重組大腸桿菌高密度發(fā)酵產(chǎn)甲羥戊酸動力學

謝萌1，徐鑫2，咸漠2,賀詩華1

(1. 西安科技大學化學與化工學院，陜西西安，710054；

2. 中國科學院生物基材料重點實驗室青島生物能源與過程研究所，山東青島，266101)

摘要：為提高甲羥戊酸產(chǎn)量，探究其發(fā)酵生產(chǎn)規(guī)律，以重組大腸桿菌YJM16為供試菌株，進行5 L發(fā)酵罐勻速補料的高密度發(fā)酵實驗，最終細胞產(chǎn)量達到54.48 g/L，甲羥戊酸產(chǎn)量達到40.43 g/L，產(chǎn)率為20.2%。然后根據(jù)Logistic方程、Luedeking-Piret方程和類似Luedeking-Piret方程，擬合出重組大腸桿菌高密度發(fā)酵過程中菌體生長、甲羥戊酸合成、基質(zhì)消耗的動力學模型及模型參數(shù)。結果表明，甲羥戊酸的合成與重組大腸桿菌的生長速率及菌體積累量均有關。菌體生長、底物消耗模型和產(chǎn)物形成模型擬合度R`2分別達到了0.931 9、0.957 8和0.975 1，可用于描述利用重組大腸桿菌高密度發(fā)酵生產(chǎn)甲羥戊酸過程。

關鍵詞：重組大腸桿菌；甲羥戊酸；高密度發(fā)酵；動力學模型

doi:10.3969/j.issn.1672-3678.2015.06.013

收稿日期：2014-10-15

基金項目：國家高技術研究發(fā)展計劃(863計劃)(2013AA050703)；青島市基礎研究項目 (12-1-4-9-(3)-jch)

作者簡介：謝萌(1989—)女，天津人,碩士研究生，研究方向：生物化工；賀詩華(聯(lián)系人)，副教授，E-mail：heshihua@xust.edu.cn

中圖分類號：TQ225.1

文獻標志碼：A

文章編號：1672-3678(2015)06-0070-05

Abstract：In order to increase the production of mevalonate and study its regular pattern during fermentation process,fed-batch technique for high cell density fermentation of mevalonate production by recombinant Escherichia coli YJM16 was studied.The dry cell weight reached 54.48 g/L,the production of mevalonate was 40.43 g/L and the yield was 20.2%.The kinetics model was proposed by using the Logistic equation for cell growth， the Luedeking Piret equation for mevalonate production and the Luedeking-Piret-like equation for consumption of glucose as substrate.The mevalonates synthesis was related to the growth rate of recombinant Escherichia coli and the volume of the bacteria.The high density fermentation kinetic of mevalonate production by recombinant Escherichia coli could be well expressed by the models. The goodness-of-fit scores R`2 of the models were 0.931 9,0.957 8 and 0.975 1,respectively.

Keywords：recombinant Escherichiacoli;mevalonate;high density fermentation;kinetics model

High density fermentation kinetics of mevalonate production by recombinant Escherichia coli

XIE Meng1,XU Xin2,XIAN Mo2,HE Shihua1

(1. School of Chemistry and Chemical Engineering,Xi′an University of Science and Technology,Xi′an 710054,China;

2. Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology,CAS Key Laboratory of Biobased Materials，

Chinese Academy of Sciences,Qingdao 266101,China)

甲羥戊酸(3，5-二羥基-3-甲基戊酸)是生物體內(nèi)生成異戊烯焦磷酸(IPP)的中間代謝產(chǎn)物，是合成甾醇、萜類、類異戊二烯的重要中間體，在食品及化工行業(yè)有重要用途。Yang等[2-3]通過對大腸桿菌的甲羥戊酸代謝途徑進行改造，提高了甲羥戊酸產(chǎn)量，進而提高了其下游產(chǎn)物橡膠合成單體異戊二烯的產(chǎn)量，在發(fā)酵40 h時達到6 g/L。Xiong等利用大腸桿菌發(fā)酵生成甲羥戊酸，酯化生成β-甲基-δ-戊內(nèi)酯，并聚合成嵌段共聚物用于橡膠合成。采用重組大腸桿菌高效表達常用的高密度發(fā)酵技術[5-6]合成甲羥戊酸，提高菌體的發(fā)酵密度，最終提高產(chǎn)物的產(chǎn)量及產(chǎn)率，不僅可以減少培養(yǎng)體積，強化下游分離提取，還可以縮短生產(chǎn)周期、減少設備投資，從而降低生產(chǎn)成本，能極大地提高市場競爭力。

