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miRNA-25對人食管鱗狀細胞癌細胞株TE1增殖的影響

2016-01-11 01:49:52張偉,周勇慧,龐一強
中國病理生理雜志 2015年11期
關(guān)鍵詞:鱗狀細胞周期空白對照

miRNA-25對人食管鱗狀細胞癌細胞株TE1增殖的影響

張偉1,2△,周勇慧3,龐一強4

(內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院1病理教研室,2第一附屬醫(yī)院病理科,3第一附屬醫(yī)院普外科二病區(qū), 內(nèi)蒙古 包頭 014010;4包頭市第四醫(yī)院神經(jīng)外科, 內(nèi)蒙古 包頭 014030)

[摘要]目的: 探討過表達/沉默微小RNA-25(microRNA-25,miRNA-25)對人食管鱗狀細胞癌細胞株TE1增殖能力的影響及其作用機制。方法: RT-PCR檢測各臨床樣品組織中miRNA-25的表達水平。建立miRNA-25過表達/沉默的TE1細胞株,采用CCK-8法、BrdU實驗和流式細胞術(shù)檢測TE1細胞增殖能力的變化及細胞周期狀態(tài);Western blot法和RT-PCR法檢測細胞周期調(diào)控因子細胞周期蛋白E1(cyclin E1)和細胞周期蛋白依賴性激酶2(CDK2)的蛋白與mRNA表達水平。結(jié)果: miRNA-25在食管黏膜組織中具有特異性表達并在TE1細胞中呈高表達。CCK-8法和BrdU實驗結(jié)果顯示過表達miRNA-25的TE1細胞的增殖能力顯著增加(P<0.05),而沉默miRNA-25抑制TE1細胞的增殖;流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示過表達miRNA-25可明顯促進TE1細胞從G0/G1期向S期轉(zhuǎn)換,沉默miRNA-25則抑制其轉(zhuǎn)換。同時Western blot和RT-PCR實驗結(jié)果顯示過表達miRNA-25后,cyclin E1和CDK2的蛋白和mRNA表達水平均顯著增加(P<0.05),沉默miRNA-25后則顯著減少(P<0.05)。結(jié)論: miRNA-25能夠促進人食管鱗狀細胞癌細胞株TE1的增殖,其作用機制可能與促進細胞周期轉(zhuǎn)換及上調(diào)cyclin E1和CDK2的表達水平有關(guān),提示miRNA-25可作為治療食管鱗狀細胞癌的一個潛在靶點。

[關(guān)鍵詞]微小RNA-25; 人食管鱗狀細胞癌細胞株TE1; 細胞增殖; 細胞周期蛋白E1; 細胞周期蛋白依賴性激酶2

[中圖分類號]R363.1+4[文獻標(biāo)志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.11.009

Effects of miRNA-25 on proliferation of human esophageal squamous-cell carcinoma cell line TE1ZHANG Wei1,2, ZHOU Yong-hui3, PANG Yi-qiang4

(1DepartmentofPathophysiology,2DepartmentofPathology,FirstAffiliatedHospital,3WardIIofGeneralSurgeryDepartment,FirstAffiliatedHospital,BaotouMedicalCollege,InnerMongoliaUniversityofTechnology,Baotou014010,China;4DepartmentofNeurosurgery,FourthHospitalofBaotou,Baotou014030,China.E-mail:xbkld@163.com)

ABSTRACT[]AIM: To investigate the effects and mechanisms of microRNA-25 (miRNA-25) on the proliferation of human esophageal squamous-cell carcinoma cell line TE1. METHODS: The abundance of miRNA-25 in different tissues was measured by RT-PCR. After silencing or over-expression of miRNA-25 with mimics or inhibitor in TE1 cells, the cell proliferation, cell cycle distribution and the expression of cyclin E1 and cyclin-dependent kinase 2 (CDK2) at mRNA and protein levels were measured by CCK-8 assay, BrdU detection, flow cytometry, RT-PCR and Western blot, respectively. RESULTS: miRNA-25 was prominent in esophageal mucosal tissue and highly expressed in TE1 cells (P<0.05). Over-expression of miRNA-25 increased TE1 cell proliferation, promoted the cell cycle progression and enhanced the entrance of the cells into S phase (P<0.05). Inverse results were obtained after down-regulation of miRNA-25 (P<0.05). Furthermore, the expression of cyclin E1 and CDK2 at mRNA and protein levels was significantly increased after over-expression of miRNA-25, but decreased after down-regulation of miRNA-25 (P<0.05). CONCLUSION: miRNA-25 enhances cell cycle transition by increasing the expression of cyclin E1 and CDK2, thus accelerating TE1 cell proliferation. This study provides a novel mechanism by which miRNA-25 increases the proliferation of human esophageal squamous-cell carcinoma cell line TE1, suggesting that down-regulation of miRNA-25 may be a potential new therapeutic strategy for treating esophageal squamous-cell carcinoma.

