網(wǎng)絡出版時間：2014-12-4 13:45網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.3969/j.issn.1001-1978.2015.01.013.html

磷酸化蛋白EBP50通過降低ERK1/2活性抑制乳腺癌細胞MCF-7增殖能力

劉虹，馬艷，邵榮光

(中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)藥生物技術研究所，北京100050)

中國圖書分類號：R329.24；R341；R394.2；R737.9；R977.6

摘要:目的探討磷酸化蛋白EBP50對乳腺癌細胞MCF-7細胞增殖的影響及其潛在機制研究。方法使用pGPU6/Neo載體構建穩(wěn)定敲除EBP50表達的MCF-7細胞株，使用Western blot檢測乳腺癌細胞中EBP50、c-myc、p-ERK1/2以及ERK1/2的表達，使用磺酰羅丹明B染色方法檢測乳腺癌細胞增殖。結(jié)果使用pGPU6/Neo載體可以穩(wěn)定地降低MCF-7細胞中EBP50的表達，敲除EBP50可以促進乳腺癌細胞增殖，同時促進c-myc的表達，上調(diào)ERK1/2的磷酸化水平，但不影響ERK1/2的表達。結(jié)論EBP50可以通過抑制ERK1/2活性，抑制MCF-7乳腺癌細胞增殖能力。

關鍵詞：EBP50； ERK1/2；MCF-7；乳腺癌；增殖；pGPU6/Neo

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2015.01.013

文章編號：

文獻標志碼：A1001-1978(2015)01-0055-05

收稿日期:2014-09-23,修回日期:2014-11-04

基金項目：國家科技部“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(No 2012ZX09301002-01);國家自然科學基金資助項目(No 31401186)；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務專項(No IMBF201407)

作者簡介：劉虹(1985-)，女，博士，助理研究員，研究方向：分子生物學與腫瘤藥理學，Tel：010-83166673，E-mail：liuhong_1006@live.com；

通訊作者邵榮光(1957-)，男，博士，研究員，研究方向：抗腫瘤藥理學，,Tel：010-83166673， E-mail：shaor@imb.pumc.edu.cn

Abstract:Aim To investigate the relationship between phosphoprotein EBP50 and the proliferation of breast cancer in MCF-7 cells. MethodsThe qualified recombinant plasmid sh-EBP50-pGPU6/Neo was transfected into MCF-7 cells with EBP50 knocking down. The expression of EBP50, c-myc, p-ERK1/2, and ERK1/2 was detected by Western blot. The proliferation ability of cells was detected by sulforhodamine B assay. ResultsThe EBP50 knocking down plasmid was constructed successfully. MCF-7 cells with EBP50 knocking down had been established successfully. Knocking down of EBP50 increased the proliferation of MCF-7 significantly, and partially augmented the expression of c-myc and phosphorylation of ERK1/2. However, knocking down of EBP50 did not impact the expression of ERK1/2. ConclusionEBP50 suppresses the proliferation of breast cancer cell through inhibiting the activity of ERK1/2 in MCF-7 cell line.

磷酸化蛋白50[ezrin/radixin/moesin (ERM)-binding phosphoprotein 50，EBP50]是一個多功能連接蛋白，可以通過PDZ-1結(jié)構域、PDZ-2結(jié)構域及EB結(jié)構域與其他蛋白相互結(jié)合，參與細胞的多種生物活動。近年來的研究表明，EBP50的表達與乳腺癌的增殖和轉(zhuǎn)移密切相關。EBP50在乳腺癌細胞MDA-MB-231中含量較低，而在乳腺癌細胞MCF-7中表達較高[1]；上調(diào)EBP50的表達可以降低乳腺癌細胞的增殖及侵襲能力[2]。而一項針對222例乳腺癌患者的研究表明，EBP50的低表達可導致患者存活率降低[3]。以上的文獻說明，在乳腺癌中，EBP50具有潛在的抗腫瘤能力，但抗腫瘤能力并未在上皮樣乳腺癌細胞MCF-7細胞中得到驗證。

有絲分裂原激活激酶(mitogen-activated kinase，MAPK)信號通路在多個物種中高度保守，是重要的細胞增殖與分化的調(diào)節(jié)信號通路。細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)是MAPK信號通路中的主要作用分子，參與并調(diào)控多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展進程[4]。ERK持續(xù)活化可以促進信號傳導與轉(zhuǎn)錄活化因子(signal transducers and activators of transcription，STAT1)降解，從而抑制其促凋亡、抗腫瘤能力[5]。

