網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2014-12-4 13:45網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.3969/j.issn.1001-1978.2015.01.002.html

α-突觸核蛋白與Cu2+相互作用的研究進(jìn)展

閆文芬，陳乃宏，苑玉和

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)中心，天然藥物活性物質(zhì)與功能國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，北京100050)

中國(guó)圖書(shū)分類號(hào)：R-05；R341.31；R348.5；R742.5；R745.7

摘要：帕金森病是一種慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其主要的病理特征是黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元丟失，殘存神經(jīng)元胞質(zhì)中出現(xiàn)路易小體，其主要成分是異常聚集的α-synuclein蛋白(α-突觸核蛋白)。α-synuclein的聚集與多種因素有關(guān)，其中金屬離子與α-synuclein結(jié)合可導(dǎo)致蛋白構(gòu)象發(fā)生變化引起蛋白發(fā)生聚集。近年的研究發(fā)現(xiàn)，Cu`(2+)能夠特異地結(jié)合α-synuclein蛋白，并誘導(dǎo)α-synuclein的聚集。該文就Cu`(2+)與α-synuclein相互作用的的結(jié)合位點(diǎn)、結(jié)合模式以及Cu`(2+)在α-synuclein毒性形式中可能發(fā)揮的作用作一綜述。

關(guān)鍵詞:α-synuclein；異常聚集；Cu`(2+)；相互作用；結(jié)合位點(diǎn)；親和力；毒性形式

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2015.01.002

文章編號(hào)：

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A1001-1978(2015)01-0007-04

收稿日期:2014-09-28,修回日期:2014-11-02

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81274122,81102831,81073078,81373997,81373510)；教育部博士點(diǎn)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(No 2012110613000) ;天然產(chǎn)物生物活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能的研究(No IRT1007);北京市自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(No 731013)

作者簡(jiǎn)介：閆文芬(1990-),女，碩士生，研究方向：神經(jīng)藥理學(xué)和神經(jīng)生物學(xué)，Tel/Fax: 010-63165182, E-mail: yanwenfen@imm.ac.cn;

Abstract:Parkinson’s disease(PD) is a chronic degenerative disease of the central nervous system. The pathological hallmarks of PD are the loss of the nigrostriatal dopaminergic neurons and the presence of intraneuronal proteinacious cytoplasmic inclusions, termed “Lewy Bodies” (LBs). Its main component is the abnormal aggregated α-synuclein.Multiple factors have have been shown to affect α-synuclein aggregation. Metal ions combine with α-synuclein can lead to protein conformation changes that inducing protein aggregation.In recent years, the study found that Cu`(2+) could bind specifically to the protein and trigger its aggregation under conditions.It might be relevant for the development of PD.This present review attempts to look at the evidence for coordination，affinity and the physiology function of Cu`(2+) binding to α-synuclein.

陳乃宏(1961- ),男，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向:神經(jīng)系統(tǒng)疾患創(chuàng)新藥物開(kāi)發(fā)及作用機(jī)制，Tel/Fax: 010-63165177, E-mail: chennh@imm.ac.cn;

苑玉和(1971-)，女，博士，副研究員，碩士生導(dǎo)師，研究方向：抗帕金森病創(chuàng)新藥物的研制及相關(guān)機(jī)制，通訊作者，Tel/Fax: 010-63165182, E-mail: yuanyuhe@imm.ac.cn

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一種常見(jiàn)于中老年人的慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。其病因及發(fā)病機(jī)制目前尚不完全清楚，目前主要認(rèn)為是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。PD的主要病理特征是中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元的進(jìn)行性丟失及殘存神經(jīng)元中路易小體(lelly bodies)的形成。路易小體是以α-synuclein為主的多種蛋白聚集形成的包涵體。α-synuclein是腦內(nèi)含量豐富的突觸前蛋白，既參與正常突觸功能的維持，又與多種神經(jīng)退行性疾病有關(guān)，而且該蛋白的異常聚集與PD的發(fā)病密切相關(guān)[1]，可成為抗PD藥物研究作用的靶點(diǎn)。體外研究顯示，金屬離子可以促進(jìn)α-synclein單體向纖維化聚集體的轉(zhuǎn)變，其中Cu2+可以特異地與α-synuclein結(jié)合，形成Cu2+-α-synuclein復(fù)合物，促進(jìn)α-synuclein的多聚化[2-3]。