[KEY WORDS]MicroRNA-25; Human esophageal squamous-cell carcinoma cell line TE1; Cell proliferation; Cyclin E1; Cyclin-dependent kinase 2

依據(jù)全球惡性腫瘤統(tǒng)計資料顯示,食管癌的5年生存率小于15%[1],死亡率排名第4位,是常見的十大惡性腫瘤之一[2]。其發(fā)病率具有顯著的人群種族差異。食管癌主要分為食管腺癌(esophageal adenocarcinoma,EA)和食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous-cell carcinoma,ESCC),其中鱗狀細胞癌占食管癌的90%以上。食管鱗狀細胞癌的發(fā)生尚無確定病因,可能由多種因素綜合作用,主要有吸煙、酗酒、空氣污染、病毒感染等,且發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增加的趨勢。目前的治療手段主要有手術(shù)、放射治療、化學(xué)治療以及手術(shù)與放射治療結(jié)合[3]。

目前已發(fā)現(xiàn)約有一萬多種miRNAs,廣泛存在于動物、植物及病毒等不同的細胞和組織中,表達形式各異[4]。近年研究發(fā)現(xiàn)microRNA(miRNA)可能作為一種潛在的腫瘤早期診斷指標(biāo)以及潛在治療靶點。miRNA-25在多種腫瘤組織中存在異常表達。miRNA-25屬于miRNA-106b-25簇,有研究表明該家族成員在人類腦內(nèi)呈高表達狀態(tài),并在癌癥的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[5]。本研究建立了過表達/沉默miRNA-25的人食管鱗狀細胞癌細胞株TE1,通過CCK-8法、流式細胞術(shù)方法檢查癌細胞周期變化,以及Western blot和RT-PCR檢測TE1細胞的周期調(diào)控因子細胞周期蛋白E1(cyclin E1)及細胞周期蛋白依賴性激酶2(cyclin-dependent kinase 2, CDK2)的蛋白與mRNA表達的變化,探討miRNA-25表達的變化對食管鱗狀細胞癌發(fā)生發(fā)展的潛在影響。

材料和方法

1材料與試劑

胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基和Opti-NEM培養(yǎng)基購于Gibco;LipofectamineTMRNAiMAX購于Invitrogen;人食管鱗狀細胞癌細胞株TE1購于中國科學(xué)院上海細胞庫;cyclin E1和CDK2抗體購于Santa Cruz;BrdU細胞增殖分析試劑盒購于Chemicon;miRNA-25-mimic/inhibitor由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成;其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

2樣本收集

收集內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院2012年8月~2014年2月食管鱗狀細胞癌患者的腫瘤組織及癌旁組織樣本49例,另取正常食管黏膜組織46例、正常鼻咽黏膜組織40例、正常胃黏膜組織38例、正常腸黏膜組織37例和正常卵巢組織29例,樣本年齡均大于18歲。所有組織樣本存放于-80 ℃液氮中保存。所有活體組織經(jīng)內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理專家診斷證實,臨床標(biāo)本的獲取經(jīng)倫理委員會同意,患者簽署知情同意書。

3實驗方法

3.1細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和分組將TE1細胞置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中,在37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每隔1~2 d換液1次。細胞消化并種植于24孔培養(yǎng)板中,待細胞融合至40%~50%左右,將處于對數(shù)生長期的細胞置于無血清的培養(yǎng)基中,37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,隨后進行下一步處理,組別分為空白對照(control,Con)組;陰性對照組(negative control-mimics,NC-m或negative control-inhibitor,NC-i);轉(zhuǎn)染組(miRNA25-mimics,25-m或miRNA-25-inhibitor,25-i) 。將以上miRNA分別溶解于Opti-MEM培養(yǎng)基中,加入LipofectamineTMRNAiMAX,輕柔混合,室溫靜置20~30 min,形成復(fù)合體。將復(fù)合體加入細胞培養(yǎng)板中,室溫孵育4 h,轉(zhuǎn)換為正常細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。

