張家康　王梟雄　陳鑫　楊光　張大明　鐘晨　趙世光

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·綜述·

急性缺血性腦卒中中循環(huán)miRNA的相關(guān)研究進(jìn)展

張家康王梟雄陳鑫楊光張大明鐘晨趙世光

150001哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科

【DOI】10.3969/j.issn.1007-0478.2016.03.021

腦血管病是人類三大致死性疾病之一，已成為影響人類身體健康的一大難題。從1985～1991年統(tǒng)計(jì)的年發(fā)病率為116～219/100 000，其中缺血性腦卒中占腦卒中的75%。缺血性腦卒中是指由于腦的供血?jiǎng)用}(頸動(dòng)脈和椎動(dòng)脈)狹窄或閉塞、腦供血不足導(dǎo)致的腦功能障礙的總稱,分為動(dòng)脈血栓性腦梗死21.5%、栓塞性腦梗死7.5%、腔隙性腦梗死40.6%及其他原因引起的腦梗死或TIA[1]?？沙霈F(xiàn)不同的功能缺失表現(xiàn)，使患者的生活質(zhì)量嚴(yán)重下降。即使經(jīng)過(guò)系統(tǒng)的治療、康復(fù)鍛煉后，患者的致殘率仍能達(dá)到40%，給人民的生活及國(guó)家經(jīng)濟(jì)發(fā)展帶來(lái)不小的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

1miRNA

miRNA是由21～22個(gè)左右的核苷酸組成的內(nèi)源性的RNA，在核內(nèi)miRNA基因由RNA-polII催化轉(zhuǎn)錄形成pri-miRNA，在Drosha酶的作用下去掉帽子結(jié)構(gòu)及多聚腺苷酸尾形成前體miRNA，經(jīng)過(guò)erportin5的運(yùn)輸，Dicer酶的剪切、沉默復(fù)合體的作用最終形成成熟的miRNA[2]。Lee等人[3]在1993年最先從線蟲幼蟲研究中發(fā)現(xiàn)lin-4的存在，能夠調(diào)節(jié)線蟲幼蟲成熟的時(shí)機(jī)。7年后Reinhart等人[4]又在線蟲中發(fā)現(xiàn)miRNA家族let-7。此后關(guān)于miRNA的研究越來(lái)越多，發(fā)現(xiàn)的miRNA數(shù)量也在不斷增加。從MIRBASE網(wǎng)站中搜索。可以看到miRNA廣泛存在于動(dòng)物、植物、真菌、病毒中，而且單單在人類身體中發(fā)現(xiàn)的miRNA前體就有1881種，成熟體有2588種。miRNA功能涉及發(fā)育、病毒防御、造血過(guò)程、器官形成、細(xì)胞增殖和凋亡、脂肪代謝等[2]，由此為癌癥、代謝性疾病等領(lǐng)域的治療提供指導(dǎo)。這里本研究通過(guò)總結(jié)miRNA在缺血性腦卒中中作為循環(huán)生物學(xué)標(biāo)記的研究，希望能對(duì)今后的缺血性腦卒中研究及臨床治療方法提供幫助。

2008年Lawrie第1次對(duì)血清中存在miRNA進(jìn)行了描述，對(duì)彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤患者血清中與腫瘤相關(guān)的microRNA進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)血清中MIRN155 (miR-155)， MIRN210 (miR-210) and MIRN21 (miR-21)水平較對(duì)照組升高，且MIRN21與早期復(fù)發(fā)有關(guān)[5]，由此開啟了循環(huán)中microRNA作為各種疾病生物學(xué)標(biāo)記的研究。并且其樣本在低于-80 ℃的情況下也不會(huì)被破壞，為相關(guān)研究的血液樣本保存提供了有力的支持[6]。為miRNA作為血液學(xué)診斷標(biāo)記打下基礎(chǔ)。

