響應(yīng)曲面優(yōu)化秸稈稀酸水解工藝用于發(fā)酵產(chǎn)殼聚糖

徐晴1，袁瀚2，楊平2，周軍2，李霜1

(1.南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，江蘇南京211800；

2.國家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心，四川瀘州646000)

摘要：為實現(xiàn)利用秸稈水解產(chǎn)生的五碳糖發(fā)酵產(chǎn)殼聚糖，以米根霉為研究對象，研究水解溫度、水解時間、酸濃度等不同預(yù)處理方式獲得的半纖維素水解液對米根霉發(fā)酵產(chǎn)殼聚糖的影響。結(jié)果表明：水解溫度、水解時間對水解液中木糖含量以及甲酸、乙酸、糠醛等抑制劑濃度具有顯著影響，并進(jìn)一步影響后續(xù)發(fā)酵產(chǎn)殼聚糖的生成量。利用響應(yīng)曲面對稀酸水解預(yù)處理條件進(jìn)行優(yōu)化，獲得最佳工藝條件：H2SO4 13.6 g/L，99.5 ℃，水解時間1.91 h，在此條件下預(yù)測殼聚糖發(fā)酵產(chǎn)量為0.79 g/L，實驗驗證產(chǎn)量為0.82 g/L，占菌體生物量的15%～18%。研究結(jié)果為秸稈資源的高效利用及發(fā)酵生產(chǎn)殼聚糖提供新思路。

關(guān)鍵詞：米根霉；半纖維素；木糖；殼聚糖；抑制劑

doi:10.3969/j.issn.1672-3678.2015.06.001

收稿日期：2014-07-14

基金項目：國家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心開放課題(GCKF201112)；國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃)(2012AA022304)

作者簡介：徐晴(1983—)，女，江蘇蘇州人，助理研究員，碩士，研究方向：微生物代謝調(diào)控；李霜(聯(lián)系人)，教授，E-mail:lishuang@njtech.edu.cn

中圖分類號：TQ352

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1672-3678(2015)06-0001-05

Abstract：To optimize the usage of hemicellulose hydrolysate(HH) for chitosan production,the effect of different pretreatment condition of hemicellulose on chitosan production by Rhizopus oryzae was studied.The results showed that high temperature and/or long reaction time had significant effect on the concentration of xylose and inhibitors(formic acid,acetic acid,furfural),resulting influence in chitosan production. Through the quadratic model analyzed by response surface methodology(RSM),the optimal pretreatment condition of hemicellulose for chitosan production was 99.5 ℃,H2SO4 13.6 g/L,1.91 h. Under this condition,chitosan production could reach 0.82 g/L,which was a little higher than the predict value of model (0.79 g/L),and account for 15%-18% of the biomass. The present study would provide a potential route for lignocellulose utilization and chitosan production.

Keywords：Rhizopus oryzae;hemicelluloses;xylose;chitosan;inhibitor

Optimal pretreatment conditions of corn straw for chitosan production by Rhizopus oryzae

XU Qing1,YUAN Han2,YANG Ping2,ZHOU Jun2,LI Shuang1

(1.College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering,Nanjing Tech University,Nanjing 211800,China;

2.National Engineering Research Center of Solid-State Brewing,Luzhou 646000,China)

木質(zhì)纖維素是地球上儲量最豐富的生物質(zhì)可再生資源，廣泛來源于農(nóng)林廢棄物(如玉米秸稈、酒糟、廢木屑等)，它主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成，其中半纖維素組分約占20%～35%。利用稀酸水解法對木質(zhì)纖維素進(jìn)行預(yù)處理，不僅能降解半纖維素組分，還為后續(xù)酶解反應(yīng)提供了較為疏松的底物結(jié)構(gòu)，提高酶解效果。半纖維素組分的水解產(chǎn)物主要以木糖為主，水解過程中伴生的甲酸、乙酸、糠醛等副產(chǎn)物對多數(shù)微生物具有強(qiáng)抑制作用，限制了酸解產(chǎn)物的生物利用。

