長鏈非編碼RNA對心臟發(fā)育的表觀遺傳學(xué)調(diào)控研究進(jìn)展*

楊翔宇1, 2，余細(xì)勇1, 3△

(1廣東省人民醫(yī)院，廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)研究中心，廣東 廣州510080；2南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州510515；3廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 511436)

Progress on epigenetic regulation of long noncoding RNAs in cardiac development and heart diseasesYANG Xiang-yu1, 2, YU Xi-yong1, 3

(1MedicalResearchCenterofGuangdongGeneralHospital,GuangdongAcademyofMedicalSciences,Guangzhou510080,China;

2SchoolofPharmaceuticalSciences,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China；

3SchoolofPharmaceuticalSciences,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou511436,China.E-mail:yuxycn@aliyun.com)

ABSTRACT[]It was previously revealed that noncoding RNAs, especially microRNAs, control cardiac genes and regulate heart function. Recently, growing evidence from high-throughput genomic platforms has confirmed that long noncoding RNAs (lncRNAs) serve as new and enigmatic regulators in cardiac development and homeostasis. Nevertheless, little is known about their characteristics compared to microRNAs. Here, we review the latest progress on lncRNAs in cardiac biology and diseases, summarizing detailed knowledge of their functions and novel cardiac-related gene regulatory mechanisms in epigenetic processes. Finally, we highlight that lncRNAs could be promising therapeutic targets and diagnostic biomarkers in cardiac pathophysiology.

[關(guān)鍵詞]長鏈非編碼RNA； 心臟發(fā)育； 心臟疾病； 表觀遺傳學(xué)

[中圖分類號]R363[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.11.029

[文章編號]1000-4718(2015)11-2107-06

[收稿日期]2015-05-05[修回日期] 2015-09-07

[基金項(xiàng)目]*廣東省醫(yī)學(xué)科研基金資助項(xiàng)目(No.A2010327)

通訊作者△Tel： 020-38688431; E-mail: limm269@126.com

[KEY WORDS]Long noncoding RNAs; Cardiac development; Heart diseases; Epigenetics

長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA or large noncoding RNA，lncRNAs)是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200 nt的功能性RNA，存在于細(xì)胞核或胞質(zhì)中。lncRNAs能調(diào)節(jié)生命過程中關(guān)鍵基因的表達(dá)，從而影響機(jī)體正常生理發(fā)育、功能維持和異常病理過程，如神經(jīng)干細(xì)胞分化發(fā)育、心臟疾病發(fā)生、腫瘤形成等[1]。lncRNAs是繼miRNAs之后的又一重要調(diào)節(jié)性非編碼RNA。已有研究表明，lncRNAs能夠與染色質(zhì)修飾蛋白、DNA或miRNAs等核酸形成復(fù)合物，在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后多個(gè)層次調(diào)控心臟發(fā)育基因的表達(dá)，其中表觀遺傳學(xué)調(diào)控是近幾年的研究熱點(diǎn)。本文從心臟發(fā)育和心臟疾病兩方面綜述lncRNAs在心臟發(fā)育穩(wěn)態(tài)中的最新研究進(jìn)展及其表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制。

1lncRNAs的結(jié)構(gòu)及功能特性

lncRNAs是一類大于200 nt、不編碼蛋白、具有5’帽子和polyA尾的轉(zhuǎn)錄本。隨著新一代測序技術(shù)的發(fā)展，科學(xué)家現(xiàn)在在人類中已鑒定出56 018個(gè)lncRNA,在小鼠中鑒定出46 475個(gè)lncRNA，數(shù)量遠(yuǎn)多于編碼基因，然而關(guān)于lncRNA的研究仍處于初級階段，大多只涉及命名、分類、鑒定方面的研究，只有極少數(shù)lncRNA開展了功能方面的探索。lncRNA種類繁多，目前根據(jù)長鏈非編碼RNA轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄方向及結(jié)構(gòu)等特點(diǎn)粗略地分為：由編碼鏈轉(zhuǎn)錄得到的正義RNA(sense RNA)、轉(zhuǎn)錄自反義鏈的反義RNA(antisense RNA)、從編碼基因的內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄得到的基因內(nèi)RNA(intronic RNA)、基因間RNA(intergenic RNA)、增強(qiáng)子區(qū)域雙向轉(zhuǎn)錄得到的增強(qiáng)子RNA(enhancer RNA)以及剪接的蛋白編碼基因閉合形成的環(huán)狀RNA(circular RNA)等。

