網(wǎng)絡(luò)出版時間：2014-12-4 13:45網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.3969/j.issn.1001-1978.2015.01.022.html

低分子量肝素乙?；锏睦砘匦约捌潴w外抗腫瘤活性研究

梁穎1,2, 段貴新3,劉浩1,2, 蔣志文1,2

(1. 安徽省生化藥物工程技術(shù)研究中心，安徽 蚌埠233030；2.蚌埠醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，安徽 蚌埠233030；3. 蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心胸外科，安徽 蚌埠233004)

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2015.01.022

文章編號：

文獻標志碼：A1001-1978(2015)01-0103-06

中國圖書分類號：R343.9；R329.24；R737.902；R973.2

摘要:目的合成低抗凝血性低分子量肝素乙酰化物(ALMWH)，并對其理化性質(zhì)、抗腫瘤活性進行檢測。方法采用高碘酸鈉氧化，硼氫化鈉還原法對普通肝素(UFH)進行選擇性裂解，制得低抗凝血性低分子肝素(LMWH)，以N,N二環(huán)己基碳二亞胺和二甲氨基吡啶(DCC/DMAP)為催化劑，對其進行乙?；频肁LMWH，經(jīng)X線衍射(XRD)和差示掃描量熱(DSC)試驗，分析其構(gòu)型和理化性質(zhì)。以乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7細胞為模型，檢測其抗增殖、抗侵襲轉(zhuǎn)移能力。利用家兔全血激活凝血時間實驗(ACT)檢測其抗凝血活性。結(jié)果XRD測得ALMWH與LMWH同屬無定形結(jié)構(gòu)，但DSC熱損失曲線和LMWH明顯不同。與LMWH比較，ALMWH含有更多的結(jié)合水較低的抗凝血活性。更有意義的是，在低濃度下ALMWH即表現(xiàn)出較LMWH強的抗腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移的活性。結(jié)論ALMWH抗凝血活性低，具有一定的抗腫瘤增殖及侵襲轉(zhuǎn)移的作用。本研究為低毒性抗腫瘤藥物篩選提供了基礎(chǔ)方法。

關(guān)健詞：低分子量肝素；化學(xué)修飾；乙?；荒[瘤細胞增殖；腫瘤細胞侵襲；抗凝血活性

收稿日期:2014-09-03,修回日期:2014-11-18

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(No 30972864)；安徽省教育廳自然科學(xué)研究重點項目(No KJ2012A202)；安徽省教育廳自然科學(xué)研究一般項目(No KJ2013B140)

作者簡介：梁穎(1965-)，女，碩士，講師，研究方向：化學(xué)合成,Tel: 0552-3150182，E-mail: 768224875@qq.com;

通訊作者蔣志文(1951-)，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向:生化藥理學(xué)，,Tel: 0552-3175321，E-mail: zzwwjj51@aliyun.com; 段貴新(1964-)，男，博士，副教授，研究方向：心肌保護，,Tel: 0552-3175321，E-mail:guixinduan@aliyun.com

硫酸乙酰肝素(HS)是廣泛分布于動物組織中的直鏈狀硫酸化多糖，在胚胎生成、細胞骨架組成、細胞遷徙、創(chuàng)傷愈合、炎癥、腫瘤轉(zhuǎn)移、血管生成等一系列生物反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。體外、體內(nèi)實驗顯示，HS具有確切的抗腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移的作用[1-2]。從豬小腸肥大細胞中提取出來的UFH和HS一樣是以氨基葡萄糖和艾杜醛酸二糖為單位連接起來的硫酸化多糖，該多糖具有較高的抗凝血活性，作為抗凝血藥物廣泛用于臨床。近年來它們所表現(xiàn)的抗腫瘤細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移作用，越來越受到人們的關(guān)注，特別是其結(jié)構(gòu)與抗腫瘤活性之間的關(guān)系已成為研究的焦點[3]。

為了研究肝素酰化位置和抗腫瘤細胞增殖活性之間的關(guān)系，研究人員通過制備多糖銨鹽，然后在高效催化劑二甲氨基吡啶(DMAP)的作用下進行酰化反應(yīng)，得到低抗凝血性低分子肝素丁?；?，這種低分子肝素丁?；锟鼓钚悦黠@下降，而抗增殖活性明顯提高，但是，30 mg·kg-1的給藥劑量，幾乎沒有臨床應(yīng)用可能性[4]。