2缺血性腦卒中循環(huán)miRNA研究

目前miRNA的分泌機(jī)制還不完全清楚，有研究表明miRNA在血清中的存在形式主要有脂質(zhì)小泡和游離兩種形式，在細(xì)胞與細(xì)胞間起信息連接的作用。脂質(zhì)小泡又包括外質(zhì)體(大小約30～100 nm)、微泡(100～1 000 nm)和凋亡小體，但外質(zhì)體與微泡通過(guò)現(xiàn)有的方法是很難準(zhǔn)確區(qū)分開的[10,11]。外質(zhì)體最早由Trams等人[12]在1981年的研究中定義，證明其來(lái)源于細(xì)胞膜，Valadi等人[13]證明釋放的外質(zhì)體含有細(xì)胞內(nèi)mRNA和miRNA，把這些物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到靶向細(xì)胞，包含在外質(zhì)體中的mRNA和microRNA統(tǒng)稱為esRNA。有研究稱miRNA的分泌是由神經(jīng)酰胺(一種生物活性硝質(zhì)類)數(shù)量的增加引起的，而神經(jīng)酰胺的合成與中性神經(jīng)硝磷脂酶有關(guān)[14]。

miRNA在循環(huán)中存在于脂質(zhì)小泡中，所以不會(huì)被RNA酶破壞。在血清及血漿中游離miRNA也能穩(wěn)定存在。Arroyo等人[15]應(yīng)用差速離心法和尺寸排阻色譜法來(lái)描述循環(huán)miRNA的特性，發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)miRNA與蛋白復(fù)合物結(jié)合，而不是囊泡。miRNA也對(duì)蛋白酶很敏感，說(shuō)明蛋白復(fù)合物能保護(hù)miRNA不受RNA酶損害，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)Argonaute2(一種調(diào)節(jié)miRNA沉默的關(guān)鍵蛋白)復(fù)合體保護(hù)循環(huán)與膜泡無(wú)關(guān)的miRNA免受RNA酶的破壞。只有少數(shù)的特殊miRNA與囊泡有關(guān)。

在神經(jīng)細(xì)胞中miR-124表達(dá)最為豐富，具有神經(jīng)元特異性，在星形膠質(zhì)細(xì)胞中不表達(dá)，降低miR-124可能降低神經(jīng)退行性變疾病中神經(jīng)元的比例，限制增殖促進(jìn)分化[7]。

在Weng等人的一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)miR-124只在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)，在對(duì)大鼠MCAO模型血漿中的miR-124進(jìn)行監(jiān)測(cè)后發(fā)現(xiàn)，血漿中的miR-124在6 h后開始升高，且能維持48 h，提示其可能作為腦缺血的生物學(xué)標(biāo)記[8]。

研究表明miR-125b-2p促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、成熟、抗凋亡[9]。主動(dòng)脈的內(nèi)皮細(xì)胞在暴露于氧化甘油磷脂中后miR-27a*/miR-27a-5p的表達(dá)水平上升[10]。在神經(jīng)細(xì)胞凋亡模型中miR-422a的表達(dá)水平在第12 h下降，并且 miR-422a與bcl-w呈負(fù)相關(guān)[11]。Sugunavathi epramaniam等人[12]通過(guò)FDR錯(cuò)誤控制法，變化倍數(shù)等方法從314個(gè)miRNA中篩選出了105個(gè)與腦卒中有關(guān)的miRNA，其中有58個(gè)下調(diào)、47個(gè)上調(diào)，而與急性缺血性腦卒中有關(guān)的有26個(gè)miRNA。隨后應(yīng)用分級(jí)層聚統(tǒng)計(jì)，TaqMan低密度芯片 (TLDA)、ROC曲線分析等方法選出miR-125b-2*,-27a*,-422a,-488 和 -627，在人的腦缺血急性期(1-7d)明顯高于恢復(fù)期，且在大鼠模型中6 h都會(huì)增高，在急性缺血性腦卒中具有診斷價(jià)值。