近來研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)lncRNAs具有的生物學(xué)功能有表觀遺傳調(diào)控子和轉(zhuǎn)錄因子的支架(scaffold molecule)、引導(dǎo)分子(guide molecule)、增強(qiáng)子激活、分子“海綿”等。

2lncRNAs與心臟發(fā)育

心臟發(fā)育起始于中胚層(側(cè)板中胚層)的生心祖細(xì)胞(cardiac progenitor cell，CPC)，經(jīng)歷生心祖細(xì)胞的誘導(dǎo)和特化、心管形成、心臟環(huán)化和不對稱發(fā)育、腔室特化和生長，整個(gè)發(fā)育過程受多種核心轉(zhuǎn)錄因子如Nkx2.5、Mesp1、Mef2c、Gata4等基因的調(diào)控。心臟基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)失衡時(shí)會(huì)引起先天性心臟病以及各種獲得性慢性心臟病。lncRNAs的發(fā)現(xiàn)增添了心臟發(fā)育調(diào)控新方式。

2.1lncRNAs與干細(xì)胞向心肌細(xì)胞定向分化lnc-RNAs具有時(shí)空表達(dá)特異性，在胚胎干細(xì)胞向心臟方向分化中具有重要的作用。Werber等[2]運(yùn)用RNA-Seq檢測了小鼠中胚層尾部、體節(jié)、心臟、頭部、脊柱等6種不同組織的lncRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)了一種在小鼠早期胚胎側(cè)板中胚層特異表達(dá)的lncRNA——Fendrr(Foxf1 adjacent noncoding developmental regulatory RNA)。隨后Grote等[3]用轉(zhuǎn)錄終止信號替代Fendrr第1個(gè)外顯子，胚胎干細(xì)胞中Fendrr敲除后，其反義鏈的下游基因Foxf1的表達(dá)上調(diào)，削弱了心肌增殖功能，使得心肌變薄，心臟和腹側(cè)體壁發(fā)生畸形，導(dǎo)致胚胎大約在13.75 d死亡。深入研究顯示，F(xiàn)endrr能順式招募多梳抑制復(fù)合物2(polycomb repression complex 2，PRC2)到Foxf1啟動(dòng)子區(qū)域從而抑制Foxf1表達(dá)。此外，F(xiàn)endrr還能招募TrxG家族的MLL(mixed lineage leukemia)復(fù)合物到啟動(dòng)子區(qū)域，可能影響到MLL復(fù)合物的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性，影響H3K4me3水平，上調(diào)心臟發(fā)育轉(zhuǎn)錄因子Gata6、Nkx2.5。在補(bǔ)救實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)endrr異常高表達(dá)能顯著降低小鼠出生后死亡率，證實(shí)了Fendrr是小鼠心臟和腹側(cè)體壁正常發(fā)育所需的基本lncRNA。在前人的研究基礎(chǔ)上，Sauvageau等[4]采用另外一種方法(Lacz報(bào)告盒)敲除Fendrr，發(fā)現(xiàn)在E18.5才出現(xiàn)室間隔缺損，這種滯后的心臟畸形有別于一般轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控靶基因失活所迅速出現(xiàn)的畸形，提示lncRNAs可能以特殊的方式調(diào)控心肌發(fā)育。

