基于滲透壓調(diào)控的紐莫康定B0發(fā)酵動(dòng)力學(xué)

章人川，鄭嘉琪，肖瀟，馮昆達(dá)，秦婷婷，宋萍，黃和

(南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，江蘇南京，211800)

摘要：以海洋絲狀真菌Glarea lozoyensis Q45為研究對(duì)象，研究不同滲透壓條件下Glarea lozoyensis Q45的生長(zhǎng)、底物甘露醇消耗以及紐莫康定B0的生產(chǎn)特性?；贚ogistics方程、Luedeking-Piret方程和Luedeking-Piret-Like 方程，得到了描述紐莫康定B0發(fā)酵模型的動(dòng)力學(xué)參數(shù)?；诎l(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型，提出了在菌體生長(zhǎng)穩(wěn)定期添加1.61 g/L NaCl的調(diào)控策略。在該策略下，紐莫康定B0的產(chǎn)量達(dá)到1.75 g/L，比初始條件的結(jié)果提高24.6%。

關(guān)鍵詞：紐莫康定B0；滲透壓； 發(fā)酵動(dòng)力學(xué)；Glarea lozoyensis

doi:10.3969/j.issn.1672-3678.2015.06.012

收稿日期：2015-03-11

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(21306084)

作者簡(jiǎn)介：章人川(1990—)，男，福建福州人，碩士研究生，研究方向：微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物；黃 和(聯(lián)系人)，教授，E-mail：biotech@njtech.edu.cn

中圖分類號(hào)：Q93

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1672-3678(2015)06-0065-05

Abstract：The fermentation kinetic models for Glarea lozoyensis Q45 were established to describe the effect of different osmotic pressure conditions for cell growth,consumption of mannitol and production of pneumocandin B0.Based on Logistics equation,Luedeking-Piret equation and Luedeking-Piret Like equation,the kinetic parameters of different osmotic pressure were analyzed.An osmotic pressure stage-controlled strategy,with 1.61 g/L NaCl added during the stationary phase,was suggested and experimentally verified.Following this strategy,the final production of pneumocandin B0 was 1.75 g/L,increased by 24.6%.

Keywords：pneumocandin B0;osmotic pressure;fermentation kinetic;Glarea lozoyensis

Fermentation kinetic model of pneumocandin B 0 based onosmotic pressure stage-controlled

ZHANG Renchuan,ZHENG Jiaqi,XIAO Xiao,FENG Kunda,QIN Tingting,SONG Ping,HUANG He

(College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering,Nanjing Tech University,Nanjing 211800,China)

海洋絲狀真菌Glarealozoyensis的次級(jí)代謝產(chǎn)物紐莫康定B0是抗真菌藥物卡泊芬凈的前體，由一個(gè)環(huán)狀的六肽母核以及一個(gè)脂肪酸鏈組成。卡泊芬凈作為一種新型的廣譜抗真菌藥物——棘白菌素類抗真菌藥物，能選擇性地抑制真菌細(xì)胞壁β-1,3葡聚糖的合成，在抗真菌藥物領(lǐng)域受到人們廣泛的關(guān)注[1-3]。

滲透壓對(duì)大部分微生物的生長(zhǎng)具有顯著影響，細(xì)胞會(huì)通過(guò)合成用于調(diào)節(jié)胞內(nèi)滲透壓的物質(zhì)來(lái)適應(yīng)環(huán)境的變化。王玉磊等在研究產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵的鹽脅迫時(shí)發(fā)現(xiàn)，添加適當(dāng)?shù)腘a+和K+能提高谷胱甘肽和S-腺苷蛋氨酸的聯(lián)產(chǎn)產(chǎn)量。曾艷等研究裂殖壺菌時(shí)發(fā)現(xiàn)，一定濃度的滲透壓脅迫使二十二碳六烯酸(DHA)產(chǎn)量提升46.84%。姜瑋等在研究游動(dòng)放線菌合成阿卡波糖的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，在前期維持較低的滲透壓772.5 kPa，在中后期維持1 030～1 288 kPa，最終50 L發(fā)酵罐的效價(jià)提升50%。

