交聯(lián)醇脫氫酶聚集體的制備及其在(R)- 4-氯-3-羥基丁酸乙酯合成中的應(yīng)用

沙鳳，顧金海，許琳，嚴(yán)明

(南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211800)

摘要：基于基因組序列數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘新酶的技術(shù)，從白色念珠菌Candida albicans基因組中克隆了一條新型醇脫氫酶(CADH)基因，并在大腸桿菌Escherichia coli Rosetta(DE3)中表達(dá)。為克服游離酶穩(wěn)定性差、不能重復(fù)使用的缺點(diǎn)，探索并優(yōu)化了交聯(lián)醇脫氫酶聚集體(CLEAs-CA)的制備條件。結(jié)果表明：重組CADH對(duì)底物四氯乙酰乙酸乙酯(COBE)的比活力為1.8 U/mg，產(chǎn)物(R)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯((R)-CHBE)的對(duì)映體過(guò)量值大于99%。CLEAs-CA沉淀劑選擇為60%飽和度的(NH4)2SO4，交聯(lián)劑為10 mmol/L戊二醛。在固定化操作前，加入50 mmol/L異丙醇和0.1 mmol/L NAD`+對(duì)CADH催化活性位點(diǎn)、輔酶結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行保護(hù)，CLEAs-CA的活力回收率提高了48.3%。將CLEAs-CA用于不對(duì)稱(chēng)合成(R)-CHBE，經(jīng)過(guò)19次的重復(fù)使用，CLEAs-CA的活性仍保留有50%。

關(guān)鍵詞：(R)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯；醇脫氫酶；交聯(lián)醇脫氫酶聚體；固定化

doi:10.3969/j.issn.1672-3678.2015.06.005

收稿日期：2015-04-28

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)(2011CBA00804)；國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)(2012AA022101)；江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程

作者簡(jiǎn)介：沙鳳(1991—)，女，江蘇靖江人，碩士研究生，研究方向：手性生物催化；嚴(yán)明(聯(lián)系人)，副教授，E-mail:yanming@njtech.edu.cn

中圖分類(lèi)號(hào)：TQ225.24

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1672-3678(2015)06-0024-06

Abstract：A novel alcohol dehydrogenase (CADH) from Candida albicans was discovered by genome data mining for ketoreductases. CADH was cloned and expressed in Escherichia coli Rosetta(DE3). Free enzymes usually have poor stability and are difficult to recover and reuse. To overcome such drawbacks, CADH was immobilized as cross-linked enzyme aggregates (CLEAs-CA) and the optimum conditions of the immobilization process were investigated. The recombinant product (CADH) exhibited specific activity of 1.8 U/mg toward ethyl 4-chloro-3-oxobutanoate (COBE),and the enantiomeric excess purity of (R)-CHBE was over 99%. Ammonium sulfate (60%) and 10 mmol/L glutaraldehyde were chosen as the optimum precipitant and cross-linker for the preparation of CLEAs. Moreover,addition of substrates (50 mmol/L isopropanol and 0.1 mmol/L NAD`+) in the immobilization process enhanced the activity recovery by 48.3% as compared to the CLEAs prepared without substrates. CLEAs-CA could be reused and still remained about 50% of its initial activity after 19 cycles.

Keywords：ethyl(R)-4-chloro-3-hydroxybutanoate; alcohol dehydrogenase; cross-linked enzyme aggregates (CLEAs); immobilization

Preparation of alcohol dehydrogenase cross- linked enzyme aggregates and its application to asymmetric synthesis of (R)-4- chloro-3- hydroxybutanoate

SHAFeng,GUJinhai,XULin,YANMing

(CollegeofBiotechnologyandPharmaceuticalEngineering,NanjingTechUniversity,Nanjing211800,China)

