Mcl-1信號(hào)通路阻斷劑對(duì)H37Rv感染小鼠巨噬細(xì)胞凋亡的影響*

張宇晴1, 4，王新敏5，王嬋2, 4，王飛雨1, 4，王小芳1, 4，趙瑾3,4，吳芳1,4，吳江東1, 4，季榕5，張萬(wàn)江1, 4，章樂(lè)1, 4△

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院1病理生理學(xué)教研室,2病原生物學(xué)與免疫學(xué)教研室,3病理學(xué)教研室,4新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，5第一附屬醫(yī)院，新疆 石河子832002)

[摘要]目的： 探討Mcl-1信號(hào)通路阻斷劑在結(jié)核分枝桿菌H37Rv感染小鼠模型中對(duì)Mcl-1表達(dá)、巨噬細(xì)胞凋亡情況及結(jié)核分枝桿菌的影響。方法: 小鼠腹腔注射H37Rv菌懸液，建立感染小鼠模型，針對(duì)Mcl-1的信號(hào)通路選用JAK/STAT信號(hào)通路阻斷劑AG490、MAPK信號(hào)通路阻斷劑PD98059和PI3K信號(hào)通路阻斷劑LY294002用腹腔注射方式作用于各組感染小鼠模型，分為H37Rv感染組、AG490處理組、PD98059處理組、 LY294002處理組和對(duì)照組。通過(guò)細(xì)胞抗酸染色觀察結(jié)核分枝桿菌H37Rv感染小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的動(dòng)物模型是否建立成功；通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌H37Rv感染巨噬細(xì)胞的Mcl-1表達(dá)情況，使用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)各組巨噬細(xì)胞的凋亡率，采用結(jié)核分枝桿菌菌落計(jì)數(shù)來(lái)判斷巨噬細(xì)胞凋亡對(duì)結(jié)核分枝桿菌的清除效果。結(jié)果: 細(xì)胞抗酸染色結(jié)果可見(jiàn)感染的巨噬細(xì)胞內(nèi)散在排列的紅色短小抗酸結(jié)核分枝桿菌。免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示H37Rv感染組、AG490處理組和LY294002處理組中的Mcl-1蛋白為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，PD98059處理組中Mcl-1蛋白為弱陽(yáng)性表達(dá)，對(duì)照組Mcl-1蛋白為陰性表達(dá)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)H37Rv感染組巨噬細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組高，PD98059處理組的凋亡率顯著高于各組，差異顯著(P<0.05)。結(jié)核分枝桿菌菌落計(jì)數(shù)結(jié)果顯示PD98059處理組對(duì)H37Rv菌株抑菌作用最明顯。結(jié)論: Mcl-1信號(hào)通路阻斷劑通過(guò)抑制JAK/STAT、MAPK和PI3K信號(hào)通路增加結(jié)核分枝桿菌H37Rv感染巨噬細(xì)胞的凋亡率，抑制結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)；其中，MAPK信號(hào)通路干擾Mcl-1的作用最明顯，感染的巨噬細(xì)胞凋亡率最高，抑菌作用最強(qiáng)。

[關(guān)鍵詞]Mcl-1； 細(xì)胞凋亡； 結(jié)核分枝桿菌； H37Rv； 巨噬細(xì)胞

[中圖分類號(hào)]R378.91+1; R363[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.11.022

[文章編號(hào)]1000-4718(2015)11-2065-05

[收稿日期]2015-03-18[修回日期] 2015-07-14

[基金項(xiàng)目]*國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81102088; No. 81441101)；天津市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.12JCYBJC16600; No.13JCYBJC22000)；武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院重點(diǎn)項(xiàng)目(No.FYJ201510)；武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院種子基金資助項(xiàng)目(No.FYM201107; No. FYM201538)

通訊作者△姬文婕 Tel: 022-60577283； E-mail: ji_wenjie@hotmail.com； 魏路清 Tel: 022-60578671；E-mail:wei_luqing@hotmail.com

