網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2014-12-4 13:45網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.3969/j.issn.1001-1978.2015.01.031.html

◇研究簡(jiǎn)報(bào)◇

黃芩素對(duì)膽汁外排轉(zhuǎn)運(yùn)體MRP2和BSEP的影響

牛璐，金晶，陳攀，黃民

(中山大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州510006)

Effect of baicalein on expression of MRP2 and BSEP in HepG2 cells

NIU Lu，JIN Jing，CHEN Pan, HUANG Min

(SchoolofPharmaceuticalSciences,SunYat-senUniversity,Guangzhou510006,China)

中國(guó)圖書分類號(hào)：R284.1；R322.47；R341；R392.11；R394.2；R442.4；R575

關(guān)鍵詞：黃芩素；MRP2；BSEP；Nrf2；膽汁淤積；HepG2

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2015.01.031

文章編號(hào)：

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A1001-1978(2015)01-0147-02

收稿日期:2014-09-04,修回日期:2014-10-03

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81102886)

作者簡(jiǎn)介：牛璐(1988-)，男，碩士生，研究方向：藥物代謝與藥代動(dòng)力學(xué),E-mail：niulu20060874@126.com；

通訊作者黃民(1963-)，男，博士，教授，,Tel：020-39943069， E-mail: huangmin@mail.sysu.edu.cn

Key words: baicalein; MRP2; BSEP; Nrf2; cholestasis; HepG2

多藥耐藥相關(guān)蛋白2(MRP2/ABCC2)屬于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族，肝臟細(xì)胞所表達(dá)的MRP2，能介導(dǎo)一些有機(jī)陰離子的轉(zhuǎn)運(yùn)，例如葡萄糖醛酸鹽結(jié)合物等物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)[1]。膽汁酸鹽輸出泵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(BSEP)是肝臟中參與膽汁外排轉(zhuǎn)運(yùn)的另一重要的轉(zhuǎn)運(yùn)體，主要介導(dǎo)單價(jià)膽汁酸、硫酸鹽膽酸等轉(zhuǎn)運(yùn)過程。在肝細(xì)胞中MRP2 和BSEP相互協(xié)調(diào)，可以介導(dǎo)膽汁的排泄，這兩種轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)均可以在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后兩個(gè)水平上受到調(diào)節(jié)[2-3]。有文獻(xiàn)報(bào)道，核轉(zhuǎn)錄因子 Nrf2 可以影響 MRP2 底物的分泌和排泄，Nrf2 能夠在異物的刺激下與 MRP2 基因增強(qiáng)子近端的 ARE 元件結(jié)合而調(diào)控其表達(dá)[4]。

黃芩素(baicalein, BAI)是黃芩干燥根中提取的有效成分，具有多種藥理作用[5-9]。臨床上，中藥黃芩常與多種中藥配伍用于治療膽汁淤積等肝臟疾病，有很好的利膽及助黃疸消退的作用。目前，BAI對(duì)肝臟膽汁外排轉(zhuǎn)運(yùn)體MRP2和BSEP的表達(dá)影響尚無(wú)明確報(bào)道，因此，本研究旨在研究BAI對(duì)MRP2 和BSEP表達(dá)的作用，同時(shí)探討B(tài)AI對(duì)核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2核轉(zhuǎn)位的影響。

1材料與方法

1.1材料人肝癌HepG2細(xì)胞株，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。DMEM培養(yǎng)基和胰酶購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；蘿卜硫素(1-異硫氰酸-4-甲磺?；⊥?，Sulforaphane, SFN) 購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，BAI購(gòu)自上海麗臣生物科技有限公司；MRP2抗體和β-actin抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，BSEP抗體、Nrf2抗體和GAPDH抗體均購(gòu)自美國(guó)CST公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)將 HepG2 細(xì)胞接種于含10% 胎牛血清、雙抗(1×105U·L-1青霉素及100 mg·L-1鏈霉素) 的DMEM培養(yǎng)基, 5% CO2、37 ℃常規(guī)培養(yǎng)。陽(yáng)性對(duì)照藥物SFN及黃芩素均溶解于DMSO溶液中。

1.2.2Real-time PCR將給予藥物處理24 h的細(xì)胞用PBS清洗兩遍之后提取總RNA，并用TaKaRa 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA之后進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。采用相對(duì)Ct值(△Ct)的方法對(duì)目的基因的表達(dá)水平進(jìn)行定量。

1.2.3Western blot 將藥物處理后的HepG2細(xì)胞提取蛋白與核蛋白并采用BCA試劑盒定量，置-80℃保存。每次上樣前99℃變性10 min，以加入8%SDS-PAGE膠(碧云天試劑盒)中進(jìn)行電泳。將凝膠上的蛋白用230mA進(jìn)行恒流電轉(zhuǎn)，GAPDH和Nrf2電轉(zhuǎn)時(shí)間為90 min，PVDF膜；MRP2和BSEP電轉(zhuǎn)時(shí)間為150 min，NC膜，封閉60~120 min。封閉后的電轉(zhuǎn)膜進(jìn)入按比例稀釋好的一抗(GAPDH為1 ∶1 000， MRP2為1 ∶75，BSEP為1 ∶500，Nrf2為1 ∶200),4℃過夜孵育洗膜，置于二抗中室溫孵育60~90 min(兔抗和小鼠二抗按1 ∶1 000稀釋)。最后對(duì)電轉(zhuǎn)膜進(jìn)行曝光成像，分析。