(R)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯((R)-CHBE)是合成L-肉堿(L-carnitine)的前體物質(zhì)，也是(-)-大內(nèi)酰亞胺A((-)-macrolactinA)和(R)-γ-氨基-β-羥基丁酸(GABOB)等手性化合物合成的重要砌塊[1-3]。與傳統(tǒng)的化學(xué)法相比，利用氧化還原酶不對(duì)稱(chēng)還原前手性羰基化合物制備手性醇在催化效率、立體選擇性等方面具有顯著優(yōu)勢(shì)。目前，已有數(shù)種氧化還原酶被報(bào)道能用于不對(duì)稱(chēng)合成(R)-CHBE[5-11]，例如來(lái)源于醛酮還原酶超家族的ARI、CmAR，來(lái)源于短鏈脫氫酶超家族的Gox2036，然而這些酶大都以昂貴的輔酶NADPH作為氫供體。隨著公共基因序列數(shù)據(jù)庫(kù)的迅速增長(zhǎng)，筆者從基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中挖掘了1條來(lái)源于中鏈脫氫酶超家族、以NADH作為氫供體的醇脫氫酶(CADH)基因，隨后構(gòu)建了高效表達(dá)CADH的重組大腸桿菌以及建立了基于底物耦聯(lián)的輔酶循環(huán)再生系統(tǒng)以進(jìn)一步降低(R)-CHBE合成中NAD+的添加量。盡管如此，酶的穩(wěn)定性和重復(fù)使用率仍是酶工業(yè)化應(yīng)用中亟須解決的問(wèn)題。

交聯(lián)酶聚體技術(shù)(cross-linkedenzymeaggregates,CLEAs)[12]是在交聯(lián)酶技術(shù)(cross-linkedenzymes,CLEs)[13]和交聯(lián)酶晶體技術(shù)(cross-linkedenzymecrystals,CLECs)[14]的基礎(chǔ)上提出的一種新型無(wú)載體固定化酶技術(shù)，它僅由沉淀和交聯(lián)兩步驟組成，不需要繁瑣復(fù)雜的酶純化結(jié)晶過(guò)程，操作簡(jiǎn)單、成本低廉、單位體積活性大。這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于青霉素?；?、醇腈酶、脂肪酶、胰蛋白酶和醇脫氫酶[15-16]的固定化。Schoevaart等[17]曾選擇13種酶為研究對(duì)象，考察了不同蛋白沉淀?xiàng)l件及交聯(lián)條件對(duì)CLEAs酶活回收率的影響。研究發(fā)現(xiàn)，CLEAs的制備條件并不具有普適性，因酶來(lái)源的不同呈現(xiàn)較大差異。

為進(jìn)一步奠定醇脫氫酶(CADH)在工業(yè)中應(yīng)用的基礎(chǔ)，本研究中，筆者通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)法，研究沉淀劑種類(lèi)和濃度、交聯(lián)劑濃度和交聯(lián)時(shí)間、NAD+及異丙醇的濃度等因子對(duì)交聯(lián)醇脫氫酶聚集體(CLEAs-CA)酶活力回收率的影響，以確定CLEAs-CA制備的最適條件。此外，筆者也進(jìn)一步考察CLEAs-CA在不對(duì)稱(chēng)合成(R)-CHBE過(guò)程中的穩(wěn)定性。

1材料和方法

1.1　菌株與質(zhì)粒

菌株C.albicansSC5314、E.coliDH5α以及E.coliRosetta保藏于筆者所在實(shí)驗(yàn)室，質(zhì)粒pET-22b(+)購(gòu)自Novagen公司。

1.2　主要試劑及儀器

各種限制性內(nèi)切酶、PrimeSTARHSDNA聚合酶和T4DNA連接酶，寶生物工程(大連)有限公司；細(xì)菌基因組試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、膠回收試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司；PCR引物合成，南京金斯瑞生物科技有限公司。4-氯乙酰乙酸乙酯,Fluka公司；(R)/(S)-4-氯-3羥基丁酸乙酯，Sigma-Aldrich公司；抗生素及其余試劑，生工生物工程(上海)股份有限公司。

PowerWaveXS酶標(biāo)儀，BIO-TEK公司；Centrifuge5804R型高速冷凍離心機(jī)，Eppendorf公司。

1.3　醇脫氫酶 CADH基因在大腸桿菌的克隆和表達(dá)