2013年，Klattenhoff等[5]發(fā)現(xiàn)了一種僅在小鼠中特異表達(dá)的長鏈基因間非編碼RNA，稱為勇敢的心(Braveheart，簡稱Bvht，也稱Ak143260)。Bvht異常表達(dá)時(shí)，小鼠胚胎干細(xì)胞無法分化成心肌細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，表明Bvht對小鼠胚胎中胚層向心肌細(xì)胞形成是必需的。Bvht可能通過與PRC2亞單元SUZ12相互作用，啟動(dòng)心血管中胚層標(biāo)志物Mesp1及其下游其它心臟特異基因如Gata4、Gata6、Hand2、Nkx2.5的表達(dá)，但具體如何啟動(dòng)這些基因的表達(dá)仍未闡明。然而，在大鼠和人類中并沒有鑒定出Braveheart，這給科學(xué)家們留下一個(gè)待解決的問題：能否在人體中找到像Bvht這樣參與心臟分化的lncRNA，以及深入解析lncRNAs引導(dǎo)干細(xì)胞向心臟分化的機(jī)制。Fendrr和Bvht都能與表觀遺傳沉默復(fù)合物多梳抑制復(fù)合物共同作用，調(diào)節(jié)早期心臟發(fā)育關(guān)鍵基因的表達(dá)，展示了lncRNA作為新型調(diào)控分子參與心臟定向分化。

同樣，Ounzain等[6]在小鼠胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化過程中，運(yùn)用生物信息學(xué)鑒定出一系列增強(qiáng)子RNA：mm67、 mm77、mm85、mm104、mm130、mm132、mm172和Smad7-lncRNA(Smad家族成員)。隨后，敲低mm85和Smad7-lncRNA兩種增強(qiáng)子RNA，分別引起心肌素(myocardin)和Smad7特異下調(diào)。

2.2lncRNAs與功能性心肌分化Cesana等[7]報(bào)道linc-MD1像個(gè)miRNA“海綿體”，特異性結(jié)合miR-135和 miR-133，進(jìn)而分別調(diào)控靶基因肌細(xì)胞特異性增強(qiáng)因子2C(myocyte-specific enhancer factor 2C，Mef2C)和決定因子樣蛋白1(mastermind-like 1，MAML1)，調(diào)控肌細(xì)胞特異基因的表達(dá)，在肌細(xì)胞發(fā)育中發(fā)揮重要作用。Mef2C是第2生心區(qū)心臟祖細(xì)胞形成右心室過程中必不可少的調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子，提示linc-MD1可能在促進(jìn)心肌細(xì)胞成熟中發(fā)揮重要作用。

Yadava等[8]在強(qiáng)直性肌營養(yǎng)不良疾病轉(zhuǎn)基因小鼠模型中發(fā)現(xiàn)強(qiáng)直性肌營養(yǎng)不良蛋白激酶(myotonic dystrophy protein kinase,DMPK)的反義RNA過表達(dá)，導(dǎo)致Nkx2.5出現(xiàn)上調(diào)以及縫隙連接蛋白40和43的下調(diào)。遺傳學(xué)研究顯示，心臟中Nkx2.5表達(dá)上調(diào)能引起進(jìn)程性心臟傳導(dǎo)阻滯，可能是Nkx2.5能調(diào)控縫隙連接蛋白基因的表達(dá)，而縫隙連接蛋白是成熟心肌細(xì)胞的標(biāo)志物之一，在動(dòng)作電位產(chǎn)生、心臟節(jié)律收縮中扮演著重要角色。