Effect of Mcl-1 signaling pathway blockers on apoptosis of mouse macrophages infected withMycobacteriumtuberculosisH37RvZHANG Yu-qing1，4, WANG Xin-min5, WANG Chan2，4, WANG Fei-yu1，4, WANG Xiao-fang1，4, ZHAO Jin3，4, WU Fang1，4, WU Jiang-dong1，4, JI Rong5, ZHANG Wan-jiang1，4, ZHANG Le1，4

(1DepartmentofPathophysiology,2DepartmentofPathogenBiology&Immunology,3DepartmentofPathology,4LaboratoryofXinjiangEndemicandEthnicDiseases,5TheFirstAffiliatedHospital,MedicalcollegeofShiheziUniversity,Shihezi832002,China.E-mail: 1257067540@qq.com)

ABSTRACT[]AIM: To explore the effects of Mcl-1 signal pathway blockers on Mcl-1 expression, macrophage apoptosis and Mycobacterium tuberculosis in the model of mice infected with Mycobacterium tuberculosis H37Rv. METHODS: A mouse infection model was established by intraperitoneal injection of H37Rv suspension. The signaling pathway blockers AG490, PD98059 and LY294002 for JAK/STAT, MAPK and PI3K, respectively, were intraperitoneally injected into the mice infected with H37Rv. Cell acid-fast staining was used to observe whether the mouse peritoneal macrophages infected with H37Rv were successfully established. Immunocytochemical method was employed to detect Mcl-1 expression in the mouse peritoneal macrophages infected with H37Rv. The apoptotic rate in each group was measured by flow cytomerty. The scavenging capacity of apoptotic macrophages against H37Rv was determined by Mycobacterium tuberculosis colony counting. RESULTS: The result of cell acid-fast staining revealed the existence of dispersive arrangement of red short antiacid Mycobacterium tuberculosis within infected macrophages. The result of cell immunocytochemistry showed strongly positive expression of Mcl-1 protein in H37Rv infection group, AG490 treatment group and LY294002 treatment group, weakly positive expression of Mcl-1 protein in PD98059 treatment group, and negative expression of Mcl-1 protein in control group. The result of flow cytometry found that the macrophage apoptotic rate in H37Rv infection group was higher than that in control group, while that in PD98059 treatment group was high than that in other groups with statistically significant differences (P<0.05). The result of Mycobacterium tuberculosis colony counting showed that PD98059 treatment had the most significant inhibitory effect on H37Rv strain. CONCLUSION: Mcl-1 signaling pathway blockers increase the apoptotic rate of macrophages infected with Mycobacterium tuberculosis H37Rv and inhibit the growth of Mycobacterium tuberculosis by inhibiting the signaling pathways of JAK/STAT, MAPK and PI3K, among which the MAPK has the most obvious interfering effect on Mcl-1, and leads to the highest apoptotic rate of infected macrophages and the strongest bacteriostasis.

[KEY WORDS]Mcl-1; Apoptosis;Mycobacteriumtuberculosis; H37Rv; Macrophages

結(jié)核病(tuberculosis，TB)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)感染所引起的一種致殘率、病死率極高的傳染性疾病。髓細(xì)胞白血病1(myeloid cell leukemia-1，Mcl-1)屬于Bcl-2家族，正常情況下，Mcl-1通過(guò)與Bcl-2家族中的Bax結(jié)合來(lái)抑制細(xì)胞凋亡[1]，由于 Mcl-1受到正向調(diào)控而表達(dá)異常，導(dǎo)致單核巨噬細(xì)胞在吞噬結(jié)核分枝桿菌之后不能正常凋亡成為結(jié)核分枝桿菌理想的庇護(hù)所，因此，通過(guò)抑制Mcl-1的表達(dá)促進(jìn)感染巨噬細(xì)胞的凋亡從而殺滅結(jié)核分枝桿菌成為可能。Mcl-1基因的表達(dá)主要是通過(guò)JAK/STAT、MAPK和PI3K/AKT等胞內(nèi)信號(hào)通路的激活進(jìn)行的[2]，如果通過(guò)阻斷信號(hào)通路途徑抑制結(jié)核分枝桿菌感染巨噬細(xì)胞中Mcl-1的表達(dá)則有可能導(dǎo)致受到感染的巨噬細(xì)胞凋亡從而殺死潛伏在其中的結(jié)核分枝桿菌，所以本研究使用JAK/STAT信號(hào)通路抑制劑AG490，MAPK信號(hào)通路阻斷劑PD98059和PI3K/AKT信號(hào)特異性抑制劑LY294002分別作用于感染H37Rv的BALB/c小鼠，通過(guò)觀察小鼠模型中結(jié)核分枝桿菌H37Rv感染巨噬細(xì)胞中Mcl-1的表達(dá)，檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌H37Rv感染巨噬細(xì)胞凋亡率，通過(guò)結(jié)核分枝桿菌菌落計(jì)數(shù)判斷巨噬細(xì)胞凋亡對(duì)結(jié)核分枝桿菌的清除效果，探討Mcl-1信號(hào)通路阻斷劑在結(jié)核分枝桿菌H37Rv感染小鼠巨噬細(xì)胞凋亡中的調(diào)控作用。

