奚天雪， 楊 磊， 袁 玫， 李夢琦， 張景華，周安琪， 高霞莉， 溫洪宇

（江蘇師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 江蘇 徐州221116）

土壤鹽漬化是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)重要的逆境脅迫因子之一，逐漸成為限制作物生長、影響作物產(chǎn)量的主要因素［1］。我國鹽漬土總面積約3 600×104hm2，占全國可利用土壤面積的4.88%［2］。其中，我國耕地中鹽漬化的面積達920.9×104hm2，占全國耕地面積的6.62%，且土壤鹽堿化和次生鹽堿化逐年加重［2－3］。因此，研究作物抗鹽性，提高作物耐鹽性，是未來農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要課題之一［4］。

甘藍、白菜和油菜是中國重要的蔬菜作物。甘藍作為主要蔬菜作物，在我國各地廣泛栽種，到目前為止仍是占據(jù)國內(nèi)市場主導(dǎo)地位的蔬菜品種之一［5］。白菜具有儲藏方便，耐久貯的特點，在蔬菜作物中保持較大比重，其種植面積居世界首位，2003年我國白菜播種面積達到269.9×104hm2，占全國蔬菜播種面積的15%［6－7］。蘇州青油菜具有早熟豐產(chǎn)、質(zhì)地鮮嫩、適應(yīng)性強、較耐寒等優(yōu)點，全國每年使用的蘇州青油菜種子達到50×104kg以上，并大量出口［8－10］。種子萌發(fā)期是植物對鹽脅迫非常敏感的時期，研究鹽脅迫下種子萌發(fā)以及對Na＋抗性規(guī)律，對提高蔬菜作物耐鹽水平和產(chǎn)量都具有重要意義。

非損傷微測技術(shù)（NMT）具有非損傷性、操作方便快捷、測量實時動態(tài)、長時間多維掃描、不受被測樣品的限制、高靈敏度和高分辨率等優(yōu)點，在植物營養(yǎng)調(diào)控、抗逆性等方面離子機制的研究中具有重要作用［11－14］。目前，NMT技術(shù)主要集中于植物葉片、根系等構(gòu)造上［13］，在種子耐鹽性方面的研究尚未見報道。

本研究以628甘藍、青雜中豐白菜、蘇州青油菜、茼蒿、上海雞毛菜種子為實驗材料，采用非損傷微測技術(shù)，檢測NaCl處理下種子外Na＋流速的動態(tài)變化，探究不同種子吸收或外排Na＋能力，并對不同NaCl濃度下種子萌發(fā)進行研究，探究種子吸收或外排Na＋能力與其耐鹽性的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

628甘藍、青雜中豐白菜、蘇州青油菜、茼蒿、上海雞毛菜種子均購于江蘇省徐州市七里溝農(nóng)貿(mào)市場。

1.2 實驗方法

1.2.1 非損傷微測實驗

配制 NaCl濃度為10mmol／L的1／4Hoagland測試液。挑選顆粒飽滿、質(zhì)地均勻的628甘藍、青雜中豐白菜、蘇州青油菜、茼蒿、上海雞毛菜種子，每個種子設(shè)置10個重復(fù)，用蒸餾水清洗。利用非損傷微測系統(tǒng)進行檢測，灌充并校正玻璃微電極，固定電極作為參比電極。將種子置于測試液中固定好。將電極尖端置于距離種子表面10μm處作為遠點，在垂直于種子表面方向約30μm處進行兩點移動，測量兩點電壓差。