根據(jù)C. albicansSC5314醇脫氫酶的基因序列(GenBank：KC236900)設(shè)計(jì)引物。上游引物：5′-G￣G￣A￣A￣T￣T￣C￣C￣ A￣ T￣ A￣ T￣ G￣T￣C￣A￣A￣T￣T￣C￣C￣A￣T￣C￣T￣A￣C￣T￣C￣A￣G￣T￣A￣C￣G-3′，下游引物：5′-C￣G￣C￣G￣ G￣ A￣ T￣ C￣ C￣T￣T￣A￣T￣G￣G￣A￣T￣T￣A￣A￣A￣C￣A￣C￣G￣A￣C￣T￣C￣T￣T￣C￣C￣T-3′ (上游、下游引物分別引入NdeⅠ及BamHⅠ酶切位點(diǎn)，劃線處為酶切位點(diǎn))。擴(kuò)增的DNA片段與pET-22b(+)載體進(jìn)行相同限制性內(nèi)切酶酶切，純化后經(jīng)T4DNA連接酶連接并轉(zhuǎn)化至E. coliDH5α，酶切驗(yàn)證后的陽(yáng)性克隆送南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序。將所構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET-22b-adh轉(zhuǎn)化至E. coliRosetta(DE3)中表達(dá)。誘導(dǎo)條件如下：以1%(體積分?jǐn)?shù))的接種量轉(zhuǎn)接到含75μg/mL氨芐青霉素和34μg/mL氯霉素的自誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，取重組菌和對(duì)照菌所處理的粗酶液進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

1.4　交聯(lián)醇脫氫酶聚集體( CLEAS- CA)的制備

1.4.1CADH粗酶液的獲取

E. coliRosetta(pET-22b-adh)在自誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)15h，菌液經(jīng)4 ℃、8 000r/min離心15min后，棄上清，收集的菌體用磷酸鈉緩沖液(pH7.0)清洗2次后懸浮在同樣的緩沖中，使用高壓均質(zhì)機(jī)(-20 ℃、8.0×107Pa)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破碎。細(xì)胞破碎液經(jīng)4 ℃、10 000r/min離心30min后，棄沉淀，上清即為醇脫氫酶CADH的粗酶液。

1.4.2CLEAs-CA制備條件的優(yōu)化

100μL的粗酶液中加入900μL的沉淀劑(根據(jù)沉淀劑的終濃度對(duì)沉淀劑和磷酸鈉緩沖比例進(jìn)行調(diào)整)，混勻，冰上放置30min，加入9mL磷酸鈉緩沖復(fù)溶聚集體，測(cè)定CADH的保留酶活，研究不同種類(lèi)沉淀劑和濃度對(duì)CADH的影響。

1mL的粗酶液中加入9mL的沉淀劑(沉淀劑的種類(lèi)和終濃度的選擇依據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果)，混勻，冰上放置30min，加入不同濃度的戊二醛(5、10、15、20和25mmol/L)混勻，每隔一段時(shí)間(0.5、1、2和3h)取200μL懸濁液檢測(cè)醇脫氫酶交聯(lián)過(guò)程中的保留酶活，研究不同濃度的交聯(lián)劑和交聯(lián)時(shí)間對(duì)CLEAs-CA酶活回收率的影響。

1.5　測(cè)定方法

1.5.1酶活性測(cè)定

蛋白定量采用Bradford法[18]。游離酶及CLEAs-CA的酶活力在100mmol/L、pH7.0磷酸鈉緩沖液中測(cè)定，反應(yīng)體系包括：1mmol/LNADH、10mmol/LCOBE、適量的酶。在30 ℃下檢測(cè)波長(zhǎng)340nm處吸光值變化。一個(gè)酶活力單位(U)定義為每分鐘消耗1μmolNADH所需要的酶量。CLEAs的酶活回收率由(1)式計(jì)算。

(1)