材料和方法

1材料

1.1菌株結(jié)核分枝桿菌國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株H37Rv株購(gòu)自中國(guó)藥物生物制品檢定所。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6～8周齡SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠，體重18～20 g，購(gòu)于石河子大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.3主要試劑Mcl-1兔多克隆抗體粉型，Mcl-1 多克隆抗體購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司；PV6001 polink-1辣根過(guò)氧化物酶檢測(cè)試劑盒購(gòu)于中杉金橋；Annexin V-APC/7-AAD凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；其余實(shí)驗(yàn)試劑均取自石河子大學(xué)病理實(shí)驗(yàn)室。

2方法

2.1實(shí)驗(yàn)菌株及菌懸液的制備取生物安全柜內(nèi)改良羅氏培養(yǎng)基上生長(zhǎng)2～3周狀態(tài)良好的結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌落置滅菌研菌器中，加少量含0.05% Tween-20的生理鹽水溶液充分研磨，使其成均勻渾濁的菌懸液。麥?zhǔn)媳葷岱ㄕ{(diào)細(xì)菌濃度約1.0×1010CFU/L。

2.2動(dòng)物模型的建立及分組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為5組，即H37Rv感染組、AG490處理組、PD98059處理組、 LY294002處理組和對(duì)照組，每組10只。

2.3小鼠感染模型的建立小鼠腹腔注射H37Rv結(jié)核分枝桿菌造模，注射量約為0.3 mL，AG490、PD98059和LY294002各100 μg經(jīng)腹腔注射方式作用于各組感染小鼠模型，對(duì)照組小鼠僅注射滅菌生理鹽水溶液0.3 mL，感染小鼠置生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，IVC籠具中飼養(yǎng)。在各組感染小鼠的動(dòng)物模型復(fù)制注射后第5天剖殺小鼠，提取小鼠腹腔巨噬細(xì)胞。

2.4小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的收集將小鼠脫頸處死，仰臥固定于操作臺(tái)，腹腔注入無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液5 mL，靜置5 min，注射器抽取腹腔液約4 mL，離心洗滌后顯微鏡下計(jì)數(shù)，調(diào)整至所需濃度，接種于放有無(wú)菌蓋玻片的6孔板內(nèi)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.5抗酸染色方法滴加復(fù)紅染色劑，染色 5 min，水洗。加3%鹽酸乙醇脫色1 min，水洗。加亞甲蘭復(fù)染劑，染色1 min，水洗待干。抗酸染色結(jié)核桿菌陽(yáng)性菌體染后呈鮮紅色，胞核呈藍(lán)色。

2.6細(xì)胞免疫化學(xué)觀察I抗兔抗鼠Mcl-1(37 °C，1 h)，陰性對(duì)照以PBS代替I抗，PBS洗3次，每次5 min， II 抗為PV6001山羊抗兔IgG/HRP聚合物，PBS洗3次，每次5 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染2 min，中性樹脂封片。染色以細(xì)胞核或細(xì)胞漿中出現(xiàn)淡黃色或棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞，高倍鏡視野下綜合細(xì)胞染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞所占比例進(jìn)行評(píng)分，每張切片隨機(jī)觀察5個(gè)視野，計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞所占比例進(jìn)行評(píng)分。按染色百分?jǐn)?shù)及強(qiáng)弱分成(-)～ (+++)進(jìn)行定性判定：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<10%為(-)，10%～40% (+)，41%～70% (++)，>70% (+++)[3]。