1.2.2 種子萌發(fā)實驗（培養(yǎng)皿濾紙法）

挑選顆粒飽滿、質(zhì)地均勻的628甘藍、青雜中豐白菜、蘇州青油菜種子，用3%NaClO消毒10min后用蒸餾水沖洗數(shù)遍，并用濾紙吸干種子表面水分。以1／4 Hoagland溶液為基本培養(yǎng)液，配制NaCl濃度分別為0，100，150，200，250，300mmol／L的處理液。在直徑9cm的培養(yǎng)皿底部鋪2層濾紙，每個培養(yǎng)皿中放入50粒種子，每種種子不同濃度各設(shè)置3個重復(fù)，并進行編號。向培養(yǎng)皿中注入對應(yīng)鹽濃度的培養(yǎng)液，以浸濕濾紙和種子為宜，不要完全覆蓋種子，并使種子均勻分布于培養(yǎng)皿中。將培養(yǎng)皿放入25℃恒溫箱中培養(yǎng)，每天定時記錄萌發(fā)種子數(shù)，以胚根露出種皮0.2cm作為種子萌發(fā)標準。每2d更換濾紙和培養(yǎng)液，培養(yǎng)至連續(xù)2d種子的萌發(fā)數(shù)不再增加為止。

1.3 數(shù)據(jù)處理

1.3.1 非損傷微測實驗數(shù)據(jù)處理

離子的流速可以通過Fick’s第一擴散定律計算，計算公式如下：J＝－D·dc／dx。式中，J代表x方向的離子流，D是在特定的介質(zhì)中離子的擴散常數(shù)，dc／dx表示離子濃度梯度［15］。Na＋離子流檢測數(shù)據(jù)處理通過旭月（北京）科技有限公司提供的軟件完成，并用Microsoft Excel進行數(shù)據(jù)分析與作圖。

1.3.2 種子萌發(fā)實驗數(shù)據(jù)處理

每天記錄各處理種子萌發(fā)數(shù)，計算發(fā)芽率、相對發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和發(fā)芽勢，并找出耐鹽半致死濃度［16－19］。采用 Microsoft Excel進行數(shù)據(jù)分析與作圖。其中，耐鹽半致死濃度是指相對發(fā)芽率達到50%時所對應(yīng)的鹽濃度；發(fā)芽率（%）＝發(fā)芽結(jié)束時發(fā)芽種子數(shù)／供試種子數(shù)×100%；相對發(fā)芽率（%）＝處理發(fā)芽率／對照發(fā)芽率×100%；發(fā)芽指數(shù)（GI）＝∑（Gt／Dt），式中，Gt為發(fā)芽數(shù)，Dt為相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)；發(fā)芽勢（%）＝前3d發(fā)芽種子數(shù)／供試種子數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaCl處理對種子吸收或外排Na＋的影響

在10mmol／L NaCl溶液處理下，甘藍和茼蒿種子外Na＋平均流速為正值，表明甘藍和茼蒿種子附近Na＋外流，即甘藍和茼蒿種子在10mmol／L NaCl溶液下排出Na＋（圖1）。其中，甘藍種子附近Na＋平均流速為0.009 21pmol／（cm2·s），茼蒿種子為0.000 65 pmol／（cm2·s），說明排出 Na＋的效果：甘藍種子＞茼蒿種子。在10mmol／L NaCl溶液處理下，白菜、油菜和雞毛菜種子外Na＋平均流速為負值，表明白菜、油菜和雞毛菜種子附近Na＋內(nèi)流，即白菜、油菜和雞毛菜種子在10mmol／L NaCl溶液下吸收 Na＋（圖1）。其中，白菜附近Na＋平均流速分別為－0.033 19pmol／（cm2·s），油菜為－0.014 69pmol／（cm2·s），雞毛菜為－0.002 79pmol／（cm2·s）（表1），說明吸收 Na＋的效果：白菜種子＞油菜種子＞雞毛菜種子。

圖1 10mmol／L NaCl處理下甘藍、茼蒿、白菜、油菜和雞毛菜種子外Na＋的平均流速

結(jié)果表明，不同種子對Na＋抗性不同。在10 mmol／L NaCl溶液處理下，甘藍和茼蒿種子排出Na＋，而白菜、油菜和雞毛菜種子吸收Na＋。其中，甘藍、白菜和油菜種子對Na＋吸收或外排的效果明顯。因此，選擇甘藍、白菜和油菜種子進行不同NaCl濃度下種子萌發(fā)實驗，探究這3種種子的耐鹽性。