1.5.2COBE及CHBE檢測(cè)方法

分析COBE與CHBE濃度采用氣相色譜法(Agilent7820A)測(cè)定。分析條件：PEG20M毛細(xì)管柱(20m×0.32mm×0.25μm)；載氣為N2，分流比1∶20；氣化和檢測(cè)室的溫度220 ℃，梯度升溫(初始溫度130 ℃，保持3min；以20 ℃/min程序升溫至135 ℃，保持7min；再以40 ℃/min程序升溫至150 ℃，保持3min；再以20 ℃/min程序升溫至160 ℃，保持1min)；檢測(cè)器為FID。

產(chǎn)物對(duì)映體過(guò)量值(e.e.值)的測(cè)定也同樣使用氣相色譜儀，分析條件：色譜柱CP-ChirasilDexCB(25m×0.25mm×0.25μm)；載氣為高純N2，分流比1∶50；進(jìn)樣室和檢測(cè)室溫度250 ℃。產(chǎn)物CHBE的對(duì)映體過(guò)量值(e.e.值)由式(2)計(jì)算：

(2)

式中：cS為(S)-CHBE的濃度，cR為(R)-CHBE的濃度。

2結(jié)果與討論

2.1　 CADH基因的克隆表達(dá)

根據(jù)CADH的基因序列設(shè)計(jì)引物，將PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知：在近1 000bp處有特異性擴(kuò)增條帶，其大小與預(yù)期符合(目的產(chǎn)物約為1 011bp)。酶切鑒定后的陽(yáng)性克隆送南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank中目的序列完全一致。重組大腸桿菌細(xì)胞蛋白的SDS-PAGE電泳見(jiàn)圖2。由圖2可知，表達(dá)的重組蛋白大約為3.67×104，與預(yù)測(cè)的酶蛋白相對(duì)分子質(zhì)量大小一致。酶活測(cè)定結(jié)果：CADH對(duì)底物COBE的比活力為1.8U/mg蛋白，對(duì)異丙醇的比活力為1.9U/mg蛋白。采用氣相色譜對(duì)產(chǎn)物的手性進(jìn)行表征，(R)-CHBE的對(duì)映體過(guò)量值大于99%。與現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的幾個(gè)能夠催化合成(R)-CHBE的酶進(jìn)行氨基酸序列比較發(fā)現(xiàn)，CADH與來(lái)源于Sporobolomyces salmonicolor 的ARI氨基酸序列相似性最高為86%，與來(lái)源于Candida magnoliae 的CR氨基酸序列相似性為54%，與來(lái)源于Bacillus sp.ECU0013的BYueD氨基酸序列相似性僅為39%。

1，5—DL2000 marker；2—CADH gene (1 011 bp)； 3—pET-22b-adh；4—pET-22b；6—NdeⅠ與 BamHⅠ雙酶切質(zhì)粒pET-22b； 7—NdeⅠ與 BamHⅠ雙酶切重組質(zhì)粒pET-22b-adh 圖1　來(lái)源于C. albicans的CADH基因的克隆 Fig.1　Cloning of the CADH gene from C. albicans by PCR

1—標(biāo)準(zhǔn)蛋白； 2—帶有pET-22b質(zhì)粒的 E. coli Rosetta(DE3)超聲得到的可溶性蛋白； 3—帶有pET-22b-adh質(zhì)粒的 E. coli Rosetta(DE3)超聲得到的可溶性蛋白 圖2　 重組大腸桿菌細(xì)胞蛋白的SDS-PAGE電泳 Fig.2　 SDS-PAGE analysis of recombinant protein