除了DMPK的反義RNA外，許多報(bào)道也證實(shí)了lncRNA能促進(jìn)心肌細(xì)胞成熟，維持心肌正常收縮力，如β-肌球蛋白重鏈(β-myosin heavy chain,β-MHC)的反義RNA和心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin I,cTnI)的反義RNA等。肌球蛋白是心肌肌節(jié)的重要組分，對心肌細(xì)胞向功能性心肌成熟分化具有重要意義。其中心肌肌球蛋白重鏈有2種亞型，分別是α-MHC(MYH6)和β-MHC(MYH7)。生理狀態(tài)下，胚胎期以收縮頻率慢的MYH7為主，隨著心肌成熟及心肌能量代謝方式的改變，收縮力更強(qiáng)的MYH6成為心肌主要組分。研究表明，lncRNA MYH7能抑制β-MHC的表達(dá)，同時(shí)能促進(jìn)α-MHC的表達(dá)，在MHC亞型的動(dòng)態(tài)平衡中起到關(guān)鍵調(diào)控作用。而 cTnI反義RNA可能通過堿基互補(bǔ)與cTnI mRNA形成復(fù)合物，抑制心肌肌鈣蛋白的表達(dá)。另外，F(xiàn)riendrichs等[9]發(fā)現(xiàn)在斑馬魚中敲除類固醇受體RNA 1(steroid receptor RNA 1, SRA1)的反義RNA，削弱心臟尤其是心室區(qū)域的收縮功能，阻礙心臟收縮的原因可能是lncRNA SRA1可與肌源性分化蛋白(myogenic differentiation protein，myoD)共同調(diào)控肌性分化，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

3lncRNAs與心臟疾病

3.1lncRNAs與室間隔缺損室間隔缺損是最常見的先天性心臟病，為了明確lncRNAs在室間隔缺損形成的角色，Song等[10]對17～20周齡的胎兒室間隔缺損標(biāo)本用lncRNA特異微陣列方法檢測lncRNAs表達(dá)譜情況，發(fā)現(xiàn)1 000余個(gè)lncRNAs異常表達(dá)，進(jìn)一步基因本體論分析發(fā)現(xiàn)，這些異常表達(dá)的lncRNAs參與分解代謝、細(xì)胞分化、心臟生長等生物過程。

3.2lncRNAs與心肌梗死2006年Ishii等[11]在心肌梗死病人全基因組關(guān)聯(lián)分析中發(fā)現(xiàn)，心肌梗死易感單核苷酸位點(diǎn)編碼一種非編碼基因，稱為心肌梗塞相關(guān)轉(zhuǎn)錄本(myocardial infarction-associated transcription, MIAT)，也稱Gomafu或RNCR2，其外顯子的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點(diǎn)變異增加了MIAT的表達(dá)，增強(qiáng)心肌梗死的易感性。盡管MIAT在心臟病理狀態(tài)下的分子機(jī)制尚不詳，但有文獻(xiàn)報(bào)道MIAT可能通過異常剪切Wnt7b在大腦發(fā)育中發(fā)揮多種效應(yīng)。Wnt信號通路是心血管系統(tǒng)中重要的通路，提示MIAT可能通過Wnt信號通路調(diào)控心臟病理狀態(tài)。研究人員還發(fā)現(xiàn)，ST段抬高性心肌梗死患者外周血中的MIAT表達(dá)顯著下降，說明心肌梗死能誘導(dǎo)外周血中l(wèi)ncRNAs表達(dá)水平發(fā)生變化。

為了驗(yàn)證發(fā)生急性心肌梗塞后，外周血lncRNAs表達(dá)水平受到調(diào)控，Michalik等[12]比較了心肌梗死患者與健康組的lncRNAs表達(dá)譜變化，發(fā)現(xiàn)患者組中缺氧誘導(dǎo)因子1反義轉(zhuǎn)錄物、MALAT1和電壓門控鉀離子通道KQT樣亞家族成員1反義轉(zhuǎn)錄物1(Kcnq1 opposite strand-antisense transcript 1,Kcnq1ot1)較健康受試者高，然而ANRIL轉(zhuǎn)錄本NR-003529表達(dá)下降。而在缺血性心肌梗死患者中，MALAT1表達(dá)增加，這與體外低氧培養(yǎng)心臟內(nèi)皮細(xì)胞下MALAT1表達(dá)上調(diào)一致。

越來越多的實(shí)驗(yàn)證實(shí) lncRNAs與心肌梗死之間存在密切的相互關(guān)系，認(rèn)為lncRNAs的突變，如ANRIL、MIAT等，與心肌梗死危險(xiǎn)因素、心肌損傷生物標(biāo)志物、左室心功能不全指標(biāo)相關(guān)，能預(yù)測心肌梗死時(shí)左心室功能不全程度，提示lncRNAs可以作為心肌梗死診治的生物學(xué)標(biāo)記物。