目前，相關(guān)學(xué)者已就滲透壓對(duì)G.lozoyensis發(fā)酵的影響以及G.lozoyensis發(fā)酵產(chǎn)紐莫康定B0的工業(yè)放大[9-11]進(jìn)行過(guò)研究，但對(duì)G.lozoyensis發(fā)酵動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究的很少。發(fā)酵動(dòng)力學(xué)能通過(guò)數(shù)學(xué)模型描繪微生物代謝來(lái)減少傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)型發(fā)酵調(diào)控的盲目性。因此，本研究中，筆者構(gòu)建基于滲透壓調(diào)控的G.lozoyensis產(chǎn)紐莫康定B0的分批發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型，研究在最優(yōu)初始滲透壓發(fā)酵條件下G.lozoyensis發(fā)酵過(guò)程中的菌體生長(zhǎng)，底物消耗以及產(chǎn)物合成的潛在規(guī)律，并初步探討滲透壓對(duì)菌體生理代謝的影響方式。

1材料與方法

1.1　實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1菌種

菌株GlarealozoyensisQ45，中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏日期2014年9月14日，保藏編號(hào)為CCTCC M 2014416。

1.1.2培養(yǎng)基

PDA固體培養(yǎng)基(g/L):去皮馬鈴薯200.0，蔗糖20.0，瓊脂20.0。

種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖 40.0，黃豆粉 20.0，玉米漿 10.0，KH2PO410.0，微量元素 10.0。

微量元素(g/L):FeSO4·7H2O 1.0，MnSO4·H2O 1.0，ZnSO4·7H2O 0.2，CaCl2·2H2O 0.1，HBO30.056，CuCl2·2H2O 0.025，(NH4)5MO7O24·4H2O 0.003。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：甘露醇 80，玉米蛋白粉 10，K2HPO42.5。

1.1.3實(shí)驗(yàn)材料

甘露醇標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司，其余試劑均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)試劑公司的分析純?cè)噭?/p>

LC-20AB型高效液相色譜購(gòu)自島津(中國(guó))有限公司，U3000型高效液相色譜購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司。

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1培養(yǎng)方法

發(fā)酵培養(yǎng)：自斜面取2 cm2菌苔至50 mL種子培養(yǎng)基中，26 ℃、220 r/min培養(yǎng)5 d。以10%的接種量接入裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，26 ℃、220 r/min培養(yǎng)15 d。

1.2.2檢測(cè)方法

甘露醇檢測(cè)采用島津高效液相色譜LC Solution工作站測(cè)定。色譜柱Aminex HPX-87P柱(300 mm×7.8 mm)，流動(dòng)相為超純水，流速1 mL/min，檢測(cè)器為示差折光檢測(cè)器(RID-10A)，柱溫80 ℃，進(jìn)樣量20 μL。

生物量檢測(cè)采用菌體干質(zhì)量濃度法，80 ℃烘干至恒質(zhì)量。

紐莫康定B0檢測(cè)采用戴安高效液相色譜U3000測(cè)定。色譜柱Venusil MP C18柱(250 mm×4.6 mm)，流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.1 %的H3PO4。洗脫程序 ：0～20 min，V(A)∶V(B)=40∶60；20～40 min，V(A)∶V(B)=50∶50，流速1 mL/min。檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量20 μL。

1.2.3滲透壓計(jì)算方法

培養(yǎng)基中總滲透壓為電解質(zhì)和非電解質(zhì)之和，計(jì)算方法參照文獻(xiàn)[12]。

目前，用于模擬菌體生長(zhǎng)的非結(jié)構(gòu)模型主要為Monod方程和Logistic方程[13]。G.lozoyensisQ45發(fā)酵生產(chǎn)紐莫康定B0的過(guò)程中，菌體生長(zhǎng)符合Logistic方程，Logistic菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型見(jiàn)式(1)。

(1)

式中：X為菌體質(zhì)量濃度(g/L)；Xm為最大菌體質(zhì)量濃度(g/L)；μm為最大比生長(zhǎng)速率(d-1)；t為發(fā)酵時(shí)間(d)。

產(chǎn)物生成動(dòng)力學(xué)模型：紐莫康定B0的合成與菌體的生長(zhǎng)應(yīng)歸于部分生長(zhǎng)偶聯(lián)型。因此，選用Luedekin-Piret方程來(lái)描述G.lozoyensisQ45菌合成紐莫康定B0的速率[14]，見(jiàn)式(2)。

(2)

式中：P表示紐莫康定B0質(zhì)量濃度(g/L)，α表示生長(zhǎng)偶聯(lián)的產(chǎn)物合成系數(shù)，β表示非生長(zhǎng)偶聯(lián)的產(chǎn)物合成系數(shù)。當(dāng)α≠0、β=0時(shí)，為產(chǎn)物形成與細(xì)胞生長(zhǎng)偶聯(lián)型；α≠0、β≠0時(shí)，為產(chǎn)物形成與細(xì)胞生長(zhǎng)部分偶聯(lián)型；α=0、β≠0時(shí)，為產(chǎn)物形成與細(xì)胞生長(zhǎng)非偶聯(lián)型。

