江丹英 林雪峰 王兵勇 陳靜 應(yīng)華永

[摘要] 目的 了解醫(yī)院感染肺炎克雷伯菌的臨床分布及對常用抗菌藥物的耐藥性，為臨床預(yù)防肺炎克雷伯菌相關(guān)醫(yī)院感染及合理選用抗菌藥物提供依據(jù)。 方法 收集2012年1月～2014年12月醫(yī)院感染患者臨床標(biāo)本中分離到的肺炎克雷伯菌，利用西門子WalkAway96全自動微生物分析儀進(jìn)行菌種鑒定和藥敏試驗，采用CLSI推薦的ESBLs表型確證試驗、三維試驗、Hodge試驗分別對ESBLs酶、AmpC酶和KPC型碳青霉烯酶進(jìn)行檢測，數(shù)據(jù)分析采用WHONET5.6和MDR1.0。 結(jié)果 1014株肺炎克雷伯菌主要分布在重癥監(jiān)護(hù)病房（19.92%）和新生兒病房（11.34%），主要來源于呼吸道標(biāo)本（52.27%）和尿液標(biāo)本（17.16%）。肺炎克雷伯菌對不同抗菌藥物呈不同程度的耐藥性，其中對亞胺培南、美洛培南、頭孢哌酮/舒巴坦和阿米卡星的耐藥率最低（均低于7.4%），對哌拉西林的耐藥率最高（81.76%）。1014株肺炎克雷伯菌中，35.11%為產(chǎn)ESBLs菌株，15.98%為產(chǎn)AmpC酶菌株，5.03%為產(chǎn)KPC酶菌株，50.98%為多重耐藥菌株。 結(jié)論 醫(yī)院感染肺炎克雷伯菌的耐藥性日趨嚴(yán)重，監(jiān)測肺炎克雷伯菌的耐藥趨勢及產(chǎn)酶情況對指導(dǎo)臨床用藥有重要意義。

[關(guān)鍵詞] 肺炎克雷伯菌；分離率；來源分布；耐藥性

[中圖分類號] R378.9 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B [文章編號] 1673-9701（2015）34-0117-04

Clinical distribution and drug resistance of Klebsiella pneumoniae causing nosocomial infections

JIANG Danying1 LIN Xuefeng1 WANG Bingyong1 CHEN Jing1 YING Huayong2

1.Medical Center， Yueqing Hospital Affiliated to Wenzhou Medical College， Yueqing 325600， China； 2. Clinical Laboratory， Jinhua Central Hospital in Zhejiang Province， Jinhua 321000， China

[Abstract] Objective By analysising the distribution and drug resistance of Klebsiella pneumoniae （KPN）， to prevent pneumonia klebsiella bacteria causing nosocomial infections， to reasonably chose antibiotic agents. Methods The KPN isolated from nosocomial infections patients's clinical specimens from January 2012 to December 2014 was collected. Bacterial identification and drug susceptibility testing were performed by Siemens WalkAway96 automatic microbial analyzer， ESBLs enzymes were tested by ESBLs phenotypic corroboration test， AmpC enzyme was detected by three-dimensional test， and KPC enzyme was tested by Hodge test which were recommended by CLSI， data analysis was conducted by WHONET5.6 and MDR1.0. Results The 1014 strains of KPN were mainly distributed in intensive care unit （19.92%） and neonatal ward （11.34%）， mainly from respiratory tract specimens （52.27%） and urine specimens （17.16%）. The drug resistance of KPN was different to various antibiotics， resistance rate to imipenem， meropenem， Cefoperazone/sulbactam and amikacin was minimum （lower than 7.4%）， to piperacillin pull methicillin resistant rate was the highest （81.76%）. The detection rate in 1014 strains of Klebsiella pneumoniae of ESBLs， AmpC and KPC were 35.11%， 15.98% and 5.03%， Multiple drug-resistant was 50.98%. Conclusion Hospital infection Klebsiella pneumoniae bacteria drug resistance has become increasingly serious， Monitoring of Klebsiella pneumonia bacteria resistant trend and enzyme production has important significance to guide the clinical medication.