本實驗參照文獻[5]，氧化還原方法制備低抗凝血性低分子肝素(LMWH)，在此基礎(chǔ)上利用DCC/DMAP催化體系，對該LMWH糖環(huán)上的羥基進行乙酰化，同時對艾杜醛酸的羧基進行酰基脲修飾，制得低抗凝血性的乙?；头肿痈嗡?acetylated low molecular weight heparin, ALMWH)。在X線衍射(XRD)試驗、差示掃描量熱(DSC)試驗，對其結(jié)構(gòu)、構(gòu)型、理化性質(zhì)進行研究基礎(chǔ)上，對其體外抗腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移性能，抗凝血活性進行了檢測。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1人乳腺癌細胞株MDA-MB-231、MCF-7，購自ATCC (Manassas, VA)。蚌埠醫(yī)學(xué)院生化藥理研究室凍存培養(yǎng)。

1.1.2動物及分組新西蘭兔(普通級)，♀，體質(zhì)量(2.3±0.3) kg。隨機分為3組，對照組、LMWHP組和ALMWH組，每組6只。

1.1.3主要試劑MEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、HEPES購于Gibco公司、青鏈霉素、慶大霉素為市售。胎牛血清購于杭州四季青公司。人工重建基底膜材料Matrigel，購于Sigma公司。Transwell小室(24 孔，0.8 μm)購于 Corning公司。市售低分子肝素(LMWHP)購于江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司。100B-ACT監(jiān)測儀(北京科儀誠科技開發(fā)中心)。LMWH和ALMWH(安徽省生化藥物工程技術(shù)研究中心自制，專利號201210574597.1)

1.2方法

1.2.1LMWH和ALMWH的 X 射線衍射(XRD)光譜經(jīng)凝膠滲透色譜測知，由UFH降解而得的LMWH的分子量為5683 g/mol，ALMWH的分子量為7707 g/mol。將得到的LMWH或ALMWH粉末在日本MXPAHF型射線衍射儀上掃描, 電壓40 kV，電流200 mA, TTRAX3θ測角，掃描范圍3～60°，掃描速度8°min-1?？傻玫絃MWH和ALMWH的X射線光譜圖。

1.2.2LMWH及ALMWH的差示掃描量熱(DSC)分析取5 mg ALMWH和LMWH試樣于鋁坩鍋中, N2氣保護。升溫速率為20 ℃·min-1，第1次掃描升溫至160℃，自然冷卻至室溫后，第2次掃描升溫至180℃，得DSC曲線。

1.2.3激活凝血時間參照文獻的方法測定[6]從家兔心臟取血，注入含有檸檬酸鈉的采血管，加藥，注入硅藻土測定管，記錄激活凝血時間(ACT)。

1.2.4抗腫瘤細胞增殖活性測試按(3～7)×104細胞/皿的胞密度接種人乳腺癌MDA-MB-231細胞于含有改良的MEM培養(yǎng)基中(10%的滅活FCS，20 mmol·L-1Hepes，2.0 g·L-1碳酸氫鈉，1×10 IU·L-1青霉素，100 mg·L-1鏈霉素，10 mg·L-1慶大霉素，0.33 mg·L-1胰島素)，37.0℃、95%空氣、5% CO2溫濕環(huán)境下培養(yǎng)。24 h后，吸棄培養(yǎng)液，用無FCS的MEM淋洗細胞2 次，復(fù)換以低血清(0.1%FBS)培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。繼之用0.26、1.29、6.49 μmol·L-1濃度的ALMWH和LMWH處理細胞，于用藥后48 h用胰酶釋放游離細胞，分別收集、計細胞數(shù)。增殖抑制率按下述公式計算：