miR-106b-5p/miR-106b在膠質(zhì)瘤中高表達(dá),促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，抑制凋亡[13]，在內(nèi)皮細(xì)胞介導(dǎo)的血管生成中抑制內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生[14]， 在下肢動(dòng)脈缺血的小鼠中敲除miR-106b后血管生成障礙[15]。 hsa-miR-320能夠抑制大鼠心臟內(nèi)皮細(xì)胞遷移及血管生成[16]，在心肌缺血再灌注損傷中表達(dá)明顯降低，敲除-320后通過(guò)增加Hsp20減少心臟缺血再灌注所誘導(dǎo)的心肌損傷[17],在神經(jīng)退行性變過(guò)程中miR-320水平升高[18]。敲除miR-30-5p后通過(guò)上調(diào)SEPT7抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞，促進(jìn)凋亡[19]。Wang[6]對(duì)急性腦缺血性腦卒中的樣本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析篩選后發(fā)現(xiàn),13個(gè)miRNA存在上調(diào)，而4個(gè)則為下調(diào)(hsa-miR-30d-5P，hsa-miR-320e,hsa-miR-320d，hsa-miR-26b-5p文字中顯示，圖中顯示為miR-720)，然后根據(jù)生物指標(biāo)可能在腦卒中發(fā)生后的變化是漸進(jìn)性的這一點(diǎn)出發(fā)，找出了4個(gè)可以有助于臨床診斷的miRNA，其中miR-106b-5p和miR-4306上調(diào)，而miR-320e和320d下調(diào)。

miR-30a下調(diào)能通過(guò)提高bclin-1引起的自噬，缺血性對(duì)腦損傷起保護(hù)作用[20]。miR-126抑制后有助于血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及血管生成[21]促進(jìn)神經(jīng)突生芽，但抑制后對(duì)抗STS 和 Aβ1-42的毒性起神經(jīng)保護(hù)作用[22]let-7b通過(guò)作用于核受體TLX和cyclin1來(lái)促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖及分化[23]。Guangwen Long等人[24]根據(jù)以往對(duì)AMI的研究及缺血性腦卒中與其具有同樣的缺血特點(diǎn)，選擇對(duì)miR-30a,miR-126 和let-7b進(jìn)行研究，通過(guò)對(duì)197個(gè)缺血性腦卒中患者在不同時(shí)間的血液樣本收集，并與50名健康患者進(jìn)行對(duì)照，用qRT-PCR分析血樣miRNA水平，發(fā)現(xiàn)這3種miRNA也可以作為診斷缺血性腦卒中的循環(huán)生物標(biāo)記。

miRNA-223通過(guò)GluR2和谷氨酸受體的NR2B亞基起到中樞神經(jīng)保護(hù)作用[25]。Wang收集急性缺血性腦卒中患者第72 h的血樣，并用ELISA檢測(cè)導(dǎo)致miRNA-223下調(diào)的相關(guān)因子，并通過(guò)分析miRNA-223與NIHSS評(píng)分，TOAST亞型和腦梗死體積之間的關(guān)系。對(duì)12只CD-1鼠的大腦中動(dòng)脈進(jìn)行縫合阻斷24 h后收集血樣進(jìn)行real-time PCR檢測(cè)顯示，miR-223在急性缺血性腦卒中不論在血液還是腦組織中都會(huì)升高，但在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)miR-223與IGF-1有關(guān)，提示miR-223增高可能通過(guò)其他途徑參與腦卒中早期的炎癥反應(yīng)[26]。