在本研究中，我們構建了穩(wěn)定干擾EBP50表達的乳腺癌MCF-7細胞株，并對其增殖能力及潛在作用機制進行探討。我們發(fā)現(xiàn)，EBP50可以抑制上皮樣乳腺癌細胞MCF-7的增殖，這種抑制增殖的能力可能是通過抑制ERK1/2的活性實現(xiàn)的。本研究補充了EBP50抑制乳腺癌細胞增殖的分子機制研究，為研究乳腺癌發(fā)生機制提供了一定的理論依據(jù)。

1材料

1.1實驗細胞乳腺癌MCF-7細胞購于中國醫(yī)學科學基礎醫(yī)學研究所細胞培養(yǎng)中心。MCF-7細胞使用 DMEM培養(yǎng)基，10% FBS培養(yǎng)。每隔2 d傳代1次，細胞培養(yǎng)條件為 37 ℃，5% CO2。

1.2主要試劑DMEM細胞培養(yǎng)基、進口血清FBS和胰酶購于美國Gibco公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；真核表達載體pGPU6/Neo為本實驗室保存載體；磺酰羅丹明B試劑盒購于美國Sigma公司；抗人β-actin、EBP50、p-ERK1/2及ERK1/2抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度定量試劑盒購于碧云天生物科技研究所。

2方法

參考文獻2.1穩(wěn)定干擾EBP50表達載體構建實驗方法所示`([6])，在線設計針對 EBP50的siRNA序列，逆轉(zhuǎn)錄合成有效靶序列的DNA，合成序列為：5′-CACCGACCAGAAACGCAGCAGCAAACTTCAAGAGA GTTTGCTGTGGTTTTTTTG-3′。將合成的小片段DNA經(jīng)酶切后與載體pGPU6/Neo相連接，用于構建穩(wěn)定干擾EBP50的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系。 2.2穩(wěn)定干擾EBP50細胞系的建立實驗方法`([6])，具體步驟如下：預先在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)細胞，使細胞在貼壁24 h后處于指數(shù)生長期。將構建好的載體經(jīng)大提質(zhì)粒試劑盒提純后，使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染進入細胞中，待轉(zhuǎn)染后24 h更換為含有真核篩選抗性的培養(yǎng)基。培養(yǎng)約2周后，將細胞消化、重懸，經(jīng)梯度稀釋后接種于96孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)。當細胞在培養(yǎng)孔中形成單克隆集落時，轉(zhuǎn)移至48孔板中擴大培養(yǎng)。2.3Western blot取適量培養(yǎng)細胞，加入RIPA裂解液后振蕩混勻，冰上放置30 min，間或振蕩；4 ℃、4 560×g，離心15 min。取上清，使用蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，其具體步驟參照說明書進行。調(diào)節(jié)蛋白至相同濃度，分裝，加入5倍上樣緩沖液，96 ℃變性10 min，用于SDS電泳；使用Amersham顯色系統(tǒng)顯色，經(jīng)Western blot分析軟件測出各條帶的光密度值并分析`([6])。 2.4磺酰羅丹明B(sulforhodamine B，SRB)法檢測細胞增殖實驗參考文獻方法`([7])，具體步驟如下：在每孔加入50 μL 4℃預冷的TCA溶液固定細胞，TCA溶液的終濃度為10%。靜置5 min移入4℃冰箱中固定1 h，取出，用去離子水沖洗5遍，室溫晾干。待96孔板室溫下晾干后，每孔加入0.4%的SRB染液70 μL，染色30 min后倒掉染液，用1%乙酸沖洗4次，去除未結(jié)合的染料，室溫晾干。用100 μL非緩沖Tris-base堿液溶解與細胞蛋白結(jié)合的染料，水平搖床上振蕩20 min，采用酶標儀540 nm處測定光吸收值。2.5統(tǒng)計學處理實驗結(jié)果以±s表示，兩樣本均數(shù)間比較采用t檢驗。

3結(jié)果

3.1穩(wěn)定干擾EBP50的載體建立將合成的小片段DNA經(jīng)酶切后與載體pGPU6/Neo相連接，轉(zhuǎn)化進大腸桿菌DH5α中進行擴增。然后分別提純空載體Mock以及sh-EBP50質(zhì)粒，進行測序，結(jié)果如下圖所示(Fig 1A)，經(jīng)DNA-MAN軟件比對后證明測序結(jié)果正確(Fig 1B)，說明載體構建成功。

Fig 1Construction of sh-EBP50 plasmid

A: The sequencing results of sh-EBP50 plasmid; B: The comparison results of sh-EBP50 plasmid with application of DNA-MAN.

