網(wǎng)絡(luò)出版時間：2014-12-4 13:45網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.3969/j.issn.1001-1978.2015.01.024.html

白藜蘆醇預(yù)處理對氧糖剝奪/再復(fù)氧損傷大鼠皮質(zhì)神經(jīng)干細胞增殖的影響

成薇，沈長波，王莉，余萍萍，楊琴

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,重慶400016)

中國圖書分類號：R-332；R284.1；R322.81；R329.24；R845.22

摘要：目的研究白藜蘆醇預(yù)處理對體外氧糖剝奪/再復(fù)氧損傷大鼠皮質(zhì)神經(jīng)干細胞增殖的影響。方法采用懸浮培養(yǎng)法分離純化新生SD大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)干細胞。第3代貼壁培養(yǎng)神經(jīng)干細胞氧糖剝奪150 min后，復(fù)氧培養(yǎng)24 h。實驗分為正常組、對照組、乙醇組和不同濃度白藜蘆醇預(yù)處理組。免疫熒光法鑒定細胞，CCK-8法檢測細胞活力，流式細胞周期及BrdU法檢測細胞增殖。結(jié)果懸浮及貼壁培養(yǎng)細胞均高表達巢蛋白(nestin)。與對照組和乙醇組相比，不同濃度白藜蘆醇預(yù)處理組(1、5、20 μmol·L`(-1))均能明顯增強細胞活力，促進細胞增殖，其中以5 μmol·L`(-1)白藜蘆醇組作用最強(P<0.05)。結(jié)論白藜蘆醇預(yù)處理能減輕氧糖剝奪/再復(fù)氧對神經(jīng)干細胞的損傷，并促進其增殖。

關(guān)鍵詞：白藜蘆醇；不同濃度；預(yù)處理；神經(jīng)干細胞；氧糖剝奪；再復(fù)氧損傷；細胞增殖

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2015.01.024

文章編號：

文獻標志碼：A1001-1978(2015)01-0113-06

收稿日期:2014-09-01,修回日期:2014-10-11

基金項目：國家自然科學(xué)基金面上項目(No 81071119)；國家神經(jīng)病學(xué)臨床重點?？平ㄔO(shè)項目(衛(wèi)辦、醫(yī)政函[2012]649號]2012年)

作者簡介：成薇(1990-)，女，碩士生,E-mail:w289045916@163.com;

通訊作者楊琴(1970-)，女，博士，教授，研究方向：腦血管疾病與干細胞移殖,,E-mail:xyqh200@126.com

Abstract:AimTo study the proliferative effect of resveratrol pretreatment on oxygen-glucose deprivation/reoxygenation(OGD/R)injury of rat cortical neural stem cells(NSCs)in vitro.MethodsIsolation and purification of NSCs in neonatal Sprague-Dawley(SD)rats were conducted by suspended cultivation. The third passage NSCs of adherent culture was cultured under oxygen and glucose deprivation for 150 min and reoxygenation for 24 h. The experimental subjects were divided into normal, control, ethanol and resveratrol pretreatment groups. Immunofluorescence was used to identify NSCs. Cell viability was detected with CCK-8 assay. Flow cytometry cell cycle and BrdU assay were used to measure cell proliferation. ResultsCells both in suspended and adherent cultivation highly expressed neuroepithelial stem cell protein(nestin). Compared with the control group，NSCs viabilities and proliferation in resveratrol groups (1, 5, 20 μmol·L`(-1)) were significantly heightened，and highest in the 5 μmol·L`(-1) resveratrol group (P<0.05). ConclusionResveratrol pretreatment can reduce injury and promote proliferation of NSCs after oxygen-glucose deprivation / reoxygenation.

在發(fā)育和成熟哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)中，神經(jīng)干細胞(neural stem cells，NSCs)的發(fā)現(xiàn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的損傷修復(fù)帶來了希望。在正常狀態(tài)下，成年哺乳動物神經(jīng)生發(fā)區(qū)的NSCs處于靜止狀態(tài)。在各種原因?qū)е履X損害的病理條件下，神經(jīng)生發(fā)區(qū)的NSCs針對環(huán)境的變化被激活，調(diào)整增殖、遷移、分化速度，并整合到靶區(qū)，以促進神經(jīng)功能恢復(fù)。因此，在各種腦損害后，通過各種藥物或方法激活內(nèi)源性NSCs，增強或調(diào)整干細胞的再生反應(yīng)，并遷移至靶區(qū)進一步分化與整合，從而促進神經(jīng)功能恢復(fù)，將是今后內(nèi)源性NSCs動員治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的方向。