1α-synuclein的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

Fig 1The characteristic sequence of α-synuclein

人源α-synuclein是由140個(gè)氨基酸殘基組成的可溶性小分子蛋白，主要分布于神經(jīng)元突觸前。正常情況下，它在溶液中沒(méi)有二級(jí)結(jié)構(gòu)，以無(wú)規(guī)則卷曲的形式存在，其氨基酸序列主要包括3個(gè)的區(qū)域(Fig 1)：① 氨基末端：由1~60個(gè)氨基酸殘基組成，該區(qū)域的2/3的序列可以形成一系列雙極性區(qū)域，包括4個(gè)不完全重復(fù)序列(xKTK(E/Q)GVxxxx共有基序)，易形成兩性α螺旋，介導(dǎo)其與含有酸性磷脂的膜結(jié)構(gòu)及蛋白結(jié)合，促使α-synuclein蛋白的天然構(gòu)象改變而發(fā)生錯(cuò)誤折疊。② 中央疏水區(qū)域：包括61～95氨基酸序列，含有非β淀粉樣成分(nonamyloid component,NAC)結(jié)構(gòu)域。該區(qū)域由許多疏水性氨基酸殘基組成，因而具有很強(qiáng)的疏水性，有形成β片層結(jié)構(gòu)的趨向。其中該區(qū)域的第66～74位氨基酸殘基(VGGAVVTGV)被稱為“GAV”基序[4]，是參與α-synuclein聚集必需成分。③ 羧基末端：體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)羧基端缺失的α-synuclein更易聚集，主要原因是該區(qū)域富含脯氨酸等酸性氨基酸，帶大量負(fù)電荷，帶負(fù)電荷的氨基酸殘基抑制了α-synuclein的聚集[5]。因此該區(qū)域?qū)Ρ３枝?synuclein蛋白無(wú)規(guī)則卷曲的單體狀態(tài)發(fā)揮關(guān)鍵作用。

2α-synuclein的聚集

由于α-synuclein的異常聚集，在PD患者體內(nèi)形成了大量不溶性的Lewy bodies(路易小體)和Lewy neurite(路易神經(jīng)突)[6]。α-synuclein在聚集過(guò)程中存在幾種結(jié)構(gòu)狀態(tài):無(wú)規(guī)則結(jié)構(gòu)的單體、中間寡聚物、以及α-synuclein纖維狀多聚體。首先在溶液中，單體的α-synuclein通過(guò)自身異常修飾或者相互作用，蛋白構(gòu)象發(fā)生變化，由以α螺旋為主轉(zhuǎn)變?yōu)楦缓?折疊的寡聚化形式，這類寡聚體相互作用，最終轉(zhuǎn)化為更加穩(wěn)定的纖維化多聚體[7]。

異常聚集的α-synuclein是路易小體的主要組成成分，研究含有路易小體的神經(jīng)元發(fā)現(xiàn)，胞質(zhì)中α-synuclein的聚集體并不是對(duì)所有細(xì)胞都是有毒性,寡聚化的初原纖維 (protofibrils)才是致病的主要原因，這類寡聚體富含β片層結(jié)構(gòu)。Goldberg等[8]在2000年發(fā)表文章也認(rèn)為，單體的α-synuclein對(duì)神經(jīng)細(xì)胞是安全的，多聚化纖維形式的α-synculein毒性也較小，而α-synulein寡聚化的初原纖維構(gòu)象才是最強(qiáng)的毒性形式，是α-synuclein致病的關(guān)鍵，而最終成熟的淀粉樣纖維結(jié)構(gòu)更可能是一種為保護(hù)細(xì)胞功能而形成的一種非活性結(jié)構(gòu)。近年來(lái)研究者普遍認(rèn)為α-synuclein寡聚體的毒性機(jī)制是由于富含β-折疊的寡聚體，可以與膜結(jié)合，在膜上形成孔環(huán)結(jié)構(gòu)，從而增加細(xì)胞膜的通透性，引起鈣離子內(nèi)流、膜內(nèi)包含物的外滲、線粒體膜去極化，進(jìn)而引起細(xì)胞內(nèi)生理代謝功能的紊亂，導(dǎo)致繼發(fā)性的細(xì)胞死亡[9]。

3Cu2+與α-synuclein的相互作用

在生理狀態(tài)下，金屬離子不僅可以穩(wěn)定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，可以參與各種生物氧化還原反應(yīng)，例如親和催化、電子轉(zhuǎn)移等，對(duì)生物體生存至關(guān)重要。然而，當(dāng)金屬離子和一些生物大分子相互作用或者發(fā)生異常的氧化還原反應(yīng)則對(duì)機(jī)體產(chǎn)生很大的傷害[10]。