3.2穩(wěn)定干擾EBP50的乳腺癌細胞株篩選鑒定在穩(wěn)定干擾EBP50細胞株形成的單克隆細胞中，挑選6個克隆細胞檢測其EBP50的蛋白表達水平，以確定其干擾效果。使用空載體Mock組作為空白對照，實驗結(jié)果顯示，與Mock組相比，單克隆A1、A2、A3、B1、B2以及B3細胞株中的EBP50表達有所降低，其中A3以及B3中EBP50表達的降低差異具有顯著性(P<0.01)，而A1及 B1中EBP50的降低差異具有顯著性(P<0.01)，上述結(jié)果說明單克隆A1、A3、B1以及B3細胞株是可以穩(wěn)定干擾EBP50表達的乳腺癌細胞株(Fig 2)。在后續(xù)的研究中，我們選擇A1細胞株作為研究對象(簡稱為sh-EBP50)。

A and B: The MCF-7 cells were stably transfected with sh-EBP50 plasmid. The expression of EBP50 was detected by Western blot.**P<0.01vsMock.

A: The expression of EBP50 was reduced through stably transfecting the sh-EBP50 plasmid. The MCF-7 cells were stably transfected with sh-EBP50 plasmid. The expression of EBP50 was detected by Western blot; B: Silencing EBP50 promotes the proliferation of breast cancer in MCF-7 cell line. The proliferation of sh-EBP50 cells was detected by SRB assay; C: Silencing EBP50 increases the expression of c-myc. The MCF-7 cells were stably transfected with sh-EBP50 plasmid. The expression of c-myc was detected by Western blot.**P<0.01vsMock.

3.3干擾EBP50的表達促進乳腺癌MCF-7細胞增殖 研究表明，EBP50與乳腺癌的增殖密切相關，上調(diào)EBP50的表達可以降低乳腺癌細胞MDA-MB-231的增殖能力[1]。因此，我們檢測了敲除EBP50后對MCF-7乳腺癌細胞增殖的影響。使用SRB實驗結(jié)果顯示，敲除EBP50(Fig 3A)可以明顯地促進乳腺癌細胞的增殖能力(Fig 3B)；而Western blot實驗顯示，敲除EBP50可以促進增殖信號標志分子c-myc的表達(Fig 3C)。以上的實驗結(jié)果顯示，在乳腺癌MCF-7細胞中敲除EBP50可以促進其增殖能力。

3.4干擾EBP50的表達增加乳腺癌細胞中ERK1/2激酶活性ERK包括ERK1與ERK2兩種亞型，均可參與并調(diào)控多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展進程[4]。在本研究中，干擾EBP50表達后可以上調(diào)ERK1和ERK2激酶的磷酸化水平，同時不影響ERK1和ERK2激酶原型的蛋白表達量(Fig 4)，上述實驗結(jié)果說明，敲除EBP50可以激活乳腺癌中ERK1/2的活性。

Fig 4Silencing EBP50 stimulates phosphorylation of

The MCF-7 cells were stably transfected with sh-EBP50 plasmid. The expression of phosphorylation of ERK1/2 and ERK1/2 was detected by Western blot.**P<0.01vsMock.