2.2　沉淀劑的種類(lèi)和濃度對(duì)CADH酶活力的影響

在制備CLAEs-CA的過(guò)程中，沉淀步驟是利用蛋白沉淀劑(如中性鹽、水溶性有機(jī)溶劑、非離子型高聚物等)將游離酶進(jìn)行物理沉淀獲得酶的聚集體，該操作對(duì)不同酶種的影響有較大差異[17]。因此，考察不同飽和度的(NH4)2SO4、丙酮、乙醇及異丙醇作為沉淀劑，沉淀30 min后加入緩沖復(fù)溶聚集體，測(cè)定其酶活力，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知：異丙醇作為沉淀劑時(shí)，CADH酶活力損失很大，最高酶活力回收率僅為7%；60%飽和度的丙酮以及30%飽和度的乙醇達(dá)到的最高回收率分別是82%和90%；當(dāng)(NH4)2SO4在40%～70%飽和度范圍內(nèi)時(shí)((NH4)2SO4的飽和質(zhì)量濃度為767 g/L)，CADH的酶活力回收率甚至超過(guò)了100%，該現(xiàn)象在其他的酶的沉淀過(guò)程也曾出現(xiàn)，但其機(jī)制尚未分析清楚[17]。60%飽和度的(NH4)2SO4選用為CLAEs-CA制備過(guò)程的最優(yōu)沉淀劑。

圖3　 沉淀劑種類(lèi)和飽和度對(duì)醇脫氫酶 CADH活性的影響 Fig.3　 Effects of different types and saturation of precipitant on the activity of CADH

2.3　交聯(lián)劑濃度及交聯(lián)時(shí)間對(duì)CLAEs-CA酶活力的影響

交聯(lián)步驟是通過(guò)酶聚體分子表面的活性氨基與交聯(lián)劑(一般為戊二醛)的醛基發(fā)生Schiff 堿反應(yīng)，制得顆粒大小為 1～100 μm 的水不溶性 CLEAs。與沉淀步驟相比，交聯(lián)過(guò)程對(duì)酶活力的回收率影響更為顯著。分別選取不同濃度的戊二醛制備 CLEAs-CA，并每隔一定時(shí)間測(cè)定其保留活性，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知：當(dāng)戊二醛(GA)濃度為5 mmol/L時(shí)，交聯(lián)速度緩慢，3 h時(shí)交聯(lián)反應(yīng)仍在繼續(xù)，酶活回收率為15.8%。當(dāng)戊二醛濃度大于15 mmol/L，交聯(lián)速度很快，但相對(duì)的，溶液中過(guò)量的戊二醛導(dǎo)致交聯(lián)酶快速失去活性。戊二醛濃度為10 mmol/L對(duì)CADH的活性影響相對(duì)較小，交聯(lián)2 h時(shí)，CLEAs-CA的酶活回收率也僅為20.1%。這可能是因?yàn)槲於┡c酶活性中心、輔酶結(jié)合位點(diǎn)暴露的關(guān)鍵氨基酸殘基反應(yīng)致使酶活性的急劇下降[19]。已報(bào)道的一種解決方法是在游離酶中加入底物分子，一方面底物結(jié)合在酶的活性中心，誘導(dǎo)酶的構(gòu)象趨向更為活躍的狀態(tài)，并推測(cè)這樣的狀能在隨后的交聯(lián)過(guò)程被固定。另一方面， 酶-底物的復(fù)合物能保護(hù)酶活性中心與輔酶結(jié)合位點(diǎn)，阻止戊二醛與關(guān)鍵氨基酸反應(yīng)，提高活性回收率[20]。

圖4　 交聯(lián)劑濃度和時(shí)間對(duì)CLEAs-CA 酶活 回收率的影響 Fig.4　 Effects of cross-linker concentration and reaction time on the activity recovery of CLEAs-CA

2.4　NAD +和異丙醇濃度對(duì)CLEAs制備的影響

CADH是NAD+依賴的氧化還原酶，對(duì)異丙醇的耐受性優(yōu)于COBE，并且異丙醇與水互溶。因此，筆者考察異丙醇和NAD+對(duì)CLEAs-CA制備的影響，將異丙醇和NAD+分別加入游離酶中以形成異丙醇-酶復(fù)合物或者NAD+-酶復(fù)合物，經(jīng)60%飽和度的(NH4)2SO4沉淀以及10 mmol/L戊二醛交聯(lián)2 h后，測(cè)定CLEAs-CA酶活回收率，結(jié)果見(jiàn)圖5和圖6。由圖5和圖6可知：底物的添加有助于提高固定化酶的回收率，與50 mmol/L異丙醇相比，0.1 mmol/L NAD+提高活力回收更為明顯，說(shuō)明輔酶結(jié)合位點(diǎn)更易受戊二醛影響。另外，同時(shí)添加50 mmol/L異丙醇和0.1 mmol/L NAD+形成三元復(fù)合物，CLEAs-CA酶活回收率最終達(dá)到29.8%(表1)，與不添加底物保護(hù)的固定化過(guò)程相比，固定化酶的酶活回收率提高了48.3%。