殼聚糖廣泛存在于甲殼類動物外骨骼和真菌細(xì)胞壁，是一種高附加值的聚合物，具有良好的生物可降解性、生物相容性，被廣泛應(yīng)用于化工、醫(yī)藥等行業(yè)。利用根霉屬、毛霉屬等真菌發(fā)酵法制備的殼聚糖脫乙酰度較高，具有很高的應(yīng)用價值，是殼聚糖產(chǎn)業(yè)的重要發(fā)展方向之一。竇暢等在前期研究中發(fā)現(xiàn)米根霉能高效利用木糖積累生物量，尤其利用秸稈酸解所產(chǎn)的木糖組分時，細(xì)胞壁中殼聚糖含量較高，且酸液中的甲酸、糠醛等“抑制物”在一定濃度下有利于殼聚糖的積累，因此秸稈酸解液有望成為優(yōu)良的殼聚糖發(fā)酵原料。

筆者利用響應(yīng)曲面設(shè)計優(yōu)化半纖維素的酸解預(yù)處理工藝，建立秸稈酸解條件與米根霉發(fā)酵生產(chǎn)殼聚糖的直接關(guān)系，以獲取最適宜于殼聚糖發(fā)酵的秸稈酸解預(yù)處理工藝。

1材料與方法

1.1　菌株

菌種為米根霉(RhizopusoryzaeME-F12)，南京工業(yè)大學(xué)代謝工程實驗室保藏。

1.2　玉米秸稈的酸解處理

將玉米秸稈研磨至粒徑不超過1 mm的顆粒，按固液比為1∶10(g/mL)加不同濃度H2SO4進(jìn)行酸解反應(yīng)，然后加Ca(OH)2調(diào)節(jié)pH至8.0，過濾后得到的清液即為半纖維素水解液?？疾焖鉁囟?X1，℃)、H2SO4質(zhì)量濃度(X2，g/L)和水解時間(X3，h)3個因素對酸解效果的影響，以發(fā)酵殼聚糖產(chǎn)量(Y1，g/L)為響應(yīng)指標(biāo)，利用statistical software package(Stat-Ease Inc.,USA)軟件進(jìn)行中心復(fù)合設(shè)計(central composite design,CCD)，實驗條件如表1所示,每組實驗采用3個平行后取均值進(jìn)行CCD數(shù)據(jù)分析。

1.3　培養(yǎng)條件

將在35 ℃培養(yǎng)6 d的米根霉用無菌水洗脫孢子，獲得孢子懸浮液，按2%(體積分?jǐn)?shù))的接種量將孢子懸浮液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中。發(fā)酵培養(yǎng)基組成：秸稈酸水解液 50 mL，KH2PO40.6 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，尿素2 g/L。pH 自然。在35 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)。

表1　酸水解條件響應(yīng)面設(shè)計

1.4　殼聚糖提取

殼聚糖的分析參照文獻(xiàn)的方法。搖瓶培養(yǎng)獲得的菌體經(jīng)過濾、烘干，加入1 mol/L NaOH，使菌體含量達(dá)25 g/L，121 ℃處理15 min，冷卻，10 000 r/min離心，獲得堿不溶物，洗滌至中性。加入100倍體積的2% (體積分?jǐn)?shù))的乙酸，95 ℃下水解24 h，10 000 r/min離心，上清用NaOH調(diào)pH至9.0，10 000 r/min離心，水洗后分別再用乙醇、丙酮洗滌，獲得殼聚糖。

1.5　酸解液組分的測定

秸稈酸解液組分測定參照文獻(xiàn)的方法,具體測定條件：戴安P680，Chromeleon工作站，Bio-Rad Aminex HPX-87H色譜柱(300 mm×7.8 mm，9 μm)；流動相5 mmol/L H2SO4；流速0.6 mL/min；柱溫60 ℃。甲酸、乙酸采用RID檢測器檢測，糠醛采用紫外檢測器檢測，波長為210 nm。