底物消耗動(dòng)力學(xué)模型：紐莫康定B0分批發(fā)酵過(guò)程中，甘露醇作為碳源和能源用于菌體生長(zhǎng)，維持菌體新陳代謝以及次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成。底物消耗動(dòng)力學(xué)可采用Luedekin-Piret-Like方程來(lái)表示[15]，見(jiàn)式(3)。

(3)

發(fā)酵動(dòng)力學(xué)參數(shù)計(jì)算：用Matlab7軟件工具包中l(wèi)sqcurvefit參數(shù)對(duì)上述公式進(jìn)行非線性最小二乘法擬合。

2結(jié)果與討論

2.1　滲透壓對(duì) G. lozoyensis Q45產(chǎn)紐莫康定B 0的影響

考察滲透壓對(duì)菌體底物消耗與產(chǎn)物合成的相互影響，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知：高濃度甘露醇80 g/L(1 132.31 kPa)條件下紐莫康定B0的產(chǎn)量是低濃度40 g/L(566.16 kPa)的4.96倍。在低濃度甘露醇條件下，添加終質(zhì)量濃度為6.44 g/L(566.16 kPa)的NaCl使?jié)B透壓回到高濃度甘露醇的滲透壓，紐莫康定B0產(chǎn)量較低濃度時(shí)提高191.4%。底物消耗方面，NaCl的添加使底物甘露醇的消耗速度減緩。因此，滲透壓對(duì)G.lozoyensisQ45的發(fā)酵產(chǎn)紐莫康定過(guò)程和菌體代謝有著重要影響。但是紐莫康定B0產(chǎn)量并沒(méi)有回復(fù)到高濃度的水平，可能是初始甘露醇濃度不夠，沒(méi)有足夠的底物維持細(xì)胞和產(chǎn)量的合成。因此，在下階段實(shí)驗(yàn)中，采用80 g/L甘露醇作為底物質(zhì)量濃度。

圖1　 滲透壓對(duì)紐莫康定B 0發(fā)酵的影響 Fig.1　 Effects of the osmotic pressure on pneumocandin B 0 fermentation

2.2　NaCl濃度對(duì) G. lozoyensis Q45產(chǎn)紐莫康定B 0的影響

考慮到6.42 g/L NaCl所提供的滲透壓(相當(dāng)于40 g/L甘露醇)已經(jīng)較大，所以在80 g/L甘露醇基礎(chǔ)上添加NaCl的時(shí)候，以添加6.42 g/L NaCl為最高值，以倍數(shù)關(guān)系做遞減，考察不同初始NaCl溶液條件下紐莫康定B0的發(fā)酵情況，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知：G.lozoyensisQ45生長(zhǎng)過(guò)程可分為3個(gè)階段。在遲滯期(Ⅰ階段，0～2 d)，碳源消耗速度緩慢，菌體生長(zhǎng)緩慢，同時(shí)產(chǎn)物少量合成；在對(duì)數(shù)期(Ⅱ 階段，2～6 d)，菌體快速生長(zhǎng)，產(chǎn)物合成以及碳源消耗速度略微加快；在穩(wěn)定期(Ⅲ 階段，6～15 d)，菌體生長(zhǎng)趨于穩(wěn)定，此時(shí)，在碳源大量消耗的基礎(chǔ)上，產(chǎn)物開(kāi)始大量合成。同時(shí)，隨著NaCl濃度的增加，甘露醇消耗速度減緩，生物量的積累減少，紐莫康定B0的合成速度和最大產(chǎn)量先增加后減少。 在遲滯期添加1.61 g/L NaCl，紐莫康定B0產(chǎn)量相比添加3.22 g/L和6.24 g/L NaCl的實(shí)驗(yàn)組分別提高15.4%和21.5%，因此，確定1.61 g/L NaCl為最優(yōu)添加量。

圖2　 NaCl質(zhì)量濃度對(duì)紐莫康定B 0發(fā)酵過(guò)程的影響 Fig.2　 Effects of NaCl concentration on pneumocand in B 0 fermentation