2.7流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率按照Annexin V-APC/7-AAD凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書操作，取出細(xì)胞培養(yǎng)板，離心去除上清液，加入100 μL 1×binding buffer重懸細(xì)胞，輕輕混勻后，再加入5 μL Annexin V-APC和10 μL 7-AAD，避光孵育15 min，最后加入380 μL 1×binding buffer，30 min內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2.8結(jié)核分枝桿菌菌落計(jì)數(shù)將取出的腹腔液放入離心機(jī)中，6 000 r/min離心20 min，去上清液，加入1 mL 1% Triton X-100對(duì)巨噬細(xì)胞進(jìn)行裂解，鏡下觀察，待巨噬細(xì)胞全部裂解后(約10 min)，加入1 mL DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)終止裂解，微型振蕩器上振蕩混勻5 min，分別做10-2、10-3和10-4倍稀釋，接種于羅氏培養(yǎng)基，每個(gè)稀釋度涂布3個(gè)平板，置于37 ℃溫箱中培養(yǎng)，21 d后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0軟件處理，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較用t檢驗(yàn)或方差分析，方差分析后組間兩樣本均數(shù)的比較行q檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料或計(jì)量資料不服從正態(tài)性且方差不齊時(shí)采用非參數(shù)檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1細(xì)胞抗酸染色

100倍物鏡明視野下，陽(yáng)性病例可見(jiàn)感染的巨噬細(xì)胞內(nèi)散在排列的紅色短小抗酸桿菌，對(duì)照組均為陰性，見(jiàn)圖1。

Figure 1.Cell acid-fast staining.

圖1細(xì)胞抗酸染色

3檢測(cè)各組巨噬細(xì)胞凋亡率結(jié)果

流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，H37Rv感染組細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組高(P<0.05)，AG490處理組細(xì)胞凋亡率高于H37Rv感染組，LY294002處理組細(xì)胞凋亡率高于AG490處理組，PD98059處理組細(xì)胞凋亡率顯著高于各組細(xì)胞凋亡率(P<0.05)，見(jiàn)圖3、表1。

4結(jié)核分枝桿菌菌落計(jì)數(shù)

結(jié)核分枝桿菌菌落計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，H37Rv感染組菌落數(shù)最高，各處理組菌落數(shù)均較H37Rv感染組低，H37Rv感染組與對(duì)照組之間差異顯著(P<0.05)，其中，PD98059處理組菌落數(shù)最低(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

2小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中Mcl-1的表達(dá)

Mcl-1主要在細(xì)胞漿表達(dá)，部分呈核質(zhì)型，陽(yáng)性細(xì)胞胞漿或胞核呈淡黃色、黃色或棕黃色顆粒，50例5種不同組小鼠Mcl-1的陽(yáng)性表達(dá)率分別如下：H37Rv感染組表達(dá)率為100%(10/10)，AG490處理組表達(dá)率為100%(10/10)，PD98059處理組為20%(2/10)， LY294002處理組為100%(10/ 10)。H37Rv感染組、AG490處理組和LY294002處理組中的Mcl-1蛋白為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，PD98059處理組中Mcl-1蛋白為弱陽(yáng)性表達(dá)，對(duì)照組Mcl-1蛋白為陰性表達(dá)，Mcl-1蛋白在H37Rv感染組與對(duì)照組之間差異顯著(P<0.05)，見(jiàn)圖2、表1。

討論

有研究發(fā)現(xiàn)，用活菌 H37Ra 或滅活菌H37Rv 感染小鼠腹腔巨噬細(xì)胞 10 h 后抗酸染色即可計(jì)數(shù)、觀察巨噬細(xì)胞吞噬活菌的情況[4]，實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞抗酸染色技術(shù)發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞內(nèi)吞噬的結(jié)核分枝桿菌，抗酸染色技術(shù)特異性高，可以明確診斷結(jié)核疾病[5]，是結(jié)核分枝桿菌H37Rv感染小鼠腹腔巨噬細(xì)胞造模成功的保證。

Figure 2.The expression of Mcl-1 in infected macrophages.