1.2.5劃痕抗侵襲試驗?zāi)[瘤細胞在體外仍然具有遷移能力，細胞劃痕實驗可以直觀的觀察劃痕后的細胞遷移和侵潤能力。12孔板背面做標記，每隔0.5 cm垂直于橫軸劃痕，每個孔上劃痕3條，取對數(shù)生長期MDA-MB-231細胞，按每個孔15萬個細胞加入孔中，待90%匯合時，沿預(yù)先標記好的線劃痕。用PBS洗去劃痕脫落的細胞，加入含不同藥物的無血清培養(yǎng)基，置于5%CO2，37℃，飽和濕度條件下培養(yǎng)，于0、24 h于倒置顯微鏡下觀察細胞的遷移情況。實驗分陰性對照組、LMWH組、ALMWH組，每孔設(shè)3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次，顯微鏡下觀察細胞遷徙程度，測定細胞的遷移距離。侵襲抑制率按下述公式計算：

1.2.6Transwell 侵襲活性實驗將Materigel 膠與預(yù)冷的無血清MEM 培養(yǎng)基按1 ∶8的比例稀釋，50 μL/孔均勻包被在Transwell 小室底部膜的內(nèi)表面，送入細胞培養(yǎng)箱30 min使之成膠。取對數(shù)生長、且無血清培養(yǎng)基處理12～24 h 的腫瘤細胞，消化離心后，用無血清培養(yǎng)基進行重懸計數(shù)。每個內(nèi)室加入200 μL(含2×104個細胞)含或不含藥物的細胞懸液。于24 孔板即外室中加入700 μL的含5% 胎牛血清的MEM 培養(yǎng)基。在1 h 內(nèi)每隔10 min 觀察一次下室，避免有氣泡產(chǎn)生。然后移培養(yǎng)箱，于37℃、5% CO2、飽和濕度下培養(yǎng)48 h。取出小室，用PBS 清洗兩次，90% 乙醇固定10 min，用PBS 濕潤的棉簽輕輕擦去上室表面未侵襲的細胞，1%結(jié)晶紫染液室溫下染色10 min。PBS漂去多余染料，顯微鏡下每孔隨機取5個視野拍照，計數(shù)并計算抑制率。

2結(jié)果

2.1LMWH和ALMWH的X射線衍射光譜 將得到的LMWH和ALMWH粉末在日本MXPAHFX射線衍射儀上掃描,得到LMWH和ALMWH的X射線光譜圖。從衍射光譜可以看出，兩個非晶鼓包半峰寬并無明顯差距，說明ALMWH和LMWH一樣，仍然屬于非晶結(jié)構(gòu)，ALMWH上的兩個銳鋒是ALMWH分子表面吸附的NaCl的吸收。

Fig 1X-ray diffraction analysis of LMWH and ALMWH

2.2LMWH及ALMWH的差示掃描量熱分析(DSC)如Fig 2所示，LMWH在0~180℃升溫過程中，在(43.68~48.93)℃(該溫度屬于老化溫度)處有一個緩慢的熱吸收。在(148~160)℃有一個強吸熱峰，是LMWH失去結(jié)合水產(chǎn)生的熱吸收。ALMWH的老化溫度明顯變寬，為(41.14~56.60)℃。(103.48~109.32)℃處有個小的吸收，是ALMWH中自由水失水產(chǎn)生的熱吸收，其結(jié)合水失水產(chǎn)生的熱吸收溫度變低，吸收帶變寬，為(117～160)℃，吸收峰變大。提示ALMWH有新的吸水性取代基存在，ALMWH對于水的結(jié)合能力增強。

Fig 2　Differential scanning calorimetry of LMWHP and ALMWH

2.3市售LMWHP和ALMWH的抗凝血活性為了檢驗ALMWH是否降低了抗凝血活性，將市售LMWHP和ALMWH用家兔血漿各配制8個濃度進行ACT測定。結(jié)果如Tab 1所示,ALMWH的抗凝血活性較市售LMWHP明顯降低，尤其在低濃度范圍內(nèi)(0.13～1.04 μmol·L-1)，ALMWH表現(xiàn)出極低的抗凝活性，0.26 μmol藥物濃度的ALMWH與LMWHP比較，LMWHP抗凝活性明顯提高，ALMWH抗凝血活性較LMWHP明顯降低。2.4LMWH和ALMWH抗腫瘤細胞增殖作用LMWH和ALMWH抗腫瘤細胞增殖效應(yīng)的結(jié)果見Fig 3,Fig 4。1.3 μmol·L-1的ALMWH即可對MDA-MB-231、MCF-7細胞的增殖產(chǎn)生明顯的抑制作用，且隨著處理時間的延長，對腫瘤細胞的增殖抑制作用增強。ALMWH對于腫瘤細胞增殖活動呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。