目前，使用生物法發(fā)酵生產(chǎn)有機酸的工業(yè)化品種很多，例如丁二酸、乳酸等，產(chǎn)品產(chǎn)量均達到40 g/L，而達到高密度要求，則需要菌體干質(zhì)量濃度達到30 g/L以上。微生物發(fā)酵過程具有非線性、時變性和不確定性的特點。特別是高密度發(fā)酵周期長，且采用補料分批發(fā)酵的方式，其動力學參數(shù)復雜，因此，目前大多基于遺傳算法等復雜模型[10-12]來優(yōu)化高密度發(fā)酵過程。

筆者擬在5 L發(fā)酵罐的小試中，利用勻速補料批式發(fā)酵來實現(xiàn)重組大腸桿菌高密度發(fā)酵產(chǎn)甲羥戊酸。同時通過對發(fā)酵過程的數(shù)據(jù)進行分析，研究菌體生長、基質(zhì)消耗及產(chǎn)物生成之間的動力學關系，證實常用的Logistic方程、Luedeking-Piret方程及類似Luedeking-Piret方程是否適用于高密度發(fā)酵動力學研究。該模型參數(shù)簡單，可使用常用軟件Origin進行擬合，以避免繁多的參數(shù)設置和專業(yè)軟件的計算過程。

1材料與方法

1.1　材料與儀器

重組大腸桿菌：YJM16(E.coliBL21(DE3)/pYJM16)，由中國科學院青島生物能源與過程研究所生物基化學品團隊構建并保藏。

5 L發(fā)酵罐，德國Sartorius公司；ZHWY-1112B型恒溫搖床，上海智誠分析儀器制造有限公司；1-14型臺式高速離心機，德國Sigma公司；Vortex-Genie-2型渦漩振蕩器，美國Scientific Industries公司；SBA-40D型生物傳感分析儀，山東省科學院生物研究所；450-GC-8400型氣相色譜儀、Cary 50 UV-Vis型紫外分光光度計，美國Varian公司。

1.2　培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10、酵母浸粉5、NaCl 10。pH 7.0。

M9基本培養(yǎng)基(g/L)：Na2HPO4·12H2O 15.12、KH2PO43、NaCl 0.5、NH4Cl 1、MgSO4·7H2O 0.24、葡萄糖20、氯霉素0.034。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：KH2PO42.5、(NH4)2SO43、C6H8O7·H2O 1、C6H5Na3O7·2H2O 1、KCl 1.86、FeSO4·7H2O 0.08、MgSO4·7H2O 0.24、牛肉浸粉1、甜菜堿1、微量元素0.001、葡萄糖20、氯霉素0.034。

微量元素配方(質(zhì)量分數(shù))：ZnSO4·7H2O 0.29%、(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.37%、H3BO32.47%、CuSO4·5H2O 0.25%、MnCl2·4H2O 1.58%。

1.3　實驗方法

1.3.1種子液培養(yǎng)

一級種子：從菌種LB平板上挑取一個飽滿的單菌落，接種到裝有10 mL LB培養(yǎng)基的100 mL三角瓶里，37 ℃培養(yǎng)12 h。

二級種子：一級種子以1%的接種量接至裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，37 ℃培養(yǎng)12 h。

1.3.2補料分批發(fā)酵過程

補料分批發(fā)酵采用5 L發(fā)酵罐，加入3 L發(fā)酵培養(yǎng)基，121 ℃滅菌30 min。冷卻后接入100 mL種子液，37 ℃培養(yǎng)1 h，之后持續(xù)32 ℃，溶氧控制在20%，通過自動流加氨水將pH控制在7.0，補料設置為發(fā)酵13 h后6%自動流加。自接種后間隔幾小時取樣20 mL，分別測定OD、干質(zhì)量濃度、殘?zhí)橇?、甲羥戊酸產(chǎn)量及副產(chǎn)物產(chǎn)量，培養(yǎng)至13 h，加入0.1 mol/L異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)進行誘導。