3.2CCK-8法和BrdU法測定細胞增殖水平將各組的TE1細胞以每孔2×103個細胞,加入96孔培養(yǎng)板中,每孔加入Opti-MEM培養(yǎng)基100 μL,繼續(xù)培養(yǎng),分別在24 h、48 h、72 h和96 h加入10 μL CCK-8溶液,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h。選擇450 nm波長,用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔吸光度值(A)。另設(shè)單孔只加入培養(yǎng)基不加入TE1細胞作為空白對照。

將細胞以每孔1 000個接種至96孔板中,培養(yǎng)24 h后加入BrdU,培養(yǎng)24 h,加入100 μL固定液,放置30 min,洗板3次,5% 胎牛血清封閉30 min。加入甲酰胺100 ℃變性5 min,洗滌,加入抗小鼠BrdU單抗,蘇木素襯染,顯微鏡下計數(shù)。

3.3流式細胞術(shù)檢測細胞周期將對數(shù)期的TE1細胞培養(yǎng)于Opti-MEM培養(yǎng)基24 h,消化處理后,800 r/min離心5 min,用PBS漂洗2次,再次800 r/min離心5 min,PBS重懸,加入70%預(yù)冷無水乙醇,4 ℃避光過夜。900 r/min離心8 min,PBS洗去乙醇,加入碘化丙啶,避光孵育30 min,記錄流式細胞儀于激發(fā)波長488 nm處的熒光強度,重復(fù)3次。

3.4TE1細胞中cyclin E1和CDK2的蛋白表達水平測定提取TE1細胞蛋白定量,調(diào)整蛋白量。取等量裂解產(chǎn)物,加入4倍體積上樣緩沖液進行SDS-PAGE電泳。電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,脫脂牛奶室溫封閉2 h,加入 I 抗4 ℃孵育4 h,TBST洗滌3次,每次10 min;再加入相對應(yīng) II 抗室溫孵育1 h,TBST洗滌3次,每次10 min,暗室中進行熒光顯色。

3.5RT-PCR檢測取適量食管癌組織、癌旁組織、正常食管黏膜組織、正常鼻咽黏膜組織、正常胃黏膜組織、正常腸黏膜組織、正常卵巢組織和經(jīng)過相應(yīng)處理的TE1細胞,按照TRIzol說明書提取總RNA,測定RNA樣品的A280值并定量。以逆轉(zhuǎn)錄酶催化合成cDNA,并在聚合酶催化下進行PCR擴增。擴增條件為:95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共30個循環(huán);72 ℃ 10 min。擴增樣品在2.0%瓊脂糖凝膠中電泳,以β-actin為內(nèi)參照,于凝膠成像系統(tǒng)觀察目的基因條帶并進行定量分析。采用Genetool軟件設(shè)計的相應(yīng)引物序列見表1。

表1 RT-PCR的引物序列

F: forward; R: reverse.

4統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。實驗結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準差(mean±SD)表示,多組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(one-way ANOVA),并用Bonferroni法進行組間均數(shù)的兩兩比較,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1miRNA-25在不同組織中的表達水平

RT-PCR的結(jié)果顯示,miRNA-25在正常食管黏膜組織中呈高表達;在正常胃黏膜組織和卵巢組織中低表達;在正常鼻咽黏膜組織和正常腸黏膜組織中幾乎不表達,見圖1。同時,與正常食管黏膜以及癌旁組織相比,miRNA-25在食管癌組織中表達明顯增加,見圖2。以上結(jié)果提示,miRNA-25的高表達與食管癌的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。

2RT-PCR法檢測miRNA-25-mimic/inhibitor在TE1細胞中的表達效率

通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染miRNA25-mimic/inhibitor至TE1細胞,采用RT-PCR檢測miRNA-25表達水平的變化,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了miRNA25-mimic后,TE1細胞的miRNA-25水平顯著升高;而轉(zhuǎn)染了miRNA-25 inhibitor后,TE1細胞的miRNA-25水平則顯著降低,與空白對照組相比均有顯著差異(P<0.05),見圖3。

Figure 1.The expression of miRNA-25 in different normal tissues. Mean±SD.

圖1食管、胃、卵巢、鼻和腸道正常粘膜組織中miRNA-25的表達水平

Figure 2.The expression levels of miRNA-25 in normal, paracancerous and cancerous esophageal tissues. Mean±SD.*P<0.05vsnormal esophageal mucosa.