4討論

大量研究表明，EBP50參與了乳腺癌的增殖和轉(zhuǎn)移。上調(diào)EBP50的表達可以降低乳腺癌細胞的侵襲能力，敲除EBP50可以促進T47D細胞的增殖[2]。此外，EBP50缺失還可以誘導上皮細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)[8]。而在原發(fā)性乳腺癌以及乳腺癌細胞系MDA-MD-231中，EBP50基因發(fā)生錯義突變[2]。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)了敲除EBP50可以促進MCF-7細胞增殖，本文的研究結(jié)果與上述文獻報道相符，本研究補充了EBP50抑制乳腺癌增殖的研究。此外，也有文獻表明，EBP50具有一定的促進腫瘤細胞生長與轉(zhuǎn)移的能力。在胃癌細胞中，EBP50在胞質(zhì)和胞核中均高表達，其表達量與腫瘤的大小呈正相關[9]。在肝細胞癌中，EBP50主要分布于細胞核中，并且可以促進肝細胞癌的生長[10]。在腎細胞癌中，EBP50可以與Ezrin結(jié)合形成蛋白質(zhì)復合物，通過激活Rac1-ARHGEF7信號通路，促進腎細胞癌轉(zhuǎn)移過程[11]。上述文獻表明，EBP50對于腫瘤的調(diào)控作用具有組織差異性，在乳腺癌中，EBP50主要發(fā)揮抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的作用，提示EBP50可以作為研究治療乳腺癌發(fā)生發(fā)展機制的特異性靶點。

myc基因家族是較早發(fā)現(xiàn)的一組癌基因，包括c-myc、n-myc、l-myc。myc基因家族及其產(chǎn)物可促進細胞增殖、永生化、去分化和轉(zhuǎn)化，因而在多種腫瘤形成過程中處于重要地位；而c-myc參與了多種乳腺癌的發(fā)生發(fā)展進程。腫瘤抑制因子(breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1)可以抑制c-myc的轉(zhuǎn)錄活性以及其轉(zhuǎn)化活性，當BRCA1缺失可以導致c-myc的過量表達，從而誘導乳腺癌的發(fā)生[12]。此外，c-myc還是雌激素受體(estrogen receptor，ER)以及表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)信號通路的下游效應分子，因而c-myc的高表達還是導致乳腺癌對輔助治療發(fā)生耐受的重要原因[13]。上述文獻表明，c-myc是乳腺癌細胞增殖過程中重要的生物學標志物，直接反映了乳腺癌細胞的增殖能力，因此在本研究中，我們除了使用SRB染色方式評價乳腺癌細胞的細胞活力以外，還檢測了c-myc的蛋白表達量，共同評價EBP50缺失后對乳腺癌細胞增殖能力的影響。

EBP50還參與了其他多種分子介導的腫瘤增殖過程，例如EGFR[14]、Ⅱ型神經(jīng)纖維瘤分子(neurofibromatosisⅡ，NF2)[15]、血小板衍生生長因子受體(platelet-derived growth factor receptor，PDGFR)[16]等。當EGF刺激激活EGFR誘導MDA-MD-231細胞增殖，過量表達EBP50可以抑制ERK的激酶活性從而抑制MDA-MD-231細胞的增殖[4]，說明EBP50的抑制腫瘤作用可能是通過抑制ERK信號通路實現(xiàn)。此外，抑制ERK還可以降低腫瘤細胞的集落形成[17]，然而上調(diào)EBP50的表達可以通過抑制ERK的激酶活性，降低腫瘤細胞的集落形成[4]。上述研究表明，上調(diào)EBP50的表達可以通過降低ERK的活性，從而抑制腫瘤細胞的增殖與集落形成。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)EBP50缺失后可以促進乳腺癌的增殖，同時上調(diào)ERK1/2的磷酸化水平，我們的實驗結(jié)果從EBP50缺失的角度證明了EBP50可以通過抑制ERK的活性，繼而影響乳腺癌細胞的增殖，補充了EBP50對ERK活性調(diào)節(jié)的關系，及其對乳腺癌細胞增殖的影響。

綜上所述，本研究通過構建穩(wěn)定干擾EBP50表達的MCF-7乳腺癌細胞株，探討EBP50對乳腺癌增殖的影響及潛在的機制。本研究的結(jié)果說明，EBP50可以抑制乳腺癌細胞MCF-7的增殖能力，這可能是通過抑制ERK1/2的活性實現(xiàn)的。本研究補充了EBP50抑制乳腺癌增殖的研究，為闡明乳腺癌的發(fā)生發(fā)展機制提供了一定的指導意義。

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Phosphoprotein EBP50 suppresses proliferation of breast cancer

by inhibiting activity of ERK1/2 in MCF-7 cell line

LIU Hong, MA Yan, SHAO Rong-guang

(DeptofOncology,InstituteofMedicinalBiotechnology,ChineseAcademyofMedicalSciences&

PekingUnionMedicalCollege,Beijing100050,China)

Key words: EBP50; ERK1/2; MCF-7; breast cancer; proliferation; pGPU6/Neo