Kumarswamy 等[13]對788例因急性心肌梗死出現(xiàn)左室重塑和慢性心力衰竭患者研究，發(fā)現(xiàn)外周血中的線粒體源lincRNA——預(yù)測心臟重構(gòu)長鏈基因間非編碼RNA (long intergenic noncoding RNA predicting cardiac remodeling，LIPCAR;又稱uc022bqs.1)在急性心肌梗死早期表達(dá)下調(diào)，然而在心肌梗死后期LIPCAR表達(dá)顯著上升。這說明LIPCAR表達(dá)水平越高，死亡事件發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)越高，提示LIPCAR將來可作為心力衰竭預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物。

3.3lncRNAs與心肌肥厚心肌肥厚是心臟在受到壓力負(fù)荷、心肌缺血再灌注損傷或者血管緊張素Ⅱ等刺激下的重要病理變化，主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞體積肥大。最近有文獻(xiàn)報(bào)道lncRNAs干預(yù)miRNAs的表達(dá)進(jìn)而控制心肌肥厚、心肌凋亡進(jìn)程。Wang等[14]在低氧培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中鑒定出4種下調(diào)表達(dá)的lncRNAs并命名為AK029547、AK041176、AK017121和AK018416。其中，AK017121體外能抑制凋亡和線粒體分裂，體內(nèi)減少缺血再灌注損傷，因此學(xué)者將AK017121又命名為心臟凋亡相關(guān)lncRNA(cardiac apoptosis-related lncRNA，CARL)。心肌細(xì)胞凋亡是擴(kuò)大心肌梗死面積、促進(jìn)心肌重構(gòu)的重要因素之一。深入研究表明CARL能結(jié)合miR-539，減少miR-539與線粒體內(nèi)膜蛋白抗增殖蛋白PHB2(prohibitin 2)的結(jié)合，阻滯了miR-539功能發(fā)揮，從而保護(hù)低氧下線粒體裂解及凋亡。

在血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的小鼠心肌肥厚模型中發(fā)現(xiàn)一種lncRNA AK048451表達(dá)上調(diào)，這種lncRNA被命名為心肌肥厚相關(guān)因子(cardiac hypertrophy-rela-ted factor,CHRF)[15]。在主動(dòng)脈狹窄和心力衰竭患者樣品中同樣檢測到CHRF表達(dá)上調(diào)。CHRF雖然在心血管細(xì)胞及其它組織中廣泛表達(dá)，但是在心肌細(xì)胞中具有獨(dú)特的功能，可以引起心肌凋亡和心肌肥厚。CHRF作為內(nèi)源性海綿體，能結(jié)合miR-489。miR-489本身具有拮抗心肌肥厚的作用，CHRF下調(diào)胞漿中游離的miR-489水平，競爭性抑制miR-489與其下游靶基因髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)結(jié)合，進(jìn)而激活經(jīng)典NF-κB信號通路來調(diào)控心肌肥厚。