3缺血性腦卒中循環(huán)miRNA研究的局限性

由于miRNA在不同的細(xì)胞作用的機(jī)制不盡相同，是上調(diào)或下調(diào)所反映出的細(xì)胞特異性就值得關(guān)注，以上實(shí)驗(yàn)得出的循環(huán)生物標(biāo)記組合是否也會(huì)反映其他疾病的發(fā)生或是特定的病理過(guò)程，還未有相關(guān)實(shí)驗(yàn)加以說(shuō)明。如前文所述，研究中涉及的miRNA在神經(jīng)及血管等領(lǐng)域起到的作用，研究人員已經(jīng)做了一定的實(shí)驗(yàn)，但循環(huán)miRNA做為腦卒中生物學(xué)標(biāo)記的研究相對(duì)有限，而在其他疾病或組織中涉及相關(guān)miRNA的研究，例如循環(huán)miR-223增高與C反應(yīng)蛋白的水平有關(guān)，與早期類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有關(guān)[27]，說(shuō)明miRNA可以在不同的組織中起作用，而把單一的miRNA作為一種疾病循環(huán)生物標(biāo)記是缺乏特異性的。

缺血性腦卒中的CT陽(yáng)性表現(xiàn)要到24～48 h后，MRI表現(xiàn)陽(yáng)性是在缺血4 h后，有研究表明靜脈溶栓6 h內(nèi)有效，而能夠在發(fā)病3h內(nèi)進(jìn)行靜脈rtPA溶栓治療，在降低死亡或生活依賴風(fēng)險(xiǎn)方面具有明確益處，其功能獨(dú)立的機(jī)率提高30%[28]。由此可以看出，急性缺血性腦卒中的治療時(shí)間點(diǎn)對(duì)預(yù)后非常重要，已治療越及時(shí)，則預(yù)后越好。在上述研究中都未能將診斷的時(shí)間提升到3 h內(nèi)，Sugunavathi Sepramaniam等人證明大鼠的循環(huán)miRNA生物學(xué)標(biāo)記有意義的時(shí)間是在6 h，而人的則是在一周內(nèi)的變化數(shù)據(jù)；同樣wang等人的實(shí)驗(yàn)在采集患者血樣時(shí)，將0～3 h，3～6 h，6～12 h，12～24 h個(gè)采集血樣，但遺憾的是沒(méi)有給出這些時(shí)間段篩選出的循環(huán)miRNAs的相應(yīng)變化曲線。Guangwen Long等人將時(shí)間點(diǎn)設(shè)在72 h，也未能滿足快速診斷的條件。以后的相關(guān)研究應(yīng)更多集中在缺血性腦卒中早期特別是3 h以內(nèi)，循環(huán)miRNA變化及其診斷意義。

4結(jié)束語(yǔ)

本研究希望有一種簡(jiǎn)單、便攜、快捷、成本低廉的檢測(cè)方法能滿足對(duì)急性缺血性腦卒中的治療要求。從以上幾點(diǎn)出發(fā)，循環(huán)生物學(xué)標(biāo)記是一項(xiàng)前景廣闊的研究方向。通過(guò)進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究，找到能將診斷急性缺血性腦卒中的時(shí)間點(diǎn)提前到6 h內(nèi)，甚至3 h內(nèi)的合適的microRNAs，將為防止或減輕腦組織缺血后發(fā)生的一系列炎癥反應(yīng)，水腫，壞死以及由此帶來(lái)的功能障礙，降低患者的病死率和致殘程度提供重要幫助。

值得注意的是，在Wang和Sugunavathi Sepramaniam的兩組實(shí)驗(yàn)給出的缺血性腦卒中后可能上調(diào)與下調(diào)的miRNA絕大多數(shù)并不相同，但都對(duì)急性缺血性腦卒中的診斷具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確性，并且根據(jù)不同的預(yù)設(shè)篩選條件得出了不同的合適條件的miRNA，而結(jié)果都是陽(yáng)性的，這些都說(shuō)明能作為急性缺血性腦卒中檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的生物學(xué)標(biāo)記組合不止一個(gè)，以后的研究可能會(huì)有更多的循環(huán)生物標(biāo)記組合被發(fā)現(xiàn)。

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(2015-03-07收稿2015-09-25修回)

基金項(xiàng)目：國(guó)家科技支撐計(jì)劃課題(項(xiàng)目編號(hào)為2013BAH06F04)

【中圖分類號(hào)】R743

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1007-0478(2016)03-0213-03