圖2各組感染巨噬細(xì)胞中Mcl-1的表達(dá)

Figure 3.The apoptotic rate ofMycobacteriumtuberculosin-infected macrophages detected by flow cytometry.

圖3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)感染結(jié)核分枝桿菌巨噬細(xì)胞的凋亡率

表1　Mcl-1在感染巨噬細(xì)胞中的表達(dá)和各組感染巨噬細(xì)胞的凋亡率

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsH37Rv;△P<0.05vsAG490;▲P<0.05vsPD98059.

Figure 4.Colony-forming unit counting ofMycobacteriumtuberculosisin the mouse peritoneal macrophages (log10CFU). Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH37Rv group;△P<0.05vsAG490 group;▲P<0.05vsPD98059 group.

圖4各組巨噬細(xì)胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌菌落計(jì)數(shù)

另有研究發(fā)現(xiàn)Mcl-1在感染的巨噬細(xì)胞中高表達(dá)，Mcl-1的過(guò)表達(dá)可以抑制細(xì)胞凋亡，在感染的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[6]。同時(shí)，Mcl-1也可參與細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)及細(xì)胞對(duì)藥物敏感性等[7]。結(jié)核分枝桿菌是一種典型的胞內(nèi)致病菌，結(jié)核免疫主要是細(xì)胞免疫，結(jié)核分枝桿菌侵入機(jī)體，既可被巨噬細(xì)胞吞噬和殺滅，也可通過(guò)多種特殊受體逃避殺傷機(jī)制而在巨噬細(xì)胞中存活、繁殖。Sly等[8]證實(shí)結(jié)核分枝桿菌通過(guò)上調(diào)Mcl-1等抗凋亡基因的表達(dá)，抑制或下調(diào)巨噬細(xì)胞的凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌H37Rv感染巨噬細(xì)胞后，巨噬細(xì)胞中Mcl-1的表達(dá)水平在感染4 h后開始升高，24 h達(dá)到高峰，一直維持到感染的48 h，有文獻(xiàn)報(bào)道[9]在小鼠感染模型復(fù)制成功后第9天巨噬細(xì)胞凋亡率最高，9 d之后逐漸降低，為了研究Mcl-1與細(xì)胞凋亡率的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)選在小鼠感染結(jié)核分枝桿菌H37Rv的第3天注射信號(hào)通路阻斷劑，以小鼠感染注射模型的第5天(即感染結(jié)核分枝桿菌H37Rv的第9天)作為時(shí)間節(jié)點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)H37Rv感染組中Mcl-1呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，結(jié)核分枝桿菌誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡率較低，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)結(jié)核分枝桿菌H37Rv通過(guò)上調(diào)Mcl-1的表達(dá)來(lái)抑制巨噬細(xì)胞的凋亡。提示Mcl-1過(guò)表達(dá)可抵抗結(jié)核分枝桿菌感染中的巨噬細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌感染巨噬細(xì)胞中的凋亡平衡受到異常調(diào)控，巨噬細(xì)胞凋亡量減少。

結(jié)核分枝桿菌感染宿主細(xì)胞后，所涉及的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路較為肯定的有JAK/STAT、MAPK、PI3K/AKT等。這些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的持續(xù)激活導(dǎo)致Mcl-1的表達(dá)上調(diào)，Tsutsui等[10]研究證實(shí)在NK/T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株中，AG490通過(guò)阻斷JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制STAT3的活化來(lái)下調(diào)Mcl-1表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，在人巨細(xì)胞病毒中，抑制ERK-MAPK 依賴的通路中蛋白的轉(zhuǎn)錄，Mc1-1蛋白的水平下調(diào)[11]，ERK 1/2的特異性抑制劑PD98059常作為MAPK傳遞途徑的生物阻斷劑來(lái)研究細(xì)胞的凋亡，通過(guò)抑制MEK的活性來(lái)抑制ERK的磷酸化，起到阻斷MAPK信號(hào)通路的作用[12]，Gao等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在人白血病細(xì)胞系中，LY294002可通過(guò)抑制AKT的活性來(lái)下調(diào)Mcl-1蛋白的表達(dá)，增加抗腫瘤劑的殺傷力。本研究應(yīng)用JAK酶抑制劑AG490、MAPK抑制劑PD98059和PI3K蛋白激酶抑制劑LY294002作用于感染H37Rv的小鼠模型，觀察結(jié)核分枝桿菌H37Rv感染巨噬細(xì)胞凋亡中Mcl-1的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AG490處理組和LY294002處理組中的Mcl-1表達(dá)水平較感染組無(wú)變化，PD98059處理組中Mcl-1的表達(dá)水平明顯受到抑制，流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)各處理組的巨噬細(xì)胞凋亡率，結(jié)果顯示各組巨噬細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組均升高。結(jié)核桿菌菌落數(shù)結(jié)果顯示，H37Rv感染組菌落數(shù)較高，各處理組菌落數(shù)較H37Rv感染組低，實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，Mcl-1信號(hào)通路阻斷劑AG490、PD98059和LY294002可以通過(guò)阻斷JAK/STAT、MAPK和PI3K信號(hào)通路來(lái)增加結(jié)核分枝桿菌H37Rv感染巨噬細(xì)胞凋亡率，從而殺死潛伏其中的結(jié)核分枝桿菌。