2結(jié)果與討論

2.1　預(yù)處理條件對秸稈酸解液成分的影響

根據(jù)響應(yīng)面設(shè)計(表1)的方法，對不同酸解條件下的組分進(jìn)行測定，結(jié)果如表2所示。由表2可知：水解液中的主要成分是木糖為8.24～25.24 g/L，其次是葡萄糖(0.77～5.34 g/L)和阿拉伯糖(2.02～4.76 g/L)。水解液中主要的抑制物為甲酸、乙酸、糠醛。

較高的水解溫度和較長的水解時間對糖的降解釋放和抑制物的產(chǎn)生均具有一定的促進(jìn)作用。使用10 g/L的H2SO4，120 ℃水解3 h(第6組實驗)，得到的木糖質(zhì)量濃度最大，為25.24 g/L；而當(dāng)溫度為80 ℃水解3 h(第2組實驗)，木糖質(zhì)量濃度僅為10.75 g/L；當(dāng)H2SO4為30 g/L，120 ℃水解3 h(第8組實驗)，糠醛質(zhì)量濃度達(dá)最大值，為2.79 g/L，而當(dāng)水解時間縮短為1 h(第7組實驗)，糠醛為1.43 g/L。

表2　水解條件下對產(chǎn)物組成的影響

2.2　以殼聚糖產(chǎn)量為指標(biāo)的響應(yīng)面分析

以不同條件下預(yù)處理后獲得的秸稈酸水解液作為碳源，配制培養(yǎng)基用于米根霉發(fā)酵制備殼聚糖，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知：酸解液中木糖濃度高并不意味著殼聚糖產(chǎn)量高，在高木糖濃度(第6～8組實驗，木糖為20.26～25.24 g/L)下，殼聚糖產(chǎn)量相對較低，僅為0.25 g/L左右。殼聚糖的最高產(chǎn)量(0.67 g/L)出現(xiàn)在第11組，該酸解液中木糖含量并不高，為16.32 g/L。真核微生物的細(xì)胞壁在受到外界刺激時，會改變多糖等組分以更好地適應(yīng)環(huán)境。當(dāng)一定濃度的甲酸、乙酸、糠醛存在時，米根霉可能通過合成更多殼聚糖等大分子聚合物增厚細(xì)胞壁，抵御抑制劑對細(xì)胞產(chǎn)生的危害。在第6～8組實驗中，抑制劑甲酸、乙酸、糠醛質(zhì)量濃度較高(1～3 g/L)，抑制劑的大量存在對微生物細(xì)胞產(chǎn)生了毒害作用，如甲酸會破壞細(xì)胞上的疏水位點(diǎn)[10]，從而影響了菌體生長和殼聚糖的合成；而第11組抑制劑組分含量有顯著下降，其濃度恰好與之前研究的有效刺激濃度相符合。因此，僅以木糖濃度為指標(biāo)優(yōu)化秸稈酸解過程用于后續(xù)發(fā)酵是不合適的。水解過程中，抑制劑濃度的變化對后續(xù)菌體生長與殼聚糖合成的影響要大于一定范圍內(nèi)糖濃度變化帶來的影響，因此，優(yōu)化半纖維素水解用于后續(xù)發(fā)酵要更多關(guān)注抑制劑的生成情況。

圖1　 半纖維素水解液培養(yǎng)基中米根霉菌體 生物量及殼聚糖產(chǎn)量 Fig.1　 Mycelia growth and chitosan production in hemicellulose hydrolysate pretreated by different conditions

為了獲取最佳的秸稈酸解工藝，以殼聚糖的產(chǎn)量為響應(yīng)指標(biāo)，對各預(yù)處理條件下的實驗結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，構(gòu)建響應(yīng)面模型，得到殼聚糖產(chǎn)量對水解溫度(X1，℃)、H2SO4濃度(X2，g/L)和水解時間(X3，h)的二次多項回歸模型,見式(1)。