圖2正常食管黏膜組織、癌旁組織和食管癌組織中miRNA-25的表達水平

Figure 3.The expression levels of miRNA-25 in the TE1 cell after over-expression/down-regulation of miRNA-25. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsCon.

圖3TE1細胞轉(zhuǎn)染后miRNA-25的表達水平

3CCK-8法和BrdU實驗測定TE1細胞的增殖水平

采用CCK-8法,在miRNA-25-mimic/inhibitor轉(zhuǎn)染TE1細胞后,分別于24 h、48 h、72 h和96 h時檢測細胞活力,結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達miRNA-25后,TE1的細胞活力顯著高于空白對照組(P<0.05),而沉默miRNA-25后,TE1的細胞活力顯著低于空白對照組(P<0.05);而NC-m、NC-i與空白對照組間的差異不顯著,見表2。

BrdU實驗結(jié)果表明,過表達miRNA-25后,DNA合成顯著高于空白對照組;而沉默miRNA-25后,結(jié)果相反;而NC-m、NC-i與空白對照組間的差異不顯著,見圖4。

4流式細胞術(shù)檢測細胞周期

應(yīng)用流式細胞術(shù)分析過表達/沉默miRNA-25后TE1細胞周期的變化。結(jié)果顯示,過表達miRNA-25后,G0/G1期的細胞數(shù)占百分比為減少至(46.52±5.08)%,S期細胞數(shù)所占百分比增加至(43.96±4.67)%,而沉默miRNA-25后,G0/G1期的細胞數(shù)占百分比為增加至(84.52±4.78)%,S期細胞數(shù)所占百分比減少至(6.05±2.64)%,說明過表達miRNA-25促進TE1細胞周期從G0/G1期向S期轉(zhuǎn)換,而沉默miRNA-25則抑制其轉(zhuǎn)換,見圖5。

5Cyclin E1和CDK2的蛋白表達水平

收集成功轉(zhuǎn)染miRNA-25-mimic/inhibitor的TE1細胞,提取蛋白,通過Western blot檢測TE1細胞中cyclin E1 和CDK2的蛋白表達水平。結(jié)果顯示,相對于未轉(zhuǎn)染的TE1細胞,過表達miRNA-25后cyclin E1和CDK2的蛋白表達水平顯著增加(P<0.05),而沉默miRNA-25后,則顯著降低二者的蛋白表達水平(P<0.05),見圖6。

表2miRNA-25對TE1細胞活力的影響

Table 2.The effect of miRNA-25 on the viabiliy of the TE1 cells transfected with miRNA-25-mimic/inhibitor determined by CCK-8 assay (%. Mean±SD.n=6)

Group0h24h48h72h96hCon08.51±0.7352.69±5.4192.64±8.99111.64±10.24NC-m09.61±0.6456.84±6.92100.42±8.59126.97±11.42NC-i09.42±0.7354.31±5.6796.47±7.63118.34±10.3425-m034.93±2.98*100.48±8.97*189.72±12.34*243.53±15.64*25-i03.46±0.31*19.47±0.97*46.51±3.14*64.25±5.43*

*P<0.05vsCon.

Figure 4.The quantitative analysis of DNA synthesis in the TE1 cells transfected with miRNA-25-mimic/inhibitor determined by BrdU assay. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsCon.

圖4各組TE1細胞的DNA合成量比較

6Cyclin E1和CDK2的mRNA表達水平

采用RT-PCR測定TE1細胞轉(zhuǎn)染miRNA25-mimic/inhibitor后,cyclin E1和CDK2的mRNA表達水平。結(jié)果顯示,過表達miRNA-25后,cyclin E1和CDK2的mRNA表達水平顯著增加,而沉默miRNA-25后,兩者的表達降低,兩者與空白對照組相比均具有顯著差異(P<0.05),見圖7。

討論

食管癌是一種人類常見的消化道惡性腫瘤,在我國,食管癌主要表現(xiàn)為食管鱗狀細胞癌。以太行山周邊的河北、河南,以及廣東的部分地區(qū)為高發(fā)地區(qū)[6]。本實驗通過對食管鱗狀細胞癌患者的臨床樣本進行分析,發(fā)現(xiàn)癌變組織中miRNA-25的表達水平顯著高于癌旁組織和正常食管黏膜組織,表明miRNA-25在食管鱗狀細胞癌中呈高表達。再者,通過對臨床收集的正常食管黏膜組織、正常鼻咽黏膜組織、正常胃黏膜組織、正常腸黏膜組織、正常卵巢組織樣本檢測發(fā)現(xiàn),正常食管黏膜組織中的miRNA-25的表達高于實驗中的其他組織,正常鼻炎黏膜組織和正常腸黏膜組織中幾乎不表達,提示miRNA-25在食管組織中具有特異性的表達,可作為治療食管鱗狀細胞癌的一個潛在靶點。

Figure 5.The cell cycle of the TE1 cells transfected with miRNA-25-mimic/inhibitor analyzed by flow cytometry. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsCon.