2.3　發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型的建立與分析

2.3.1發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型的建立

為了驗(yàn)證模型的適用范圍，分別以8%～12%初始菌體濃度(即接種量)以及60～100 g/L初始底物質(zhì)量濃度作為考察范圍，研究不同接種量計(jì)算值與實(shí)驗(yàn)值的相對(duì)誤差，結(jié)果如表1所示。由表1可知：當(dāng)接種量在±20%之內(nèi)時(shí)，菌體生長(zhǎng)、底物消耗的實(shí)驗(yàn)值與計(jì)算值的平均相對(duì)誤差均在5%之內(nèi)，產(chǎn)物合成的平均相對(duì)誤差在10%以內(nèi)。當(dāng)初始底物質(zhì)量濃度在70～90 g/L范圍內(nèi)時(shí)，菌體生長(zhǎng)、底物消耗和產(chǎn)物合成模型的相對(duì)誤差均控制在5%以內(nèi)，當(dāng)初始底物質(zhì)量濃度在60和100 g/L時(shí)，菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成的平均相對(duì)誤差均超過(guò)10%，說(shuō)明底物濃度相比發(fā)酵接種量對(duì)發(fā)酵階段菌體生長(zhǎng)的影響更大(表2)。

表1　接種量計(jì)算值與實(shí)驗(yàn)值的相對(duì)誤差

表2　底物濃度計(jì)算值與實(shí)驗(yàn)值的相對(duì)誤差

該模型在初始菌體質(zhì)量濃度(2.76±0.552) g/L、初始底物質(zhì)量濃度(80±10) g/L范圍內(nèi)能得到很好的應(yīng)用。

2.3.2滲透壓對(duì)發(fā)酵動(dòng)力學(xué)參數(shù)影響

2.4　基于發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究的滲透壓調(diào)控策略

基于以上的動(dòng)力學(xué)參數(shù)分析，NaCl對(duì)紐莫康定B0發(fā)酵的影響如下：①降低菌體的生長(zhǎng)速度；②促使底物的消耗流向紐莫康定B0合成方向?？紤]到紐莫康定B0是次級(jí)代謝產(chǎn)物，產(chǎn)物合成需要生物量的積累[16]，因此，研究不同階段NaCl的添加對(duì)產(chǎn)物合成的影響，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知：穩(wěn)定期(12 d)添加1.61 g/L NaCl使紐莫康定B0的產(chǎn)量提升24.6%，與在遲滯期(0天)和對(duì)數(shù)期(4 d)添加1.61 g/L NaCl相比，分別提高21.28%和15.47%。因此，此結(jié)果驗(yàn)證了基于發(fā)酵動(dòng)力學(xué)參數(shù)分析提出的滲透壓調(diào)控策略是可行的。

圖3　 不同生長(zhǎng)階段NaCl添加對(duì)產(chǎn)量的影響 Fig.3　 Effects of NaCl added in different growth phase for production

可以從以下兩個(gè)方面嘗試解釋NaCl對(duì)紐莫康定B0合成存在的雙面影響：①由于紐莫康定B0合成菌株G.lozoyensisQ45屬于海洋絲狀真菌，其天然的生長(zhǎng)環(huán)境本身就存在一定程度的滲透壓，因此NaCl的添加一定程度上模擬了菌體的最適生長(zhǎng)環(huán)境，導(dǎo)致產(chǎn)物合成的增加；②Na+的添加會(huì)改變微生物細(xì)胞膜上Ca2+通道的流量，使得細(xì)胞膜上的磷脂酶信號(hào)被激活，從而影響鈣調(diào)磷激酶響應(yīng)的鋅指蛋白，最終提高胞內(nèi)次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成[17]， 因此，推測(cè)在紐莫康定B0的合成中，Na+也起到同樣效果。

3結(jié)論

根據(jù)不同滲透壓條件下動(dòng)力學(xué)參數(shù)的分析，提出在生長(zhǎng)穩(wěn)定期添加NaCl的調(diào)控策略。在前期維持較高的菌體比生長(zhǎng)速率，使得菌體達(dá)到更高的生物量，在后期添加NaCl溶液，降低菌體用于維持自身代謝的相關(guān)系數(shù)，提高產(chǎn)物合成相關(guān)系數(shù)，使菌體積累足夠生物量的同時(shí)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物的高濃度積累。對(duì)所提出的發(fā)酵控制策略進(jìn)行驗(yàn)證，通過(guò)在穩(wěn)定期中期流加NaCl的策略，產(chǎn)量與80 g/L條件相比，提高24.6%，達(dá)到1.75 g/L。

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(責(zé)任編輯管珺)