2結(jié)果

2.1黃芩素對(duì)HepG2細(xì)胞中膽汁外排轉(zhuǎn)運(yùn)體 MRP2 和 BSEP 的mRNA表達(dá)影響HepG2細(xì)胞與5 μmol·L-1SFN、10、20、40 μmol·L-1的黃芩素共同孵育 24 h后，5 μmol·L-1SFN 以及20、40 μmol·L-1的黃芩素組 MRP2 和 BSEP 的 mRNA 表達(dá)量有明顯上調(diào)(P<0.05)，提示黃芩素可以誘導(dǎo) MRP2 和 BSEP 的 mRNA 表達(dá)。

2.2黃芩素對(duì)HepG2細(xì)胞中膽汁外排轉(zhuǎn)運(yùn)體 MRP2 和 BSEP 蛋白表達(dá)影響HepG2細(xì)胞與5 μmol·L-1SFN、10、20、40 μmol·L-1的黃芩素共同孵育 24/48 h后，5 μmol·L-1SFN以及10、20、40 μmol·L-1的黃芩素組結(jié)果顯示，MRP2的蛋白表達(dá)量較空白對(duì)照組有明顯上調(diào)，差異有顯著性(P<0.05)；BSEP的蛋白表達(dá)量則沒有明顯變化，差異無(wú)顯著性。

2.3黃芩素對(duì)HepG2細(xì)胞中Nrf2 核轉(zhuǎn)位的影響HepG2細(xì)胞與5 μmol·L-1SFN、10、20、40 μmol·L-1的黃芩素共同孵育12 h后，5 μmol·L-1SFN以及10、20、40 μmol·L-1的黃芩素組結(jié)果顯示，HepG2細(xì)胞核內(nèi)Nrf2蛋白量較空白對(duì)照組有明顯增加。

3討論

許多其他中藥能誘導(dǎo) MRP2 表達(dá)，促進(jìn)膽汁外排，起到保肝利膽作用。如中藥梔子的主要活性成分京尼平苷能有效增強(qiáng) MRP2 介導(dǎo)的利膽作用，從而增強(qiáng)膽紅素的清除，能有效的治療膽汁淤積性疾病及黃疸性疾病[10]；此外，川芎的主要活性成分四甲基吡嗪以及黃連解毒湯等中藥制劑均可以通過調(diào)節(jié) MRP2 的表達(dá)水平而起到利膽、改善膽汁淤積病癥的作用[11]。茵陳蒿湯則能通過上調(diào) BSEP 的表達(dá)，促進(jìn)膽鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)功能的恢復(fù)而治療肝內(nèi)膽汁淤積[12]。

本研究旨在考察黃芩中的主要活性成分黃芩素對(duì) MRP2 和 BSEP 表達(dá)的影響。Real time PCR 結(jié)果表明，在 HepG2 細(xì)胞中，黃芩素可以明顯誘導(dǎo) MRP2和 BSEP 的 mRNA 表達(dá)；Western blot 結(jié)果顯示，黃芩素能夠誘導(dǎo) HepG2 細(xì)胞中 MRP2 的蛋白表達(dá)，對(duì) BSEP 的蛋白表達(dá)水平則無(wú)明顯影響。同時(shí)還研究了黃芩素對(duì) Nrf2 的作用，Western blot 的結(jié)果表明黃芩素可以明顯誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞中 Nrf2 的核轉(zhuǎn)位。在本研究中，HepG2 細(xì)胞中 Nrf2 的核內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)位與 MRP2 蛋白表達(dá)量的變化趨勢(shì)一致，說(shuō)明黃芩素對(duì) MRP2的調(diào)控作用可能與其促進(jìn) Nrf2 核轉(zhuǎn)位有關(guān)，具體過程有待進(jìn)一步研究。BSEP 可以受到 Nrf2 和 FXR 的共同調(diào)控作用[13]，黃芩素對(duì) BSEP 表達(dá)的影響在 mRNA 水平和蛋白水平上出現(xiàn)了不一致的現(xiàn)象，這與 BSEP 受到轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)有關(guān)。

黃芩廣泛的應(yīng)用于臨床上諸多利膽和治療黃疸方劑中，本研究結(jié)果表明，黃芩素可以誘導(dǎo) MRP2 和 BSEP 的基因表達(dá)以及 MRP2 的蛋白表達(dá)，MRP2和 BSEP 表達(dá)的增加可以增強(qiáng)肝細(xì)胞的外排功能，減少肝內(nèi)膽汁中有毒成分的蓄積，這很可能是黃芩在諸多方劑中發(fā)揮作用的機(jī)制。

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