Y1=0.576 259-0.013 413X1-0.060 542X2+

0.005 525X3-0.005X1X2-0.025X1X3+

(1)

表3　三因素對殼聚糖產(chǎn)量影響的顯著性分析

注：R2= 0.932 6; adjustedR2=0.824 1。

此外，16組實驗所生成的響應(yīng)面如圖2、圖3所示，殼聚糖生成量以圖中顏色深淺來區(qū)分，顏色越深，殼聚糖濃度越高。由圖2和圖3可知，殼聚糖產(chǎn)量對于所考察的3個因素的變化趨勢是一致的。隨著水解溫度、H2SO4濃度和水解時間的增長，殼聚糖產(chǎn)量呈現(xiàn)出先增長后減少的趨勢，且殼聚糖產(chǎn)量的最大值落在筆者通過預(yù)實驗所選取的中心點(diǎn)附近，表明響應(yīng)面設(shè)計是成功的。

圖2　 水解溫度和H 2SO 4濃度對殼聚糖產(chǎn)量的影響 Fig.2　 Contour plot of the combined effects of sulfuric acid concentration and temperature on the chitosan production

圖3　 水解溫度和時間對殼聚糖產(chǎn)量的影響 Fig.3　 Contour plot of the combined effects of reaction time and temperature on the final chitosan production

2.3　半纖維素酸解條件優(yōu)化

為獲得最佳的半纖維素水解條件，求解回歸方程的最大值，得到的結(jié)果為H2SO413.6 g/L，99.5 ℃水解1.91 h，此時預(yù)測獲得的殼聚糖產(chǎn)量為0.79 g/L。按上述條件對木質(zhì)纖維素進(jìn)行酸解，水解液用于殼聚糖的發(fā)酵培養(yǎng)以驗證模型的準(zhǔn)確性。實驗結(jié)果表明，在此條件下，水解液中木糖含量為20.45 g/L、乙酸為1.44 g/L、甲酸為0.61 g/L、糠醛為0.31 g/L，而此時發(fā)酵所獲得的米根霉生物量為5.4 g/L，產(chǎn)生的殼聚糖達(dá)0.82 g/L，略高于預(yù)測值，能較好驗證模型的準(zhǔn)確性。

殼聚糖組分約占絲狀真菌生物量的7%～10%左右。因此，要獲得較高的殼聚糖產(chǎn)量，通常需要優(yōu)化培養(yǎng)基或培養(yǎng)方式來提高菌體生物量[11-12]，或者添加刺激物如赤霉素、阿洛酮糖[13]等來促進(jìn)細(xì)胞壁中殼聚糖的積累。以工藝優(yōu)化的秸稈酸解液作為殼聚糖發(fā)酵生產(chǎn)的培養(yǎng)基料，添加尿素、磷酸鹽等組分，培養(yǎng)后獲得的殼聚糖組分占菌體生物量的15%～18% ，這表明通過控制酸解工藝條件可以控制伴生的甲酸、乙酸、糠醛等抑制物組分來有效促進(jìn)殼聚糖的合成。

3結(jié)論

秸稈酸水解工藝的水解溫度、水解時間、酸濃度對木糖及抑制劑(甲酸、乙酸、糠醛等)組分具有較為顯著的影響，其中最利于米根霉發(fā)酵生產(chǎn)殼聚糖的秸稈酸水解工藝參數(shù)：13.6 g/L H2SO4在99.5 ℃下水解1.91 h。利用該條件處理獲得的秸稈酸解液進(jìn)行米根霉發(fā)酵生產(chǎn)殼聚糖，產(chǎn)量可達(dá)0.82 g/L，與模型預(yù)測值相近。結(jié)果表明秸稈酸解液有望成為殼聚糖發(fā)酵生產(chǎn)的重要原料，為秸稈等生物質(zhì)資源的利用拓展了思路。

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(責(zé)任編輯荀志金)