白藜蘆醇(resveratrol，Res)是多酚類植物抗毒素， 廣泛存在于葡萄(紅葡萄酒)、桑葚、虎杖、決明子、花生等多種植物中，具有抗氧化、清除體內(nèi)自由基、增強機體免疫以及抗癌、抗菌抗炎等作用，起到降脂、延緩衰老，具有神經(jīng)保護作用[1-2]。在腦缺血的不同時間窗給予Res均可減輕腦缺血性損傷，減少神經(jīng)元凋亡[3-4]。在腦損害后，Res能否激活內(nèi)源性NSCs，促進其增值、遷移、分化、整合呢？ Park 等[5]發(fā)現(xiàn)Res抑制正常神經(jīng)前體細胞的增殖和健康成年大鼠海馬的神經(jīng)發(fā)生，而Moriya 等[6]則發(fā)現(xiàn)Res能增強慢性疲勞小鼠海馬的神經(jīng)發(fā)生，改善疲勞癥狀，減輕海馬萎縮。在缺血性腦損害后，Res能否促進NSCs的增殖呢？目前鮮有報道。因此本實驗擬采用體外氧糖剝奪/再復(fù)氧(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R)損傷模型模擬體內(nèi)腦缺血/再灌注損傷模型，觀察Res預(yù)處理對NSCs增殖的影響。

1材料與方法

1.1實驗動物健康新生1~3 d內(nèi)Sprague-Dawley(SD)大鼠，♀♂不限，由重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK(渝)20070001。

1.2主要試劑DMEM/F-12(1 ∶1)、B-27添加劑購自Gibco公司，D-Hanks液、胎牛血清購自Hyclone公司，堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、表皮細胞生長因子(epidermal growth factor，EGF)購自Peprotech公司，溴脫氧尿苷(5-bromodeoxyuridine，BrdU)購自Suolaibao Technology公司，白藜蘆醇(純度 ≥99%) 購自Sigma公司。 鼠抗Nestin多克隆抗體和BrdU單克隆抗體分別購自Santa Cruz和Cell Signaling Technology公司。FITC和TRITC標記羊抗鼠IgG、山羊封閉血清購自北京中杉金橋公司。CCK-8試劑盒、多聚賴氨酸(Poly-L-lysine)溶液、DAPI染色液購自碧云天生物技術(shù)有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

參考文獻1.3神經(jīng)干細胞的分離培養(yǎng)`([7])的方法，取新生1~3 d內(nèi)SD大鼠，浸入體積分數(shù)為0.75酒精中消毒5 min，無菌條件下剝離全腦，去除小腦，保留余下部分。 DMEM/F12培養(yǎng)液沖洗干凈，仔細剝離大腦皮質(zhì)表面的血管和腦膜，將其剪成約1 mm`3的小塊。吸入離心管，靜置3 min，吸去上清液，1 000×g離心5 min，去除上清液，加體積分數(shù)為0.00125胰蛋白酶，置37℃培養(yǎng)箱中消化30 min，中間搖晃1次，用等體積含體積分數(shù)為0.1胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液終止消化。巴氏管輕輕吹打混勻，用200目鋼篩網(wǎng)濾過，1 000×g離心5 min，去除上清液，加入神經(jīng)干細胞完全培養(yǎng)液(DMEM/F12，體積分數(shù)為0.02 的B27，體積分數(shù)為0.01的青、鏈霉素，濃度為20 μg·L`(-1)的 bFGF和EGF)，巴氏管吹打成單細胞懸液，400目鋼篩網(wǎng)濾過，調(diào)整接種密度為3×10`8~5×10`8·L`(-1)，接種于50 cm`2玻璃培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于37℃、飽和濕度、體積分數(shù)為0.05 CO2培養(yǎng)箱中懸浮培養(yǎng)。每隔2～3 d半量換液，每7 d傳代。每天觀察細胞生長情況。懸浮培養(yǎng)至P3后，接種于預(yù)先用0.1 g·L`(-1)多聚賴氨酸處理過的或其包被過蓋玻片的培養(yǎng)板內(nèi)貼壁培養(yǎng)`([8])，用于后續(xù)研究。