Cu2+在腦組織主要分布于基底神經(jīng)節(jié)、海馬、小腦以及皮層錐體神經(jīng)元和小腦顆粒神經(jīng)元的胞體和突觸膜等區(qū)域。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中大量的酶發(fā)揮正常生理功能依賴Cu2+作為輔因子。Cu2+的代謝平衡對(duì)維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能至關(guān)重要: Cu2+濃度過(guò)低可引起神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育不完整，過(guò)量則會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞毒性和神經(jīng)損傷。Cu2+-蛋白相互作用以及Cu2+轉(zhuǎn)運(yùn)異常，都可能直接或間接地引發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)疾病。

隨著年齡的增加，Cu2+在腦組織內(nèi)的水平明顯提高。1987年研究發(fā)現(xiàn)，在PD病人腦脊液中Cu2+濃度明顯增高。Gorell等在1999年通過(guò)流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)：長(zhǎng)期接觸金屬銅、鎂、或者鐵等重金屬的工人患PD的幾率要比普通人高。Paik等[11]研究多種金屬離子對(duì)α-synuclein自我寡聚化的影響，結(jié)果顯示，相同條件下，與Mg2+、Al3+、Ca2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Zn2+相比，Cu2+誘導(dǎo)α-synculein聚集形成的寡聚體在Tricine/SDS/PAGE凝膠上呈現(xiàn)一系列梯狀條帶，其相對(duì)分子量分別為17、38、49、66、87、102和118 ku，如果把17 ku作為被除數(shù)，發(fā)現(xiàn)結(jié)果比值分別為1、2.2、2.9、3.9、5.1、6.0、6.9，證實(shí)了寡聚化的α-synculein是由單體α-synculein連續(xù)加聚產(chǎn)生的。與Cu2+誘導(dǎo)α-synculein特異性的寡聚不同，F(xiàn)e2+卻不能誘導(dǎo)蛋白的特異性聚集，在膠上呈現(xiàn)一條模糊的沒(méi)有具體分子量的條帶，與Cu2+形成鮮明的對(duì)比。

3.1Cu2+與α-synculein的相互作用的親和力很多研究表明，金屬離子，尤其是Cu2+，可以通過(guò)影響α-synuclein在PD的發(fā)病中起一定作用。但α-synuclein與Cu2+的相互作用的親和力、結(jié)合位點(diǎn)以及配位結(jié)構(gòu)都不是很清楚。

最初在1999年，Paik所在實(shí)驗(yàn)室最先研究了α-synuclein與Cu2+的親和力，結(jié)果顯示，一個(gè)分子α-synuclein能結(jié)合5~10分子Cu2+，Kd(解離常數(shù))值約為45~60 μmol·L-1。后來(lái)Binolfi等發(fā)現(xiàn)一分子單體α-synuclein只能結(jié)合兩分子Cu2+：其中一分子的結(jié)合比較強(qiáng)，是一個(gè)高親和力的結(jié)合，Kd值在0.1~50 μmol·L-1之間。

相比之下，α-synculein與第二分子Cu2+結(jié)合則在N末端識(shí)別出了2個(gè)解離常數(shù)為0.7和60 μmol·L-1的結(jié)合位點(diǎn)[12]。然而2009年，有研究人員通過(guò)熒光猝滅的方法發(fā)現(xiàn)了另一個(gè)解離常數(shù)為100 nmol·L-1的強(qiáng)的結(jié)合位點(diǎn)[13]。Hong等[14]采用等溫滴定法，在野生型α-synculein中檢測(cè)到一個(gè)解離常數(shù)為約0.2 nmol·L-1的親和力更強(qiáng)的結(jié)合位點(diǎn)。

3.2Cu2+與α-synuclein相互作用的結(jié)合位點(diǎn)金屬離子與蛋白的結(jié)合位點(diǎn)主要存在于帶負(fù)電荷的靜電表面或者疏水性的表面，疏水性的環(huán)境可以增強(qiáng)金屬與蛋白在表面上的相互作用[15]。到目前為止，關(guān)于Cu2+與α-synuclein的結(jié)合位點(diǎn)主要有N-末端區(qū)域、His-50以及帶負(fù)電荷的C-末端區(qū)域。