[Key words] Klebsiella pneumonia； Separation rate； Source distribution； Drug resistance

肺炎克雷伯菌（klebsiella pneumonia，KPN）是引起醫(yī)院感染最重要的致病菌之一，也是常見的多耐藥菌，可引起肺炎、腹膜炎、泌尿系統(tǒng)感染、敗血癥等疾病。近年來，隨著抗菌藥物，特別是廣譜頭孢菌素類和碳青霉烯類抗菌藥物的廣泛使用，使得該菌引起的醫(yī)院感染呈上升趨勢，其耐藥性也日趨嚴(yán)重，特別是耐碳青霉烯類菌株的出現(xiàn)給臨床治療造成了極大困難[1]。 為了解我院醫(yī)院感染肺炎克雷伯菌的臨床分布特點以及對常用抗菌藥物的耐藥情況，希望能為臨床治療提供有效依據(jù)。本調(diào)查選擇我院2012年1月～2014年12月醫(yī)院感染患者送檢標(biāo)本中分離到的1014株肺炎克雷伯菌的臨床分布和耐藥性進(jìn)行回顧性分析，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 菌株來源

收集2012年1月～2014年12月醫(yī)院感染患者臨床標(biāo)本中分離出的肺炎克雷伯菌，共1014株，同一患者相同標(biāo)本多次分離的菌株不重復(fù)計入。

1.2 菌株鑒定及藥敏試驗

按《全國臨床檢驗操作規(guī)程》進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)分離，使用西門子公司的WalkAway 96全自動微生物分析儀及配套試劑進(jìn)行菌種鑒定和藥敏試驗。

1.3 ESBLs酶檢測

采用西門子公司的WalkAway 96全自動微生物分析儀及配套試劑進(jìn)行ESBLs酶檢測，其中儀器進(jìn)行頭孢他啶和頭孢他啶/克位維酸以及頭孢噻肟和頭孢噻肟/克拉維酸的MIC測定，如果與克拉維酸聯(lián)合的藥物MIC相對單獨(dú)藥物MIC減低≥3個倍比稀釋度，則判斷為ESBLs酶陽性。

1.4 AmpC酶檢測

篩選頭孢西丁耐藥的菌株進(jìn)行AmpC酶檢測，檢測方法參見Coudron等[2]和江勇等[3]的方法進(jìn)行檢測：①酶的提?。篍ppendorf管中加無菌蒸餾水1.5 mL，加入35℃過夜培養(yǎng)菌落2～3個，菌液濃度約10億，放-20℃冰箱反復(fù)凍融5～8次，最后1次從冰箱取出，待解凍后（菌液約在0℃）馬上放微型離心機(jī)中10 000 r/min離心5 min，取上清粗酶液備用。②三維試驗檢測：將大腸埃希菌ATCC25922稀釋成0.5麥?zhǔn)蠁挝?，涂布?0 mm的M-H平板上，平板中心貼頭孢西丁30 μL紙片，距離紙片邊緣5 mm處，用內(nèi)徑為2 mm無菌打孔器打孔，棄去挖出的瓊脂，將提取的粗酶液30 μL加入打好的孔中，35℃過夜觀察結(jié)果[2]。

1.5 KPC型碳青霉烯酶檢測

篩選碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的菌株進(jìn)行檢測，采用美國臨床實驗標(biāo)準(zhǔn)化委員會推薦的改良Hodge試驗進(jìn)行檢測：將大腸埃希菌（ATCC25922）采用無菌生理鹽水調(diào)成0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙汉笥蒙睇}水再進(jìn)行1∶10稀釋，采用無菌棉簽將稀釋后菌液均勻涂布于M-H平板上，并將美洛培南紙片貼于M-H平板上，用無菌接種環(huán)挑取3～5個過夜生長待測肺炎克雷伯菌落從紙片邊緣開始劃線接種，劃線長度為20～25 mm，經(jīng)35℃孵育16～20 h后觀察結(jié)果，如果在待測肺炎克雷伯菌與大腸埃希菌（ATCC25922）抑菌圈交匯處見大腸埃希菌生長增強(qiáng)，即判斷該待測肺炎克雷伯菌產(chǎn)KCP型碳青霉烯酶。