Tab 1　Activated clotting time of LMWHP and ALMWH(ACT)

Note：LMWHP from Commercial LMWH。ALMWH from the acetylation of the LMWH，Standard value: 180-300(S)。*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsLMWHP group

Fig 3Effect of ALMWH on the proliferation of MDA-MB-231

LMWH from UFH was degraded by sodium periodate treatment followed by sodium borohydride reduction. ALMWH was from the acetylation of the LMWH. The results were from 3 separate experiments (totaln=9)*P<0.05,**P<0.01vscontrol, and#P<0.05,##P<0.01vsLMWH.

2.5LMWH和ALMWH的劃痕實驗劃痕實驗是測定腫瘤細胞遷移能力的方法之一。在培養(yǎng)的單層細胞上劃痕，然后加入藥物觀察其對腫瘤細胞遷移的影響。不同藥物對乳腺癌細胞MDA-MB-231細胞遷移能力的抑制見Fig 5、Tab 2。經(jīng)3個不同濃度(3.9、12.9、38.9 μmol·L-1)LWMH處理的MDA-MB-231細胞24 h，細胞保持著活躍的遷移能力，與此相比，3個不同濃度的ALMWH表現(xiàn)出對乳腺癌細胞遷移的明顯抑制，抑制率均達到40%。2.6ALMWH的抗腫瘤細胞侵襲作用ALMWH抑制人乳腺癌MDA-MB-231細胞的侵襲實驗結(jié)果見Fig 6。3.9、12.9、38.9 μmol·L-1的LMWH和ALMWH分別處理MDA-MB-231細胞48 h后，將侵襲和遷移的細胞進行固定染色，分別于200×和400×顯微鏡下拍照并計數(shù)統(tǒng)計(Tab 3)，可見3.9、12.9 μmol·L-1的 LMWH對MDA-MB-231細胞的侵襲無抑制作用，38.9 μmol·L-1的LMWH顯示30%的侵襲抑制率。但ALMWH對于MDA-MB-231細胞的侵襲抑制作用明顯，38.9 μmol·L-1的ALMWH對于MDA-MB-231細胞的侵襲抑制作用達到51%。

Fig 4Effect of ALMWH on the proliferation of MCF-7

The results were from 3 separate experiments (totaln=9)*P<0.05,**P<0.01vscontrol,##P<0.01vsLMWH

Tab 2　Inhibitory effect(%) of LMWH and

Tab 3　Inhibitory effect(%) of LMWH and ALMWH on the

3討論

Fig 5　Effects of ALMWH and LMWH on migration of breast cancer cells(Magnification: 40 times)

Fig 6　Impacts of ALMWH and LMWH on invasive activity of MDA-MB-231 cells

HS具有明顯的抗腫瘤細胞增殖的作用[1-2]。而UFH的這種作用要低得多，且抗凝血活性強，易引發(fā)出血，限制了其作為抗腫瘤藥物的應(yīng)用。HS與UFH在分子結(jié)構(gòu)上的主要區(qū)別在于硫酸化程度與艾杜醛酸的含量。HS的低硫酸化、高乙?；⒌桶湃┧崃?，這種分子結(jié)構(gòu)有利于其與UFH/HS結(jié)合蛋白相互作用，完成多種多樣的生理調(diào)控作用。UFH硫酸化程度高，艾杜醛酸含量高[7]，分子鏈比HS更加柔軟，易曲撓、易旋轉(zhuǎn)[8]。我們用氧化還原方法斷裂了艾杜糖醛酸的C2-C3鍵，使其抗凝血活性大為降低(Tab 1)。在此基礎(chǔ)上利用DCC/DMAP催化體系對LMWH的艾杜醛酸的羧基進行酰基脲修飾，并進行糖環(huán)上羥基的乙?；?，所制得的低抗凝血性的ALMWH，經(jīng)X射線檢測，ALMWH和LMWH雖同屬非晶結(jié)構(gòu)，但DSC分析則證明ALMWH中有新的結(jié)合水與自由水存在，說明對LMWH艾杜醛酸的羧基的酰基脲修飾是成功的。氫核磁1-HNMR檢測顯示ALMWH的2.3 ppm的乙酰基的積分面積比LMWH 2.0 ppm處的積分面積明顯增加，證實LMWH的羥基確產(chǎn)生了乙?；揎?。從艾杜醛酸的一位碳上氫質(zhì)子吸收峰在5.2 ppm處有4個分裂，證實艾杜醛酸亦被選擇性修飾。