目前學(xué)者一致認(rèn)為，α-synuclein的N端結(jié)構(gòu)域參與Cu2+的結(jié)合，該結(jié)構(gòu)域含有與Cu2+結(jié)合的特異性位點(diǎn)。2004年，Rasia 等[16]對(duì)Cu2+與α-synuclein的初始結(jié)合的位點(diǎn)進(jìn)行了研究,研究發(fā)現(xiàn)，在α-synuclein N末端的3-9位氨基酸殘基以及49-52位氨基酸殘基存在著一個(gè)高親和力的Cu2+結(jié)合位點(diǎn)，這幾個(gè)氨基酸殘基可以協(xié)調(diào)形成一個(gè)單一的Cu2+配位模式。它的特異性結(jié)合位點(diǎn)包括作為錨定殘基的第50位的His氨基酸殘基和一些位于四方形平面及不規(guī)則的四方幾何上的N/O供體原子。

隨后，Kowalik-Jankowska等[17-18]在2006年通過(guò)電化學(xué)研究發(fā)現(xiàn)Cu2+與α-synuclein幾個(gè)不同的結(jié)合位點(diǎn)可以相互配位，參與配位的基團(tuán)有N-末端的氨基酸、Asp-2的骨架中的酰胺氮、His-50的咪唑基團(tuán)以及Asp-2羧基端的氧原子，他們相互作用形成具有空間結(jié)構(gòu)的配位復(fù)合物。以上研究結(jié)果和Lee 等[19]在2008年的色氨酸熒光猝滅實(shí)驗(yàn)的結(jié)果是一致的，該學(xué)者也發(fā)現(xiàn)Cu2+與α-synuclein結(jié)合優(yōu)先選擇結(jié)合于N-末端區(qū)域的某些位點(diǎn)。但是通過(guò)NMR(nuclear magnetic resonance)研究的結(jié)果卻恰恰相反，結(jié)果顯示Cu2+與α-synuclein結(jié)合形成的復(fù)合物不是各結(jié)合位點(diǎn)相互配位的結(jié)構(gòu)模式，而是分布在N末端、His-50以及C末端帶負(fù)電荷的氨基酸殘基的的一些獨(dú)立的結(jié)合位點(diǎn)，彼此之間是沒(méi)有關(guān)聯(lián)的[20]。

關(guān)于His50以及C末端是否參與Cu2+與α-synuclein的結(jié)合一直存在著很大的爭(zhēng)議。最初研究者認(rèn)為C末端存在Cu2+結(jié)合的位點(diǎn)。然而進(jìn)一步分析Cu2+與α-synuclein截?cái)囿w表明，C末端雖然存在Cu2+與α-synuclein的結(jié)合位點(diǎn)，但是其結(jié)合是一個(gè)低親和力的結(jié)合，C末端的119-123位的羧基可能是銅結(jié)合的有效結(jié)構(gòu)域。Lee等[19]使用色氨酸熒光測(cè)量的方法得到了不同于前人的結(jié)果，他們認(rèn)為通過(guò)Cu2+與α-synuclein的結(jié)合在N末端的高親和力的結(jié)合位點(diǎn)既不包括第His-50的氨基酸參加，也沒(méi)有第39位、94位、125位色氨酸，是通過(guò)相互靠近形成球形的多肽配位點(diǎn)。他們認(rèn)為Cu2+與α-synuclein的緊密結(jié)合位點(diǎn)是包括Met-1的α-氨基酸、Asp-2的羧基、還有來(lái)自肽段骨架的去質(zhì)子酰胺基和羧基組；他們還認(rèn)為在富含羧基的C末端也可以配位等量的Cu2+，但是與N末端的結(jié)合相比，其親和力則下降了近300倍。

3.3Cu2+促進(jìn)α-synuclein的聚集Cu2+是神經(jīng)退行性疾病中研究最多的金屬之一，它在不同的疾病中發(fā)揮著不同的生物學(xué)作用。如在AD和PD中，Cu2+可以破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，發(fā)揮有害的作用。一方面，在PD患者中，Cu2+的氧化還原活性被認(rèn)為是PD病理進(jìn)展的一個(gè)重要因素，因?yàn)樗墚a(chǎn)生自由基和促進(jìn)氧化還原活性。而且伴隨著體內(nèi)金屬離子的失衡，由Cu2+誘導(dǎo)的α-synuclein的寡聚化增加也是PD等神經(jīng)退行性疾病進(jìn)展的關(guān)鍵所在。