1.6 多重耐藥菌株的定義

采用2010年美國、瑞典等國家的一些專家共同提出的《關(guān)于MDR、XDR、PDR術(shù)語國際標(biāo)準(zhǔn)化定義專家建議（草案）》[4]中對腸桿菌科細(xì)菌的MDR菌株的定義，即對以下16類抗菌藥物中3類或3類以上抗菌藥物不敏感株為多重耐藥肺炎克雷伯菌。其中16類抗菌藥物包括氨基糖苷類、碳青霉烯類、非廣譜頭孢菌素類、廣譜頭孢菌素類、頭霉素類、葉酸代謝抑制劑、甘氨酰環(huán)素類、單環(huán)β-內(nèi)酰胺類、氟喹諾酮類、青霉素類、抗假單胞菌青霉素+酶抑制劑、青霉素類+酶抑制劑、氯霉素類、磷酸類、多粘菌素類和四環(huán)素類。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用WHO NET5.6軟件對菌株分布及藥敏資料進(jìn)行統(tǒng)計分析，應(yīng)用MDR1.0軟件對肺炎克雷伯菌的多重耐藥菌株進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 肺炎克雷伯菌在不同標(biāo)本中分布

3年來肺炎克雷伯菌在不同標(biāo)本中的分布構(gòu)成基本維持不變，1014株肺炎克雷伯菌中，來自呼吸道標(biāo)本最多，占總標(biāo)本數(shù)的52.27%，位列第2、第3和第4的分別是尿液、膿液及創(chuàng)口分泌物和血液，各占17.16%、13.81%和9.96%。見表1。

2.2 肺炎克雷伯菌在不同科室中分布

3年來肺炎克雷伯菌在不同科室中的分布基本維護(hù)不變，1014株肺炎克雷伯菌中，來自重癥監(jiān)護(hù)病房最多，占19.92%，其次是新生兒病房，占11.34%，見表2。

2.3 耐藥情況

1014株肺炎克雷伯菌對23種抗菌藥物呈不同程度的耐藥性，其中對亞胺培南、美洛培南、頭孢哌酮/舒巴坦和阿米卡星的耐藥率最低（均低于7.4%），對哌拉西林的耐藥率最高（為81.76%）。1014株肺炎克雷伯菌對23種抗菌藥物的藥敏數(shù)據(jù)見表3。

表3 1014株肺炎克雷伯菌對23種抗菌藥物的藥敏率（%）

2.4 產(chǎn)ESBLs、產(chǎn)AmpC、產(chǎn)KPC型碳青霉烯酶和多重耐藥肺炎克雷伯菌檢出情況

1014株肺炎克雷伯菌中檢出產(chǎn)ESBLs菌株356株，占35.11%，檢出產(chǎn)AmpC菌株162株，占15.98%，檢出產(chǎn)KPC型碳青霉烯酶菌株51株，占5.03%，檢出多重耐藥肺炎克雷伯菌517株，占50.98%。見表4。

表4 1014株肺炎克雷伯菌中產(chǎn)ESBLs、產(chǎn)AmpC、產(chǎn)KPC及多重耐藥肺炎克雷伯菌檢出情況

3 討論

肺炎克雷伯菌是醫(yī)院感染中重要的致病菌之一，可以感染人體的任何組織部位，長期住院、使用廣譜抗生素、機(jī)械通氣、留置導(dǎo)尿管等皆是肺炎克雷伯菌引起醫(yī)院感染的危險因素[5，6]，我院近3年分離到的肺炎克雷伯菌主要來自呼吸道標(biāo)本和尿液標(biāo)本，兩者合計占臨床標(biāo)本的2/3左右（69.43%），其中呼吸道標(biāo)本占臨床標(biāo)本1/2以上（52.27%），可能與呼吸道標(biāo)本與尿液標(biāo)本占臨床標(biāo)本的比例有直接關(guān)系，同時亦表明肺炎克雷伯菌是呼吸道和泌尿道相關(guān)醫(yī)院感染的重要病原菌，這與郝慧明等[7-9]報道結(jié)果基本一致。從肺炎克雷伯菌來源的不同科室來看，來自重癥監(jiān)護(hù)病房和新生兒病房的肺炎克雷伯菌占全院30個病房菌株數(shù)的1/3左右，分別為19.92%和11.34%，可能與重癥監(jiān)護(hù)病房和新生兒病房的患者病情嚴(yán)重和免疫力水平低下有關(guān)[10]。因此，醫(yī)護(hù)人員應(yīng)對重癥監(jiān)護(hù)病房、新生兒病房等肺炎克雷伯菌高發(fā)病房和呼吸道、泌尿道等易感部位做重點監(jiān)測，以便盡早發(fā)現(xiàn)肺炎克雷伯菌相關(guān)醫(yī)院感染，并采取有效措施及時控制。