心肌出現(xiàn)肥厚性增殖時(shí)，重新激活胎兒時(shí)期活躍表達(dá)的心臟相關(guān)基因，改變能量使用、代謝途徑，導(dǎo)致心肌肥厚、心力衰竭等病理進(jìn)展惡化。Han等[16]在心力衰竭小鼠模型中發(fā)現(xiàn)MYH7反義轉(zhuǎn)錄本(又稱Myheart或Mhrt)是一種心臟保護(hù)性lncRNA。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)高水平表達(dá)染色質(zhì)重塑復(fù)合物Brg1，可恢復(fù)Mhrt至正常水平，由此阻滯心肌衰竭發(fā)展。他們指出，Mhrt調(diào)控Brg1蛋白的表達(dá)，恢復(fù)的Mhrt阻斷了Brg1結(jié)合DNA，阻止了心力衰竭。早在2010年，Hang等[17]報(bào)道染色質(zhì)重塑蛋白 Brg1能結(jié)合組蛋白去乙?；?histone deacetylase，HDAC)和多腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase,PARP]，在心臟發(fā)育和心臟疾病中起至關(guān)重要的作用。正常生理狀態(tài)下，隨著心臟的生長、發(fā)育成熟，Brg1的生成量減少。而在心肌肥厚患者中Brg1的表達(dá)明顯高于正常，由此可見心臟應(yīng)激狀態(tài)下心肌重新激活Brg1表達(dá)。隨后，在監(jiān)測心肌肥厚病人中α-MHC和β-MHC的表達(dá)水平時(shí)發(fā)現(xiàn)Brg1能與α-MHC和β-MHC啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合。然而，目前并不清楚Mhrt是如何阻斷Brg1至關(guān)重要的部分，從而阻止心臟功能惡化。

3.4lncRNAs與心肌纖維化心肌纖維化是心臟重塑的又一病理變化，主要表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)大量沉積、成纖維細(xì)胞增殖、心肌細(xì)胞出現(xiàn)纖維化。為了探究lncRNAs是否參與心臟成纖維化，Jiang等[18]分析了血管緊張素Ⅱ處理的大鼠成纖維細(xì)胞的lncRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)大約有300個(gè)lncRNA比對照組上調(diào)2倍以上。雖然沒有進(jìn)行功能學(xué)研究，這些鑒定出來的lncRNAs同樣說明了lncRNAs是調(diào)控心肌纖維化的關(guān)鍵元件。

4心臟相關(guān)lncRNAs的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制

lncRNAs以多種形式參與調(diào)節(jié)心臟正常發(fā)育及心臟疾病發(fā)生、發(fā)展過程，而且已經(jīng)有許多學(xué)者對lncRNA的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究，認(rèn)為lncRNAs可以扮演信號通路的調(diào)節(jié)劑、分子支架、分子誘餌或者分子向?qū)У冉巧玔19]，參與靶基因的表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，其中，表觀遺傳修飾在心臟發(fā)育基因的調(diào)節(jié)作用備受關(guān)注。研究證實(shí)，lncRNAs與表觀調(diào)控因子相互作用，通過介導(dǎo)DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)高度重塑、核小體定位以及調(diào)節(jié)miRNA的表達(dá)等，激活或沉默維持心臟發(fā)育和正常生理功能所必需基因的轉(zhuǎn)錄。然而，國內(nèi)學(xué)者對于lncRNAs在心臟發(fā)育網(wǎng)絡(luò)中的調(diào)控機(jī)制認(rèn)識不夠深入，因此下面將著重綜述近幾年心臟相關(guān)lncRNAs與表觀調(diào)控因子相互作用的機(jī)制，以便為今后豐富心臟發(fā)育網(wǎng)絡(luò)中表觀遺傳學(xué)研究提供參考。

4.1lncRNAs與DNA修飾DNA甲基化是最常見的表觀遺傳調(diào)節(jié)形式之一，即胞嘧啶在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases,DNMTs)催化下生成5-甲基胞嘧啶，它通常發(fā)生在基因啟動(dòng)子區(qū)的CpG島。當(dāng)CpG島發(fā)生甲基化時(shí)，基因的轉(zhuǎn)錄活性受到抑制。DNA甲基化與去甲基化是個(gè)動(dòng)態(tài)可逆的過程，DNA甲基化生成5-甲基胞嘧啶后，可以在Tet甲基胞嘧啶雙加氧酶作用下發(fā)生羥甲基化生成5-羥甲基胞嘧啶。5-羥甲基胞嘧啶作為DNA去甲基化過程中的關(guān)鍵中間產(chǎn)物，可以在胸腺嘧啶-DNA-糖基化酶的作用下重新轉(zhuǎn)化為未修飾的胞嘧啶。