1.4神經(jīng)干細胞氧糖剝奪/再復(fù)氧(OGD/R)損傷模型的構(gòu)建參考已建立的方法[9]，除去神經(jīng)干細胞完全培養(yǎng)液，D-Hanks液清洗3次，將培養(yǎng)液改為D-Hanks液，置于37℃三氣培養(yǎng)箱缺氧150 min，通以體積分數(shù)分別為0.01 O2、0.05 CO2和0.94 N2厭氧混合氣體。氧糖剝奪后將細胞培養(yǎng)液更換為神經(jīng)干細胞完全培養(yǎng)液，并置于37℃、飽和濕度、體積分數(shù)為0.05 CO2培養(yǎng)箱中復(fù)氧培養(yǎng)24 h。

1.5實驗分組實驗分為正常組(normal, Norm)、對照組(control, Ctrl)、乙醇組(ethanol, Eth)和 白藜蘆醇預(yù)處理組(Res)。正常組，貼壁培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞正常培養(yǎng)；對照組，貼壁培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞氧糖剝奪150 min，再復(fù)氧24 h；乙醇組，即Res溶劑對照組， 用含乙醇體積分數(shù)為0.013的完全培養(yǎng)基預(yù)處理貼壁培養(yǎng)神經(jīng)干細胞24 h，再行OGD/R處理；Res預(yù)處理組，用含不同濃度(1、5、20 μmol·L-1) Res的完全培養(yǎng)基預(yù)處理貼壁培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞24 h，隨后行OGD/R處理。

1.6免疫細胞化學(xué)染色除去神經(jīng)干細胞完全培養(yǎng)液，PBS緩沖液漂洗3次，每次5 min。用體積分數(shù)為0.04多聚甲醛室溫固定30 min，PBS漂洗3次；體積分數(shù)為0.001 Triton X-100室溫下破膜30 min， PBS漂洗3次，每次5 min；山羊工作血清室溫封閉30 min，吸去血清，不洗；加入一抗(Nestin 1 ∶100，BrdU 1 ∶200)，陰性對照組用PBS緩沖液替代一抗，4℃過夜；PBS漂洗3次，加入熒光標記二抗(抗體工作濃度1 ∶100)，37℃避光孵育1 h；PBS漂洗3次，DAPI染核3~5 min；再用PBS漂洗3次，體積分數(shù)為0.5甘油封片，倒置熒光顯微鏡照相。

1.7CCK-8法測定細胞活力將傳代的神經(jīng)干細胞球消化成單細胞懸液，接種至96孔培養(yǎng)板，每組6個復(fù)孔，每孔100 μL體系，細胞密度5×103個/孔。OGD/R后，吸去96孔培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)液，每孔避光加入100 μL含體積分數(shù)為0.1 CCK-8溶液的神經(jīng)干細胞完全培養(yǎng)液，37℃孵育4 h后終止培養(yǎng)，搖床室溫振蕩5~10 min。使用空白對照孔調(diào)零，在酶標儀上測定450 nm處吸光度值，結(jié)果以O(shè)D值表示。實驗重復(fù)3次，取3次實驗結(jié)果的平均值作為實驗結(jié)果。

1.8流式細胞學(xué)法檢測細胞周期取對數(shù)期生長的神經(jīng)球，消化成單細胞接種于6孔板內(nèi)，每孔調(diào)整密度至1×106個。氧糖剝奪再復(fù)氧終止后，用體積分數(shù)為0.0025胰蛋白酶將細胞消化成單細胞懸液，體積分數(shù)為0.1胎牛血清中和胰蛋白酶，1 000×g離心5 min，棄去上清液，緩慢加入體積分數(shù)為0.7的 4℃預(yù)冷乙醇固定，4℃固定細胞至少5 h。離心去除乙醇固定液，PBS離心洗滌兩次，加入RNase A 37℃水浴30 min，再加入PI染液混勻，4℃避光孵育30 min，每組檢測1×104個細胞。實驗重復(fù)3次，測定各細胞周期所占百分比。

1.9BrdU法檢測神經(jīng)干細胞增殖收集神經(jīng)干細胞前向培養(yǎng)液中避光加入10 μmol·L-1BrdU 37℃孵育24 h，棄去完全培養(yǎng)液，PBS洗滌3次，每次5 min，體積分數(shù)為0.04多聚甲醛室溫下固定30 min行免疫熒光染色。每組在10×10倍顯微鏡下隨機計數(shù)5個視野下BrdU陽性細胞數(shù)，計算陽性細胞率/%=陽性細胞總數(shù)/活細胞總數(shù) ×100%。