肺炎克雷伯菌的主要耐藥機(jī)制包括產(chǎn)生各種抗菌藥物滅活酶、生物被膜和外膜孔蛋白缺失等引起的抗菌藥物滲透障礙、主動外排泵系統(tǒng)的作用和藥物作用靶位的改變等[11]。其中ESBLs是臨床肺炎克雷伯菌耐藥產(chǎn)生的最主要的一類滅活酶，該酶是由質(zhì)粒介導(dǎo)的絲氨酸蛋白衍生物，能夠水解青霉素類、廣譜頭孢菌素及單環(huán)β-內(nèi)酰胺類藥物，而且使得產(chǎn)ESBLs的細(xì)菌對氟喹諾酮類、磺胺類和氨基糖甙類抗菌藥物交叉耐藥[8]。AmpC酶主要是由染色體或質(zhì)粒介導(dǎo)產(chǎn)生的一類作用于頭孢菌素類抗菌藥物且不被克拉維酸抑制的β-內(nèi)酰胺酶，與ESBLs酶不同的是AmpC酶對頭孢西丁等頭霉烯類抗菌藥物高水平耐藥，并不被克拉維酸抑制[12]。而KPC型碳青霉烯酶則是肺炎克雷伯菌耐藥產(chǎn)生的后果最為嚴(yán)重的滅活酶，是屬于BUSh分類中2f亞組的A類絲氨酸酶[13，14]，產(chǎn)碳青霉烯酶菌株對碳青霉烯類、青霉素類、廣譜頭孢菌素類及單環(huán)類抗菌藥均耐藥，會給臨床治療帶來極大的困難，并且患者病程明顯延長，死亡率也迅速升高[15]。本組數(shù)據(jù)顯示，1014株KPN中檢出產(chǎn)ESBLs菌356株，檢出率35.11%，低于孔海深等[16]報告的54.6%，與李慧娟[17]報道的35.8%基本一致。1014株KPN中檢出產(chǎn)AmpC菌162株，檢出率為15.98%，高于錢海英報道的5.8%[8]，但低于鄭港森等[18]報道的18.2%。檢出產(chǎn)KPC型碳青霉烯酶菌51株，檢出率為5.03%，與胡慧敏等[19]報道的5.4%基本一致，但高于劉素玲等[20]報道的2.4%。由此說明肺炎克雷伯菌耐藥酶的檢出率因不同地區(qū)、不同級別醫(yī)院、不同時間而有不同程度的差異，可能與不同醫(yī)院的用藥習(xí)慣不同有關(guān)。藥敏結(jié)果顯示，多重耐藥肺炎克雷伯菌的檢出率為50.98%，其中哌拉西林的耐藥率達(dá)91.76%，其他耐藥率>40.0%的還包括頭孢噻吩、頭孢唑啉、頭孢呋辛、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢噻肟和氨曲南等藥物，結(jié)合肺炎克雷伯菌的產(chǎn)酶情況，說明本地區(qū)肺炎克雷伯菌的耐藥情況較嚴(yán)重。本組數(shù)據(jù)顯示，肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類的耐藥率雖然最低，但仍存在耐藥株，其中亞胺培南耐藥率4.14%，美洛培南的耐藥率3.75%，說明隨著碳青霉烯類抗菌藥物的廣泛使用，肺炎克雷伯耐藥菌株會逐步產(chǎn)生，需引起重視[22]。