1.3.3發(fā)酵過程中參數(shù)的確定

菌體生物量的測定采用干質(zhì)量濃度法。取發(fā)酵液5 mL于已知質(zhì)量的離心管中，用高速離心機 6 000 r/min離心10 min，棄上清液，再加去離子水懸浮離心2次，獲沉淀，放入80 ℃的烘箱內(nèi)烘干至恒質(zhì)量。稱質(zhì)量，計算得知菌體干質(zhì)量濃度。

甲羥戊酸的測定：取5 mL發(fā)酵液于50 mL離心管中離心，5 000 r/min離心10 min；將上清液倒入干凈的50 mL離心管中，加入1 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)至pH2.0；45 ℃水浴45 min；加入2.5 g無水Na2SO4和10 mL乙酸乙酯，充分振蕩，分層；用1 mL針管取上清液，使用有機相濾膜過濾到氣相小瓶中，用450-GC-8400型氣相色譜儀進行檢測。

葡萄糖含量的測定：取發(fā)酵液1 mL，用高速離心機6 000 r/min離心5 min，取上清液，使用SBA-40D型生物傳感分析儀測定。

1.3.4數(shù)據(jù)的獲取及處理

從發(fā)酵開始計時，7 h開始取樣，測定不同時期菌體生物量、甲羥戊酸產(chǎn)量及葡萄糖濃度，并用Origin 8.5繪圖軟件對動力學方程進行非線性擬合，繪制動力學曲線，以獲得最佳動力學模型參數(shù)。

2結果與討論

2.1　重組大腸桿菌產(chǎn)甲羥戊酸高密度發(fā)酵過程

高密度培養(yǎng)是在保證生長速率的前提下，盡可能提高細胞密度，使體積生產(chǎn)率大幅提高，其實現(xiàn)的主要方式為分批補料培養(yǎng)。圖1為重組大腸桿菌高密度發(fā)酵產(chǎn)甲羥戊酸發(fā)酵過程曲線，顯示了細胞生物量(DCW)、殘?zhí)菨舛?RG)及甲羥戊酸濃度隨時間的變化趨勢。由圖1可知：重組菌高密度發(fā)酵過程可分為4個階段。第一階段為延滯期，即菌株接種至發(fā)酵罐后的短暫適應期。第二階段為對數(shù)生長期，菌體迅速生長，最大比生長速率出現(xiàn)在此階段，同時，該階段菌體相關酶活達到最佳。為達到較高的細胞密度，以提高甲羥戊酸產(chǎn)量，選擇在對數(shù)后期，即培養(yǎng)20 h后，細胞生物量為22 g/L時，加入IPTG誘導，發(fā)酵進入第三階段——產(chǎn)物生成期。這一時期菌體以低于對數(shù)期的比生長速率繼續(xù)生長，產(chǎn)物積累迅速，甲羥戊酸的最大比生成速率及最高產(chǎn)率均出現(xiàn)在這個階段。第四階段是衰亡期，這一時期菌體開始衰亡，導致生物量下降，同時甲羥戊酸生產(chǎn)速率減慢。發(fā)酵結束時，菌體產(chǎn)量達到54.48 g/L，甲羥戊酸產(chǎn)量達到40.43 g/L，產(chǎn)率為20.2%。

圖1　 重組大腸桿菌產(chǎn)甲羥戊酸發(fā)酵進程曲線 Fig.1　 Fermentation curves of mevalonate produced by recombinant Escherichia coli