市售低分子肝素對乳腺癌細胞的增殖活性的抑制雖呈劑量依賴性，然而在低劑量時作用不明顯[9]。本研究用氧化還原方法制備了LMWH后，用DCC/DMAP催化體系對該LMWH糖環(huán)上的羥基進行乙?；?，所獲得的 ALMWH在低濃度(0.26、1.29、6.49 μmol·L-1)時即表現(xiàn)較之LMWH為大的抗腫瘤細胞增殖作用， 說明通過對LMWH的化學(xué)改造確可提高LMWH的抗癌活性，并能降低其抗凝血活性。

LMWH抗腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移也被業(yè)界公認[10]。低抗凝血性LMWH可以明顯抑制胰腺癌的黏附和轉(zhuǎn)移[11]。但是，其抗轉(zhuǎn)移作用機制并不十分明了。轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜過程，表現(xiàn)為多階段性、多基因參與多種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，并涉及腫瘤細胞異常增殖、黏附、運動、細胞外基質(zhì)降解，血管生成[12-14]。Sudha等[11]用LMWH抑制胰腺癌轉(zhuǎn)移的最低起效給藥劑量為20 mg·kg-1，據(jù)此，用于抑制乳腺癌細胞遷移的濃度選定于3.89、12.98、38.93 μmol。實驗結(jié)果顯示，在該濃度的LMWH對于乳腺癌MDA-MB-231細胞的遷移幾無作用。而同樣3種濃度的ALMWH卻表現(xiàn)出明顯的抗遷移作用。

ALMWH比LMWH具有增強的抗乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖、轉(zhuǎn)移作用?？鼓钚缘停鲅燥L(fēng)險低，與水分子結(jié)合能力強。本研究為低毒性抗腫瘤藥物篩選提供了基本方法。

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Physical and chemical properties of acetylated low molecular weight heparin

and its antineoplastic effectinvitro

LIANG Ying1,2, DUAN Gui-xin3, LIU Hao1,2,JIANG Zhi-wen1,2

(1.AnhuiEngineeringTechnologyResearchCenterofBiochemicalPharmaceuticals,BengbuAnhui233030,China；

2.FacultyofPharmacy,BengbuMedicalCollege,BengbuAnhui233030,China; 3.DeptofCardiothoracicSurgey,

theFirstAffiliatedHospitalofBengbuMedicalCollege,BengbuAnhui233010,China)

Abstract:AimsTo synthesize acetylated low molecular weight heparin(ALMWH) and to detect its physicochemical properties and antineoplastic activity. MethodsLMWH was prepared by degradation of UFH with sodium periodate oxidation and sodium borohydride reduction, then the LMWH was acetylated by acetic anhydride where N,N′, -dicyclohexylcarbodiimide(DCC)and 4-dimethylaminopyridine(DMAP)were used as catalysts. X-ray diffraction(XRD)and Differential Scanning Calorimetry(DSC) of ALMWH were obtained. The antiproliferative activity and anti-invasive activity were determined on MDA-MB-231 and MCE-7 human breast cancer cells. ResultsXRD analysis showed that the LMWH degraded from UFH and ALMWH synthesized by acetylation of LMWH belonged to amorphous structure, however, their DSC curves were significantly different. Compared with LMWH, ALMWH had more powerful capacity for binding water and lowering anticoagulant activity, more significantly ALMWH exhibited stranger anti-proliferative and anti-invasive activity than LMWH, especially when it was used in low concentrations. ConclusionThe synthesized ALMWH possesses a low anticoagulant activity, certain anti-proliferative, anti-invasive and anti-metastatic activity. This study provides a basic method for screening of antineoplastic drug with low toxicity.

Key words: acetylated low molecular weight heparin; chemical modification; acetylation; proliferation; invasion of cancer cells; anticoagulant activity