研究發(fā)現(xiàn)，RAS-RAF-MEK-ERK信號(hào)通路可導(dǎo)致PI3K/AKT通路的活化[14]，巨噬細(xì)胞感染結(jié)核分枝桿菌后，可能通過(guò)激活酪氨酸蛋白激酶、使JAK2/STAT1-α磷酸化，STAT1-α受到活化誘導(dǎo)細(xì)胞生成大量TNF-α[15]，caspase酶系的活性增強(qiáng)，從而啟動(dòng)凋亡。Caspase酶系對(duì)Mcl-1的分解作用可能是Mcl-1表達(dá)下調(diào)的主要原因，由此推測(cè)，AG490、PD98059和LY294002阻斷JAK/STAT、MAPK和PI3K信號(hào)通路后，TNF-α作用受到抑制，caspase酶系活性降低，Mcl-1表達(dá)水平上調(diào)，TNF-α受到抑制致使Mcl-1上調(diào)的這種作用可能拮抗了信號(hào)通路阻斷劑所致的Mcl-1下調(diào)的作用，導(dǎo)致AG490處理組和LY294002處理組中Mcl-1的表達(dá)水平無(wú)明顯變化，在MAPK信號(hào)通路中，TNF-α受p38 MAPK和ERK兩條支路調(diào)控，實(shí)驗(yàn)中，PD98059處理組干擾Mcl-1的作用最明顯，巨噬細(xì)胞凋亡率最高，這種現(xiàn)象可能是由于ERK支路被阻斷后，p38 MAPK通路活化生成大量TNF-α，caspase酶系活性增加，Mcl-1的表達(dá)下調(diào)。結(jié)核桿菌菌落數(shù)結(jié)果顯示，各處理組中PD98059處理組菌落數(shù)最低，實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明PD98059通過(guò)抑制結(jié)核分枝桿菌H37Rv感染巨噬細(xì)胞中Mcl-1明顯增加巨噬細(xì)胞的凋亡從而殺滅結(jié)核分枝桿菌，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示MAPK信號(hào)通路在結(jié)核分枝桿菌H37Rv感染巨噬細(xì)胞中起著重要的作用。

細(xì)胞凋亡受多種因子及信號(hào)途徑的調(diào)節(jié)，結(jié)核的發(fā)生發(fā)展也是多途徑共同作用的結(jié)果，在結(jié)核分枝桿菌感染中，巨噬細(xì)胞的凋亡、結(jié)核分枝桿菌的清除是通過(guò) Mcl-1信號(hào)通路途徑JAK/STAT、MAPK和 PI3K/AKT轉(zhuǎn)導(dǎo)的，我們通過(guò)應(yīng)用信號(hào)通路阻斷劑AG490、PD98059和LY294002來(lái)抑制Mcl-1的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PD98059明顯抑制結(jié)核分枝桿菌H37Rv感染巨噬細(xì)胞中Mcl-1的表達(dá)，結(jié)核分枝桿菌的清除作用增加，由于多種生存和分化信號(hào)參與了Mcl-1表達(dá)的調(diào)節(jié)，JAK/STAT、MAPK、 PI3K/AKT、Mcl-1與其它凋亡調(diào)節(jié)基因及信號(hào)分子之間的相互作用尤其復(fù)雜，下一步實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步研究Mcl-1與其它信號(hào)通路間的相互作用，希望信號(hào)通路阻斷劑在結(jié)核分枝桿菌H37Rv感染巨噬細(xì)胞凋亡中對(duì)Mcl-1的抑制作用可以為結(jié)核疾病開辟一條新的治療途徑。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Kodama T, Hikita H, Kawaguchi T, et al. Mc1-1 and Bcl-xL regulate Bak/Bax-dependent apoptosis of the megakaryocytic lineage at multistages[J]. Cell Death Differ, 2012, 19(11):1856-l869.