2.2　甲羥戊酸高密度發(fā)酵的動力學模型分析

研究者通常采用基于菌體生長動力學的Logistic方程、Luedeking-Piret方程及類似Luedeking-Piret方程等動力學方程來研究分批發(fā)酵中菌體生長、基質(zhì)消耗及產(chǎn)物生成之間的動力學關系[13]。為達到較高的細胞密度，筆者采用勻速補料分批發(fā)酵模式。通過對實驗數(shù)據(jù)的分析，做出如下假定：①甲羥戊酸分批發(fā)酵過程中菌體濃度的增加對自身生長存在抑制作用；②葡萄糖的消耗僅用于菌體生長和維持菌體代謝，葡萄糖消耗速率由細胞濃度、細胞生長和甲羥戊酸合成決定；③產(chǎn)物生成期，甲羥戊酸大量合成，衰亡期甲羥戊酸合成速率逐漸降低。

2.2.1菌體生長動力學模型

描述細胞生長動力學普遍采用的是Logistic方程，它廣泛應用于分批發(fā)酵的細胞，能較好地描述分批發(fā)酵過程中因菌體濃度的增加對菌體自身存在的抑制效應[14-15]。該方程被看作是一個表現(xiàn)細胞生長與營養(yǎng)物質(zhì)之間非線性關系的經(jīng)驗方程[16-17]。本實驗中，大腸桿菌的生長曲線為較標準的S型，故采用Logistic方程作為研究重組大腸桿菌的菌體生長動力學模型，見式(1)。

(1)

式中：X為菌體生物量(g/L)；Xm為最大菌體生物量(g/L)；μm為菌體最大比生長速率(h-1)；t為時間(h)。

將式(1)積分為代數(shù)方程，見式(2)。

(2)

式中：X0為初始菌體生物量(g/L)。

將圖1數(shù)據(jù)代入式(2)進行非線性擬合，得到生長動力學參數(shù)X0、Xm和μm值分別為5.428 61、50.570 36和0.072 64，代入式(2)獲得菌體生長動力學方程，見式(3)。

(3)

由Logistic方程獲得的式(3)預測的模型值與實驗數(shù)據(jù)進行對比驗證，結果見圖2。

圖2　 菌體生長的實驗值與模型計算值的比較 Fig.2　 Comparison of experimental data with calculated data on cell growth

由圖2可知，實驗數(shù)據(jù)與公式(3)的計算值基本吻合，R2=0.931 9，結果表明實驗值與動力學模型基本符合，但是總體擬合度低于分批發(fā)酵[18]，其中對數(shù)前期實驗值與擬合值并非完美貼合，其原因在于，隨著培養(yǎng)時間的延長，目標產(chǎn)物甲羥戊酸及其他代謝副產(chǎn)物的積累對菌體的抑制作用越來越明顯，而Logistic方程獲得的是更為貼合發(fā)酵后期的局部最優(yōu)解。重組大腸桿菌細胞生長基本可參考依據(jù)該動力學模型。

2.2.2甲羥戊酸合成動力學模型

由于微生物在發(fā)酵的動態(tài)過程中具有十分復雜的合成途徑，代謝調(diào)節(jié)機制也各具特點，所以根據(jù)產(chǎn)物生成速率與細胞生長速率之間的動態(tài)關系，可將其動力學模型分為三類：①生長偶聯(lián)型；②部分生長偶聯(lián)型或稱混合型；③非生長偶聯(lián)型[19-20]，常用Luedeking-Piret方程[21-22]描述產(chǎn)物形成與細胞生長的關系，見式(4)。

(4)

式中：P為甲羥戊酸產(chǎn)量(g/L)；X為菌體生物量(g/L)；α為生長偶聯(lián)系數(shù)；β為非生偶聯(lián)系數(shù)。

α≠0、β=0表示第Ⅰ發(fā)酵；α≠0、β≠0表示第Ⅱ類發(fā)酵；α=0、β≠0表示第Ⅲ類發(fā)酵。從大腸桿菌產(chǎn)甲羥戊酸分批發(fā)酵實驗結果可以推斷該菌體的發(fā)酵過程屬于第Ⅱ類，即產(chǎn)物形成與細胞生長呈部分偶聯(lián)型。聯(lián)合公式(2)和(4)，Luedeking-Piret方程可積分為代數(shù)方程，見式(5)。

(5)

式中P0為甲羥戊酸初始產(chǎn)量(g/L)。由于P0=0，X0對產(chǎn)量的影響可以忽略不計，式(5)可簡化為

(6)