2結(jié)果

2.1神經(jīng)干細胞的鑒定傳代細胞克隆球或消化吹散成的單細胞經(jīng)Nestin間接免疫熒光染色，可見神經(jīng)干細胞特異性標記物Nestin陽性，見Fig 1。

2.2白藜蘆醇對OGD/R損傷后神經(jīng)干細胞活力的影響CCK-8法檢測結(jié)果顯示，正常組(0.838±0.016)細胞活力最高，白藜蘆醇預(yù)處理各組(0.494±0.005、0.570±0.007、 0.489±0.009)細胞活力較對照組(0.460±0.003)和乙醇組(0.455±0.005)明顯增強(P<0.05)，其中濃度為5 μmol·L-1白藜蘆醇組最強，1 μmol·L-1白藜蘆醇組次之，見Fig 2。

Fig 1Identification of neural stem cells

(FITC DAPI, Scale bars =100 μm)

A-C: Neurosphere was identified by the representative marker Nestin (green). B: A neurosphere was observed under a light microscope. D-F: Neural stem cells were identified by the representative marker Nestin (green) as adherent monolayer culture. E: Nuclei were labeled with DAPI

2.3白藜蘆醇對OGD/R損傷后神經(jīng)干細胞增殖的影響 首先采用流式細胞學(xué)法檢測細胞周期。

Fig 2Effects of resveratrol on NSCs viability after OGD/R injury(n=3)

Norm: Normal group; Ctrl: Control (OGD/R) group; Eth: Ethanol group; Res 1: Resveratrol 1 μmol·L-1group; Res 5: Resveratrol 5 μmol·L-1group; Res 20: Resveratrol 20 μmol·L-1group; Blank: Nothing but the NSCs complete medium;▲P<0.05vsNorm;*P<0.05vsCtrl;#P<0.05vsRes 5>

細胞周期分為G0/G1期、S期、G2/M期。其中S期為細胞DNA合成期，代表細胞增殖期，通常與G2/M期(DNA合成后期)百分比之和所占細胞周期比值即增殖指數(shù)[ PI=(G0/G1+S)/(G0/G1+S+G2/M)]表示細胞增殖活性。流式細胞學(xué)法周期結(jié)果顯示，正常組(3.8%±1.9%)細胞增殖指數(shù)PI低于其

Fig 3　Effects of resveratrol on the cell cycle of NSCs after OGD/R injury( n=3)

Norm: Normal group; Ctrl: Control (OGD/R) group; Res 1: Resveratrol 1 μmol·L-1group; Res 5: Resveratrol 5 μmol·L-1group; Res 20: Resveratrol 20 μmol·L-1group;▲P<0.05vsNorm;*P<0.05vsCtrl;#P<0.05vsRes 5

他各組。加入不同濃度的Res，細胞增殖指數(shù)PI(24.2%±5.1%、50.6%±6.6%、18.8%±5.6%)均較對照組(13.7%±3.9%)明顯增高，其中5 μmol·L-1白藜蘆醇組最高(P<0.05)，1 μmol·L-1白藜蘆醇組次之(P<0.05)，表明Res能促進神經(jīng)干細胞增殖，見Fig 3。

其次采用BrdU免疫熒光法檢測細胞增殖。BrdU為胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶在DNA合成期(S期)進入細胞?；铙w注射或細胞培養(yǎng)加入，而后利用抗BrdU單克隆抗體，免疫細胞化學(xué)染色，顯示增殖細胞。結(jié)果顯示，正常組(6.3%±0.4%)BrdU陽性細胞數(shù)百分比低于其他各組。加入不同濃度的Res，細胞BrdU陽性細胞數(shù)百分比(26.8%±1.6%、37.9%±2.6%、16.5%±1.2%)均較對照組(13.5%±1.3%)明顯增高，其中5 μmol·L-1白藜蘆醇組最高(P<0.05)，1 μmol·L-1白藜蘆醇組次之(P<0.05)。結(jié)果也表明白藜蘆醇能促進神經(jīng)干細胞增殖。見Fig 4。