[2]Thomas LW, Lam C, Edwards SW. Mcl-1; the molecular regulation of protein function[J]. FEBS Lett， 2010, 584(14):2981-2989.

[3]楊威，胡虞乾，楊紅杰，等. Mcl-1在肝硬化和肝癌組織中的表達(dá)及臨床意義[J].華夏醫(yī)學(xué), 2013, 26(6):1052-1056.

[4]何宗林，杜先智. 活菌H37Ra與滅活菌H37Rv感染小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中國(guó)免疫學(xué)雜志, 2011, 27(8):675-680.

[5]Kohli R, Punia RS, Kaushik R, et al. Relative value of immunohistochemistry in detection of mycobacterial antigen in suspected cases of tuberculosis in tissue sections[J]. Indian J Pathol Microbiol, 2014, 57(4):574-578.

[6]王嬋，王新敏，王飛雨，等. Mcl-1短發(fā)夾RNA在Raw264.7細(xì)胞內(nèi)特異性的篩選 [J]. 中國(guó)免疫學(xué)雜志, 2015, 31(2):151-155.

[7]Karami H, Baradaran B, Esfehani A, et al. Down-regulation of Mcl-1 by small interference RNA induces apoptosis and sensitizes HL-60 leukemia cells to etoposide[J]. Asian Pac J Cancer Prev, 2014, 15(2):629-635.

[8]Sly LM, Hingley-Wilson SM, Reiner NE, et al. Survival ofMycobacteriumtuberculosisin host macrophages involves resistance to apoptosis dependent upon induction of antiapoptotic Bcl-2 family member Mcl-1[J].J Immunol, 2003, 170(1):430-437.

[9]董江濤，徐芳，田璽擇，等. 不同毒力結(jié)核分枝桿菌感染小鼠對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞的凋亡率及其 時(shí)相性變化的影響[J]. 中國(guó)免疫學(xué)雜志, 2012, 28(5):389-392.

[10]Tsutsui M, Yasuda H, Suto H, et al. Frequent STAT3 activation is associated with Mcl-1 expression in nasal NK-cell lymphoma[J]. Int J Lab Hematol, 2010, 32(4):419-426.

[11]Reeve MB, Breidenstein A, Compton T. Human cytomegalovirus activation of ERK and myeloid cell leukemia-1 protein correlates with survival of latently infected cells [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2012, 109(2):588-593.

[12]Mazzon E, Impellizzeri D, Di paola R, et al. Effects of mitogen-activated protein kinase signaling pathway inhibition on the development of cerulein-induced acute pancreatitis in mice[J]. Pancreas, 2012, 41(4):560-570.

[13]Gao N, Cheng S, BudHraja A, et al. 3, 3’-Diindolylmethane exhibits antileukemic activityinvitroandinvivothrough a Akt-dependent process[J]. PLoS One, 2012, 7(2):1-10.

[14]Yajima I, Kumasaka MY, Thang ND, et al. RAS/RAF/MEK/ERK and PI3K/PTEN/AKT signaling in malignant melanoma progression and therapy[J]. Dermatol Res Pract, 2012, 2012:354191.

[15]Subbian S, O’Brien P, Kushner NL, et al. Molecular immunologic correlates of spontaneous latency in a rabbit model of pulmonary tuberculosis[J]. Cell Commun Signal, 2013, 11(1):16.

(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅森)

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