Cu2+具有促使α-synuclein形成自身寡聚體的的作用，研究學(xué)者Brown等[21]研究所獲得的數(shù)據(jù)顯示，Cu2+同時(shí)結(jié)合α-synuclein的N-或C-末端時(shí)，會(huì)形成α-synuclein的寡聚體。而且全長(zhǎng)α-synuclein與Cu2+特異性結(jié)合時(shí)，α-synuclein可以形成一個(gè)獨(dú)特的寡聚體種類。這種寡聚體形式可能代表了α-synuclein毒性形式。接著他們通過(guò)處理形成聚集的α-synuclein，將合成的α-synuclein纖維、寡聚體及單體的混合物應(yīng)用到SH-SY5Y細(xì)胞中，結(jié)果顯示只有在Cu2+存在時(shí)，所形成的α-synuclein蛋白的聚集體才是有毒性的，由此表明Cu2+在α-synuclein介導(dǎo)的毒性作用中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。

有研究人員認(rèn)為細(xì)胞內(nèi)寡聚體和胞內(nèi)Cu2+的利用率相關(guān)，Cu2+誘導(dǎo)的α-synuclein的寡聚體可以引起細(xì)胞死亡。在低Cu2+濃度環(huán)境下，α-synuclein可以直接與膜結(jié)合；但是當(dāng)Cu2+的水平升高時(shí)，α-synuclein的寡聚體形成增加而且聚集形成路易小體，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡造成細(xì)胞存活率的下降。這說(shuō)明，當(dāng)Cu2+濃度增加時(shí)，能與α-synuclein結(jié)合的Cu2+含量也增加，胞內(nèi)的α-synuclein更容易變成有毒性的寡聚體形式。這種情況并不需要Cu2+的整體濃度升高，僅僅局部的可利用的Cu2+的濃度增加或者Cu2+結(jié)合α-synuclein的結(jié)合位點(diǎn)的增多便會(huì)發(fā)生[21]。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性與蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生的轉(zhuǎn)變密切相關(guān)。曹劍等利用分子動(dòng)力學(xué)模擬的方法揭示了Cu2+結(jié)合α-synuclein肽段可降低α-synuclein構(gòu)象的自由能，極大地增加了其疏水殘基的暴露程度，使得α-synuclein肽段因疏水作用更傾向于形成β-折疊片結(jié)構(gòu)，從而誘導(dǎo)α-synuclein構(gòu)象由無(wú)序向有序轉(zhuǎn)變，驅(qū)動(dòng)其疏水性聚集，使得α-synuclein肽段自聚集的概率增大。

金屬催化的氧化反應(yīng)參與了細(xì)胞死亡的過(guò)程。α-synuclein也是金屬結(jié)合蛋白，可以參與金屬離子介導(dǎo)的氧化還原反應(yīng)。而且Cu2+與α-synuclein形成的復(fù)合物也有氧化還原活性。α-synuclein一方面可以與Cu2+結(jié)合，將Cu2+還原成Cu+，同時(shí)將分子氧催化形成氧化氫，形成ROS，對(duì)PD腦組織產(chǎn)生氧化損傷，ROS介導(dǎo)的細(xì)胞損傷是神經(jīng)退行性疾病早期的病理變化之一，因此，α-synuclein與Cu2+結(jié)合產(chǎn)生的ROS造成的氧化應(yīng)激也是PD的發(fā)病機(jī)制之一。

4展望

迄今為止，α-synuclein蛋白的生理功能并不清楚，目前研究的結(jié)果顯示，α-synuclein對(duì)Cu2+的結(jié)合表現(xiàn)出極強(qiáng)的選擇性。這表明α-synuclein可能具有Cu2+轉(zhuǎn)運(yùn)和平衡調(diào)控的功能。此外，α-synuclein的錯(cuò)誤折疊需要在一定的環(huán)境條件，而腦組織中Cu2+濃度的局部升高則可以提供這一環(huán)境。因此研究Cu2+與α-synuclein相互作用特性以及由此引起的α-synuclein寡聚體增加對(duì)細(xì)胞造成的毒性，將有助于人們對(duì)α-synuclein生理功能的深入理解，使α-synuclein成為PD潛在的治療靶點(diǎn)[22]，并在分子水平上為闡明PD的發(fā)病機(jī)制提供更多的理論依據(jù)。

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Research progress of the interaction of α-synuclein proteins and Cu2+Ion

YAN Wen-fen,CHEN Nai-hong,YUAN Yu-he

(NeuroscienceCenterofChineseAcadmyofMedicalSciences,StateKeyLaboratoryofBioactiveSubstance

andFunctionofNaturalMedicines,InstituteofMateriaMedica,ChineseAcademyofMedicalSciencesand

PekingUnionMedicalCollege,Beijing100050,China)

Key words：α-synuclein；abnormal aggregation；Cu2+；interaction; binding site；affinity；toxicity

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