將菌體生長動力學參數(shù)X0、Xm和μm值分別代入式(6)，利用圖1的實驗數(shù)據(jù)進行非線性擬合，得到產(chǎn)物生成動力學參數(shù)α和β，其值分別為0.286 35和0.011 59，代入式(6)，獲得產(chǎn)物濃度與時間的關系,見式(7)。

(7)

由Luedeking-Piret方程獲得的式(7)預測模型值與實驗數(shù)據(jù)進行對比驗證，結果見圖3。

圖3　 甲羥戊酸產(chǎn)量的實驗值與模型計算值的比較 Fig.3　 Comparison of experimental data with calculated data on MVA yield

由圖3可知，實驗數(shù)據(jù)與公式(7)的計算值基本吻合，R2=0.957 9。

2.2.3基質(zhì)消耗動力學模型

大腸桿菌產(chǎn)甲羥戊酸發(fā)酵過程中，葡萄糖的消耗一方面用于菌體生長，同時又用于其菌體細胞的維持和產(chǎn)物的合成及代謝，因此，基質(zhì)消耗可以由類似Luedeking-Piret的式(8)來表示。

(8)

式中：S為葡萄糖質(zhì)量濃度(g/L)；X為菌體生物量(g/L)；YX/S為碳源用于菌體生長的得率常數(shù)(g/g)；YP/S為碳源用于產(chǎn)物積累得率常數(shù)(g/g)；γ為菌體維持系數(shù)(g/g)。

為避免生成乙酸、乙醇等副產(chǎn)物，提高甲羥戊酸產(chǎn)量及產(chǎn)率，采用勻速補料方式進行補糖，將殘?zhí)橇靠刂圃诘陀? g/L。因此，補糖階段(即產(chǎn)物生成階段)未進行擬合，忽略用于產(chǎn)物生成的葡萄糖消耗部分，動力學方程簡化為式(9)。

(9)

結合式(2)、式(9)積分可得

(10)

式中：S0為初始葡萄糖質(zhì)量濃度(g/L)；λ=1/YX/S。

將菌體生長動力學參數(shù)X0、Xm和μm值分別代入式(6)，利用圖1的實驗數(shù)據(jù)進行非線性擬合，得到產(chǎn)物形成動力學參數(shù)S0、λ和γ，其值分別為20.091 6、-23.247 7和1.658 5，代入式(10)，得產(chǎn)物濃度與時間的關系式，如式(11)所示。

(11)

對于由式(11)獲得方程與實驗數(shù)據(jù)進行非線性擬合，結果見圖4，R2=0.975 1。圖4為補料前的基質(zhì)消耗模型，其中小圖是發(fā)酵全程的基質(zhì)剩余曲線，表明補料后基質(zhì)基本為零。由于采用分批補料方式，底物消耗的實驗值較少，但基本可擬合出殘?zhí)菨舛茸兓内厔荨Ｔ撃Ｐ湍軌蜉^好地描述甲羥戊酸合成前的基質(zhì)消耗情況。

圖4　 基質(zhì)消耗的動力學模型與實驗數(shù)據(jù)的比較 Fig.4　 Comparison of kinetic model data with experimental data on substrate consumption

3結論

以重組大腸桿菌YJM16為供試菌株，進行5 L發(fā)酵罐勻速補料的高密度發(fā)酵實驗，最終細胞生物量達到54.48 g/L，甲羥戊酸產(chǎn)量達到40.43 g/L，產(chǎn)率為20.2%。通過計算得出菌體生長動力學模型、產(chǎn)物生成模型和基質(zhì)消耗動力學模型，R2分別達到了0.931 9、0.957 8和0.975 1。本研究建立的模型基本符合大腸桿菌細胞生長規(guī)律，能夠反映甲羥戊酸高密度發(fā)酵的過程，同時該模型參數(shù)簡單，避免了繁多的參數(shù)設置和專業(yè)軟件的計算過程，可為高密度發(fā)酵工藝的優(yōu)化放大提供理論依據(jù)。

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(責任編輯管珺)