會隨之增加［16］。退火溫度過低或過高，擴增條帶少、強度弱、背景模糊，退火溫度過高還會擴增出非特異性條帶。為了提高擴增的特異性，在擴增效果結(jié)果差不多的幾個退火溫度中，應(yīng)選擇較高的退火溫度作為最佳退火溫度［17］。故本研究選擇50次為最佳循環(huán)次數(shù)，最終確定的擴增程序為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，48～56℃（不同的引物，其退火溫度不同，根據(jù)具體引物而定）退火45s，72℃延伸90s，以上3個步驟循環(huán)50次；最后72℃延伸7min；4℃保存擴增產(chǎn)物。

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