圖5　異丙醇濃度對(duì)CLEAs-CA酶活回收率的影響 Fig.5　 Effect of isopropanol concentration on the activity recovery of CLEAs-CA

圖6　 NAD +濃度對(duì)CLEAs-CA酶活回收率的影響 Fig.6　 Effect of NAD + concentration on the activity recovery of CLEAs-CA

實(shí)驗(yàn)c(NAD+)/(mmol·L-1)c(異丙醇)/(mmol·L-1)相對(duì)酶活/%10.15029.8±0.220.1—26.8±0.23—5024.2±0.14——20.1±0.3

2.5　CLEAs-CA不對(duì)稱(chēng)合成( R)-CHBE

固定化酶的活性回收率、穩(wěn)定性是衡量固定化技術(shù)2個(gè)重要指標(biāo)，因此，催化反應(yīng)在100 mmol/L、pH7.0的磷酸鈉緩沖中進(jìn)行，體系由180 mmol/L COBE、270 mmol/L異丙醇、0.1 mmol/L NAD+以及4 U/mL 的CLEAs-CA組成，在此條件下，進(jìn)一步考察CLEAs-CA不對(duì)稱(chēng)合成(R)-CHBE的穩(wěn)定性的影響，結(jié)果見(jiàn)圖7。由圖7可知：首批次反應(yīng)1 h后，底物耗盡轉(zhuǎn)化率達(dá)到99%，氣相檢測(cè)結(jié)果表明固定化酶的立體選擇性未發(fā)生改變。批次反應(yīng)結(jié)束，離心回收固定化酶，緩沖洗滌2次，用于下批次反應(yīng)，并測(cè)定1 h (R)-CHBE的生成速率，用于衡量CLEAs-CA的穩(wěn)定性。由圖7還可知，CLEAs-CA重復(fù)使用6次后并沒(méi)有明顯的活力降低，在重復(fù)使用19次后，CLEAs仍保留50%的催化活性。

圖7　CLEAs催化COBE合成(R)-CHBE Fig.7　 Biosynthesis of (R)-CHBE in the repeated batch biotransformation

3結(jié)論

1)基于基因組序列數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘新酶的技術(shù)，從C.albicans中獲得了1條擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)NAD+依賴的醇脫氫酶基因，并在E.coliRosetta中成功進(jìn)行表達(dá)。CADH對(duì)底物COBE的比活力為1.8 U/mg 蛋白，對(duì)產(chǎn)物(R)-CHBE的對(duì)映體過(guò)量值大于99%。

2)確定了CLEAs-CA制備的最適條件：在固定化操作前，游離酶體系中添加50 mmol/L異丙醇和0.1 mmol/L NAD+，經(jīng)60%飽和度的(NH4)2SO4沉淀以及10 mmol/L戊二醛交聯(lián)2 h，CLEAs-CA酶活回收率為29.8%。將CLEAs-CA應(yīng)用于不對(duì)稱(chēng)合成 (R)-CHBE，固定化酶重復(fù)使用19次后仍能保留50%的催化活性。

參考文獻(xiàn)：

[1] Hikichi S,Hareau G P J,Sato F.Efficient and practical synthesis of optically active 5-t-butyldimethylsiloxy-2-cyclohexenone as a convenient chiral 2,5-cyclohexadienone synthon.Tetrahedron Lett,1997,38(48):8299-8302.

[2]Matsuda T,Yamanaka R,Nakamura K.Recent progress in biocatalysis for asymmetric oxidation and reduction.Tetrahedron:Asymmetry,2009,20(5):513-557.