2.2 不同濃度的NaCl對種子萌發(fā)的影響

鹽脅迫對甘藍、白菜和油菜種子的萌發(fā)都有明顯的抑制作用。當NaCl濃度為0mmol／L時，3種種子的發(fā)芽率、相對發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)差別不大，但隨著NaCl濃度的增加，這些發(fā)芽指標都呈明顯下降趨勢（表1，表2）。當NaCl濃度達到300mmol／L時，甘藍、白菜和油菜種子的發(fā)芽率分別為37.33%、14.67%和 10.00%，相 對 發(fā) 芽 率 分 別 為 50.45%、20.00%和13.16%（表1）；甘藍、白菜和油菜種子的發(fā)芽率下降率分別為49.55%、79.99%和86.84%，相對發(fā)芽 率 下 降 率 分 別 為49.55%、80.00% 和 86.84%（表2）。

以NaCl濃度為橫坐標，以相對發(fā)芽率為縱坐標，得甘藍和白菜回歸方程分別為：y＝－0.161 x＋102.121，y＝－0.223 x＋103.896。將50%帶入方程（即y等于50），求得甘藍和白菜耐鹽半致死濃度分別為：323.73mmol／L和241.68mmol／L。油菜耐鹽半致死濃度為200mmol／L（表2）。所以，耐鹽半致死濃度大小順序為：甘藍種子＞白菜種子＞油菜種子。

結(jié)果表明，甘藍種子的耐鹽性最強，其次是白菜種子，油菜種子的耐鹽性最差。

表1 NaCl脅迫對不同種子萌發(fā)的影響

表2 NaCl脅迫下不同種子萌發(fā)指標的下降率（%）

3 討 論

高鹽脅迫對種子萌發(fā)具有顯著的抑制作用，在高鹽脅迫下，種子發(fā)芽率等指標顯著降低，種子萌發(fā)受到嚴重抑制。這是因為高鹽脅迫下，大量Na＋流入細胞，致使細胞膜電位發(fā)生去極化過程，使包括K＋、H＋和Ca＋在內(nèi)的大量陽離子外流，從而導(dǎo)致細胞膜內(nèi)外道南平衡被打破。K＋的嚴重缺失會導(dǎo)致植物抗寒性和抗旱性等耐受性下降，葉色變黃，植物易倒伏并逐漸壞死，而H＋和Ca＋缺失將導(dǎo)致細胞胞漿生化反應(yīng)紊亂，細胞分化發(fā)育終止［20］。同時，離子含量的變化也會導(dǎo)致細胞滲透勢調(diào)節(jié)能力大大降低，細胞內(nèi)水分大量外流，種子吸水困難，從而造成細胞內(nèi)水分虧缺，抑制種子萌發(fā)［21－23］。

自然進化過程中，不同植物形成了不同的耐鹽機制，包括降低Na＋的吸收、增加Na＋的外排和Na＋在細胞內(nèi)區(qū)隔化等，如甜土植物擬南芥利用SOS1等家族蛋白置換體內(nèi)過多的Na＋，調(diào)節(jié)細胞K＋／Na＋平衡［24］，而植物體內(nèi)K＋／Na＋平衡是植物耐受鹽脅迫的主要機制［25－26］；大洋洲濱藜和四翅濱藜能夠通過區(qū)隔化的方式消除Na＋毒害［26］。本實驗利用非損傷微測技術(shù)檢測10mmol／L NaCl溶液處理下種子外Na＋的平均流速，發(fā)現(xiàn)甘藍外排Na＋，而白菜和油菜吸收Na＋，通過不同NaCl濃度下種子的萌發(fā)實驗，表明甘藍種子的耐鹽性明顯高于白菜和油菜種子，進一步說明植物可以通過增加Na＋的外排減弱Na＋對種子的毒害作用［26］。

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