研究報(bào)道，lncRNA Kcnqlot1等通過維持靶基因的DNA甲基化水平而沉默基因的轉(zhuǎn)錄[20]，也有些報(bào)道顯示lncRNAs與某些具有調(diào)節(jié)甲基化作用的mRNA序列重疊，lncRNAs的轉(zhuǎn)錄抑制mRNA的表達(dá)，影響mRNA與DNMTs結(jié)合，抑制靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平，從而提高靶基因的表達(dá)水平。X染色體失活特異性轉(zhuǎn)錄本(X inactive-specific transcript, Xist)借助YY1轉(zhuǎn)錄因子的特定序列將其綁定在X染色體位點(diǎn)上，從而獲得抑制性組蛋白修飾，引起CpG島啟動(dòng)子甲基化，導(dǎo)致X染色體失活[21]。

4.2lncRNAs與組蛋白修飾lncRNAs可以結(jié)合多種組蛋白修飾復(fù)合物如PRC2、MLL、LSD1等，并招募這些復(fù)合物至特定活性位點(diǎn)，從而發(fā)揮它在全基因組中的調(diào)控作用。Guttman等[22]發(fā)現(xiàn)小鼠胚胎干細(xì)胞中至少有12種組蛋白修飾復(fù)合物參與了30%的lncRNA的表觀遺傳調(diào)節(jié)作用。一般來說，TrxG家族復(fù)合物維持基因激活狀態(tài)，而PcG蛋白維持基因抑制表達(dá)狀態(tài)。體外用RNA pulldown技術(shù)或者RNA免疫共沉淀技術(shù)證實(shí)了Bvht與PRC2亞單元SUZ12相互作用，Bvht的敲低使得SUZ12水平上調(diào)，同時(shí)使Mesp1以及心臟發(fā)育相關(guān)基因Gata6、Hand1、Hand2、Nkx2.5啟動(dòng)子區(qū)域H3K4me3水平增加，激活這些基因的轉(zhuǎn)錄[5]。Grote等[3]的研究結(jié)果也同樣表明Fendrr可與PRC2復(fù)合物亞基EZH2、SUZ12結(jié)合，敲低Fendrr會(huì)削弱其招募SUZ12的能力，使得定位至側(cè)板中胚層調(diào)節(jié)基因Pitx2、Foxf1啟動(dòng)子區(qū)域的SUZ12數(shù)量減少，導(dǎo)致表觀沉默標(biāo)志物H3K27me3丟失，靶基因轉(zhuǎn)錄抑制作用減弱，這些都說明了PRC2復(fù)合物非特異性地與心臟相關(guān)lncRNAs結(jié)合。

同種lncRNAs可以同時(shí)結(jié)合多種不同家族的組蛋白修飾復(fù)合物。如Fendrr除了可以招募PRC2外，還可以結(jié)合組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物TrxG/MLL的亞基WDR5，維持H3K4me3與H3K27me3的動(dòng)態(tài)平衡，影響中胚層向心臟分化的命運(yùn)。那么，Bvht和Fendrr是如何結(jié)合組蛋白修飾復(fù)合物呢?lncRNAs是如何被定位至特定區(qū)域呢？雖然對Bvht和Fendrr還沒有深入研究到這一步，但有研究發(fā)現(xiàn)一些lncRNAs如Xist具有重復(fù)的序列，可以折疊形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)募集組蛋白修飾復(fù)合物。生物信息學(xué)發(fā)現(xiàn)，結(jié)合lncRNA的DNA區(qū)域具有特異的模序，可能對吸引lncRNAs具有十分重要的作用。也許Bvht和Fendrr并不只是以這樣的方式發(fā)揮作用呢。這目前對于我們來說仍是個(gè)謎，需要繼續(xù)深入探究其結(jié)構(gòu)及功能。