3討論

以往的觀點認為，成年哺乳動物CNS的神經(jīng)再生非常有限，而且隨著年齡的增長，神經(jīng)元數(shù)量會逐漸減少。然而近10余年的研究表明，發(fā)育中和成年哺乳動物室管膜、室下區(qū)、海馬齒狀回顆粒細胞層下區(qū)和嗅球、皮質(zhì)等區(qū)域終身存在具有自我更新和分化功能的神經(jīng)干細胞，神經(jīng)發(fā)生終身存在，這為CNS損傷修復(fù)帶來了新的希望[10]。正常情況下，神經(jīng)生發(fā)區(qū)干細胞處于休眠狀態(tài)。在病理條件下，干細胞被激活、增殖、遷移、分化、整合，從而促進神經(jīng)功能恢復(fù)，但這種能力是有限的。因此，神經(jīng)科學(xué)研究者期望能找到一些藥物或方法促進生發(fā)區(qū)干細胞的增殖、遷移、分化、整合。

Fig 4　Effects of resveratrol on proliferation of NSCs

A-C: Normal group; D-F: Control (OGD/R) group; G-I: Resveratrol 1 μmol·L-1group; J-L: Resveratrol 5 μmol·L-1group; M-O: Resveratrol 20 μmol·L-1group; P: The percentage of BrdU+cells in each group; The proliferation of NSCs(white arrow); Scale bars=75μm;▲P<0.05vsNorm;*P<0.05vsCtrl;#P<0.05vsRes 5

缺血性腦卒中具有致死率、 致殘率、 復(fù)發(fā)率高的特點。如何改善治療、促進腦卒中患者神經(jīng)功能恢復(fù)是神經(jīng)科學(xué)研究者亟待探索解決的重大課題，亦是面臨的最難以逾越的嚴峻挑戰(zhàn)。Res是一種主要存在于葡萄、藜蘆、虎杖等植物中的多酚類物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)地中海地區(qū)飲食習(xí)慣可明顯降低心腦血管疾病的發(fā)生率，其原因是飲食中含豐富的Res[11]。隨后大量的體內(nèi)外實驗均證實Res具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、清除自由基、抗血小板聚集、抗動脈粥樣硬化及神經(jīng)保護等多種藥理活性[12-13]。本實驗在體外采用OGD/R模型模擬體內(nèi)腦缺血/再灌注損傷，觀察Res對NSCs的影響。結(jié)果表明，與正常組相比，體外OGD/R損傷后可引起NSCs增殖。CCK-8法檢測顯示不同濃度Res 20: Res預(yù)處理均可增強OGD/R后NSCs的活力，其中以5 μmol·L-1白藜蘆醇組細胞活力最強，1 μmol·L-1白藜蘆醇組次之。流式細胞學(xué)細胞周期檢測發(fā)現(xiàn)，Res預(yù)處理較對照組能明顯減少NSCs G0/G1期(DNA合成前期)細胞比例，增加S期(DNA合成期)和G2/M期(DNA合成后期)細胞比例，其中5 μmol·L-1白藜蘆醇組最明顯，1 μmol·L-1白藜蘆醇組次之。BrdU增殖檢測也證實Res具有相似效應(yīng)。結(jié)果表明Res呈劑量依賴性地減輕OGD/R對NSCs的損傷，促進NSCs增殖。Harada 等[14]觀察到Res能增強大鼠海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生，改善認知功能障礙。Moriya 等[6]也發(fā)現(xiàn)Res能增強慢性疲勞小鼠海馬的神經(jīng)發(fā)生，減輕海馬萎縮，改善疲勞癥狀。我們的研究結(jié)果與這二者的研究均顯示Res能促進損傷后NSCs的增殖。本課題組前期的體內(nèi)外研究以及文獻報道表明Res能減輕缺血對神經(jīng)元的損傷，減少腦梗死體積，改善神經(jīng)功能[1,3,15-16]。目前的研究又顯示Res能促進損傷后NSCs的增殖。這表明Res可能具有神經(jīng)保護和促神經(jīng)發(fā)生的雙重作用。

本實驗結(jié)果表明，Res預(yù)處理對OGD/R損傷后的大鼠皮質(zhì)NSCs有劑量依賴性促增殖作用。Res能否促進體內(nèi)腦缺血性損傷后NSCs的增殖，從而改善神經(jīng)功能，并且其促增殖的機制又是如何的，則有待進一步研究。

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Effect of resveratrol pretreatment on proliferation of cortical neural stem

cells after oxygen-glucose deprivation/reoxygenation injury in rats

CHENG Wei, SHEN Chang-bo, WANG Li, YU Ping-ping, YANG Qin

(DeptofNeurology,theFirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016，China)

Key words: resveratrol; different concentrations; pretreatment; neural stem cells; oxygen-glucose deprivation; reoxygenation injury; proliferation