[3]Bradshaw C W,Fu H,Shen G J,et al.APseudomonassp. alcohol dehydrogenase with broad substrate specificity and unusual stereospecificity for organic synthesis.J Org Chem,1992,57(5):1526-1532.

[4]Ye Q,Ouyang P,Ying H.A review-biosynthesis of optically pure ethyl (S)-4-chloro-3-hydroxybutanoate ester:recent advances and future perspectives.Appl Microbiol Biotechnol,2011,89(3):513-522.

[5]Kataoka M,Sakai H,Morikawa T,et al.Characterization of aldehyde reductase ofSporobolomycessalmonicolor.Biochim Biophys Acta,1992,1122(1):57-62.

[6]Kita K,Matsuzaki K,Hashimoto T,et al.Cloning of the aldehyde reductase gene from a red yeast,Sporobolomycessalmonicolor,and characterization of the gene and its product.Appl Environ Microbiol,1996,62(7):2303-2310.

[7]Wada M,Kawabata H,Kataoka M,et al.Purification and characterization of an aldehyde reductase fromCandidamagnoliae.J Mol Catal B:Enzymatic,1999,6(3):333-339.

[8]Jing K,Xu Z,Liu Y,et al.Efficient production of recombinant aldehyde reductase and its application for asymmetric reduction of ethyl 4-chloro-3-oxobutanoate to ethyl (R)-4-chloro-3-hydroxybutanoate.Prep Biochem Biotechnol,2005,35(3):203-215.

[9]Ni Y,Li C X,Wang L J,et al.Highly stereoselective reduction of prochiral ketones by a bacterial reductase coupled with cofactor regeneration.Org Biomol Chem,2011,9(15):5463-5468.

[10]Liu X,Chen R,Yang Z,et al.Characterization of a putative stereoselective oxidoreductase fromGluconobacteroxydansand its application in producing ethyl (R)-4-chloro-3-hydroxybutanoate ester.Mol Biotechnol,2014,56(4):285-295.

[11]He Y C,Zhang D P,Tao Z C,et al.Discovery of a reductase-producing strain recombinantE.coliCCZU-A13 using colorimetric screening and its whole cell-catalyzed biosynthesis of ethyl (R)-4-chloro-3-hydroxybutanoate.Bioresour Technol,2014,172:342-348.

[12]Cao L,van Langen L,Sheldon R A.Immobilised enzymes:carrier-bound or carrier-free?.Curr Opin Biotechnol,2003,14(4):387-394.

[13]Jansen E F,Olson A C.Properties and enzymatic activities of papain insolubilized with glutaraldehyde.Arch Biochem Biophys,1969,129(1):221-227.

[14]H?ring D,Schreier P.Cross-linked enzyme crystals.Curr Opin Chem Biol,1999,3(1):35-38.

[15]Cao L,van Rantwijk F,Sheldon R A.Cross-linked enzyme aggregates:a simple and effective method for the immobilization of penicillin acylase.Org Lett,2000,2(10):1361-1364.

[16]Sheldon R A.Characteristic features and biotechnological applications of cross-linked enzyme aggregates (CLEAs).Appl Microbiol Biotechnol,2011,92(3):467-477.

[17]Schoevaart R,Wolbers M W,Golubovic M,et al.Preparation,optimization,and structures of cross-linked enzyme aggregates (CLEAs).Biotechnol Bioeng,2004,87(6):754-762.

[18]Bradford M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.Anal Biochem,1976,72(1):248-254.

[19]Mateo C,Palomo J M,van Langen L M,et al.A new,mild cross-linking methodology to prepare cross-linked enzyme aggregates.Biotechnol Bioeng,2004,86(3):273-276.

[20]Cabirol F L,Tan P L,Tay B,et al.Linumusitatissimumhydroxynitrile lyase cross-Linked enzyme aggregates:a recyclable enantioselective catalyst.Adv Synth Catal,2008,350(14/15):2329-2338.

(責(zé)任編輯荀志金)