4.3lncRNAs與染色質(zhì)重塑BAF復(fù)合物是ATP依賴型染色質(zhì)重塑復(fù)合物，利用ATP水解提供的能量來移動(dòng)核小體，干擾核小體與DNA之間的相互作用，使得局部染色質(zhì)解壓縮，增加DNA可接近性，有利于調(diào)控基因的表達(dá)。BAF復(fù)合物在心臟分化、成熟甚至是心肌肥厚病理過程中具有重要的調(diào)控作用。有研究已經(jīng)表明一些lncRNAs與BAF復(fù)合物亞單元Brg1相互作用，如心肌肥厚保護(hù)性lncRNA Mhrt。Brg1有2個(gè)分子伴侶，一個(gè)是HDAC，另一個(gè)是PARP，Mhrt特異性地與Brg1解旋酶區(qū)域結(jié)合，抑制染色質(zhì)重塑，一方面抑制高度螺旋的染色質(zhì)打開，另一方面抑制組蛋白乙?；揎?，抑制MYH7的表達(dá)[16]。由此可見，同一種lncRNAs可以通過2種獨(dú)立的機(jī)制調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。

4.4lncRNAs與miRNAslncRNAs調(diào)控miRNA的作用機(jī)制主要有3種形式：(1)lncRNAs與miRNA競爭性地結(jié)合到靶基因mRNAs上，從而負(fù)向調(diào)控mRNAs的表達(dá)；(2)一些lncRNA先通過剪切作用形成miRNA前體，再經(jīng)修飾生成miRNA，調(diào)控靶基因的表達(dá)；(3)部分lncRNAs通過RNA-RNA作用形成雜化雙鏈，像海綿一樣吸收mRNAs，從而抑制mRNA的表達(dá)，間接影響mRNA生物學(xué)功能，即所謂的競爭性內(nèi)源性RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)機(jī)制[23]。lncRNA的ceRNA機(jī)制主要發(fā)生在胞質(zhì)中，呈現(xiàn)了不同種類RNAs之間交流的新方式，也已經(jīng)有許多例子證明了lncRNA能夠作為ceRNA調(diào)控miRNA，如linc-MD1、CHRF、CARL等。

除了線性RNA外， Memcazak發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA大腦退行相關(guān)蛋白1反義轉(zhuǎn)錄本(cerebellar degeneration-related protein 1 antisense transcript,CDR1as)同樣能捕獲miRNAs，削弱miR-7功能[24]。在斑馬魚中驗(yàn)證了表達(dá)CDR1as或敲低miR-7能改善大腦發(fā)育。與線性的ceRNA相比，環(huán)狀RNA穩(wěn)定性較好，能更好地調(diào)控miRNA與靶位點(diǎn)的作用，但目前尚未報(bào)道與心臟發(fā)育及心臟疾病相關(guān)的環(huán)狀RNA，有待于我們進(jìn)一步深入研究證明其在心臟發(fā)育及其疾病中的作用。

Figure 1.Parts of the epigenetic mechanisms of lncRNAs related to the heart.

圖1部分心臟相關(guān)lncRNAs表觀遺傳學(xué)作用機(jī)制圖

5展望

心臟發(fā)育受多種分子的精密調(diào)控，隨著研究的深入開展，學(xué)者們廣泛證實(shí)被視為基因組轉(zhuǎn)錄“噪音”的lncRNAs也參與到干細(xì)胞向心臟譜系細(xì)胞分化、心肌發(fā)育成熟以及心臟疾病的發(fā)生，可通過與表觀遺傳學(xué)修飾因子相互作用，也可與miRNA相互作用，是心臟發(fā)育表觀遺傳學(xué)的關(guān)鍵分子。然而，目前我們對于心臟發(fā)育相關(guān)的lncRNAs是如何在表觀遺傳學(xué)層面調(diào)控下游心臟發(fā)育關(guān)鍵基因網(wǎng)絡(luò)了解甚少，lncRNAs是否也像其它非編碼RNA一樣參與心臟細(xì)胞重編程、轉(zhuǎn)分化、心肌衰老等過程，這些問題的揭秘都有待于今后的發(fā)現(xiàn)與探索。

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(責(zé)任編輯：林白霜， 羅森)