圖5TE1細胞的細胞周期變化

Figure 6.The protein expression of cyclin E1 and CDK2 in the TE1 cells transfected with miRNA-25-mimic/inhibitor. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsCon.

圖6Cyclin E1和CDK2的蛋白表達水平

Figure 7.The mRNA expression of cyclin E1 and CDK2 in the TE1 cells transfected with miRNA-25-mimic/inhibitor. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsCon.

圖7Cyclin E1和CDK2的mRNA表達水平

miRNA是一類內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA,通過與特定的mRNA分子的3’非翻譯區(qū)(3’UTR)相作用,從而調(diào)節(jié)相應(yīng)蛋白翻譯的過程來調(diào)控基因表達。在不同的組織器官中,miRNAs的表達具有明顯差異,提示miRNA可能參與調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄及表達[7-8]。本實驗建立過表達/沉默miRNA-25的人食管鱗狀細胞細胞株TE1,采用CCK-8法和BrdU實驗檢測轉(zhuǎn)染miRNA-25-mimics/inhibitor后TE1細胞的增殖情況,隨著時間的延長,發(fā)現(xiàn)過表達miRNA-25的TE1細胞增殖率隨時間增加而明顯增加,顯著高于空白對照組,沉默miRNA-25的TE1細胞增殖率雖然隨時間增加而增加,但顯著低于空白對照組,表明過表達miRNA-25使得TE1細胞的增殖加快,可能與食管鱗狀細胞癌的發(fā)展有一定的相關(guān)性。

細胞增殖周期由cyclin、CDK和CDK抑制因子(CDK inhibitor,CKI)共同調(diào)節(jié)。細胞的分裂與分化主要發(fā)生在G1期,cyclin E1在細胞分裂G1期轉(zhuǎn)換至S期的過程中作為調(diào)控因子[9],當(dāng)細胞受到生長信號刺激時,產(chǎn)生視網(wǎng)膜母細胞瘤基因蛋白(pRb)磷酸化,釋放出核轉(zhuǎn)錄因子E2F,促使細胞完成DNA復(fù)制[10],從而促進細胞增殖[11]。而在國內(nèi)外多項臨床試驗中也發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中長檢測到cyclin E1蛋白過表達以及基因擴增[12-13]。李麗等[14]研究在食管上皮癌變過程中細胞周期調(diào)控因子的表達時,發(fā)現(xiàn)cyclin E1和CDK2的蛋白和mRNA陽性表達率逐漸上升。本實驗采用免疫印跡法和RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染miRNA-25-mimics/inhibitor TE1細胞后,細胞周期調(diào)控因子cyclin E1和CDK2的蛋白和mRNA表達水平,并采用流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后TE1細胞的細胞周期,結(jié)果顯示,過表達miRNA-25后,TE1細胞中cyclin E1和CDK2的蛋白和mRNA表達水平均顯著增加,G0/G1期細胞數(shù)所占百分比明顯減少,S期細胞數(shù)所占百分比明顯增加,提示過表達miRNA-25可加快TE1細胞的增殖;而沉默miRNA-25后,TE1細胞中cyclin E1和CDK2的蛋白和mRNA表達水平均顯著降低;G0/G1期細胞數(shù)所占百分比明顯增加,S期細胞數(shù)所占百分比明顯減少,提示沉默miRNA-25可減緩TE1細胞的增殖。TE1細胞增殖的加速,可引起食管鱗狀細胞癌的迅速惡化,擴散和轉(zhuǎn)移,提示miRNA-25的高表達可能與食管鱗狀細胞癌的發(fā)生有關(guān),可能促進腫瘤細胞的過度增殖,最終產(chǎn)生惡化遷移。但其確切機制還需進一步深入的研究。

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(責(zé)任編輯:盧萍, 羅森)

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Polo樣激酶1在宮頸鱗狀細胞癌中的表達及其臨床意義
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