總之，多重耐藥肺炎克雷伯菌、產(chǎn)ESBLs和產(chǎn)AmpC肺炎克雷伯菌的高分離率及產(chǎn)KPC型碳青酶烯類菌株的出現(xiàn)，是臨床抗感染治療面臨的重大問題，臨床應(yīng)對此引起足夠的重視，并應(yīng)結(jié)合藥敏結(jié)果合理使用抗菌藥物以減少耐藥菌株的產(chǎn)生，應(yīng)提高醫(yī)院感染意識以控制產(chǎn)酶菌株在醫(yī)院感染的發(fā)生與流行。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 肖永紅，王進(jìn)，朱燕，等. Mohnarin 2008年度全國細(xì)菌耐藥監(jiān)測[J]. 中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2010，20（16）：2377-2383.

[2] Coudron PE，Moland ES，Thomoson KS. Occurrence and detection of AmpC beta-lactamases among escherichia coli，klebsiella pneumoniae，and proteus mirabilis isolates at a veterans medical center[J]. J Clin Microbiol，2008，38（5）：1791-1796.

[3] 江勇，林婭，童夏生，等. 下呼吸道感染產(chǎn)AmpC β-內(nèi)酰胺酶肺炎克雷伯菌的耐藥性及基因型研究[J]. 中國微生態(tài)雜志，2014，26（1）：51-54.

[4] 李春輝. 醫(yī)院機(jī)構(gòu)耐藥菌MDR、XDR、PDR的國際標(biāo)準(zhǔn)化定義專家建議（草案）[J]. 中國感染控制雜志，2011，10（3）：238-240.

[5] 劉蘊(yùn)婷，林冠文，方曉琳，等. 醫(yī)院獲得性肺炎病原菌分布及危險因素分析[J]. 現(xiàn)代醫(yī)院，2015，15（5）：25-27.

[6] 符愛玉，李云婷，吳鈺涵，等. 住院患者尿路感染相關(guān)因素分析及預(yù)防對策[J]. 中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2014，24（21）：5315-5317.

[7] 郝慧明，韓蘭芳. 肺炎克雷伯菌1132株的臨床分布及耐藥性分析[J]. 實用醫(yī)技雜志，2014，21（11）：1179-1180.

[8] 錢海英. 肺炎克雷伯菌產(chǎn)ESBLs和AmpC酶的檢測及耐藥性分析[J]. 中華全科醫(yī)學(xué)，2014，12（2）：274-275.

[9] 張虎，閆中強(qiáng)，曹晉桂，等. 醫(yī)院感染肺炎克雷伯菌耐藥趨勢及β-內(nèi)酰胺酶基因型分析[J]. 中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2014，24（21）：5207-5210.

[10] 王曉君，應(yīng)斌松. 醫(yī)院感染肺炎克雷伯菌的分布及耐藥性分析[J]. 海峽藥學(xué)，2013，25（3）：183-184.

[11] 林華勝，張薇，李國明. 肺炎克雷伯菌耐藥機(jī)制的研究進(jìn)展[J]. 中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2014，11（12）：151-154.

[12] 何昕，多麗波. AmpCβ-內(nèi)酰胺酶實驗室檢測方法及進(jìn)展[J]. 中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2011，21（21）：4638-4640.

[13] 李軻，趙克斌. 產(chǎn)碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的耐藥機(jī)制及治療進(jìn)展[J]. 中國藥物與臨床，2014，14（6）；779-781.

[14] 王娜，劉志勇，路娟，等. 有關(guān)肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯酶的研究進(jìn)展[J]. 國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2014，35（2）；200-202.

[15] Livermore DM. Mechanisms of resistance to beta-lactam antibiotics[J]. Scand J Infect Dis Suppl，1991，78：7-16.

[16] 孔海深，張偉麗，楊青，等. Mohnarin2011年度報告：中南地區(qū)細(xì)菌耐藥監(jiān)測[J]. 中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2012， 22（22）：4977-4982.

[17] 李慧娟，周東鵬，趙楠. 2011-2013年肺炎克雷伯菌的分布與耐藥性變遷[J]. 中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2015，25（12）：2670-2672.

[18] 鄭港森，劉贊贊，張加勤，等. 大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌質(zhì)粒型AmpC酶基因型的檢測分析[J]. 國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2015，36（11）：1505-1506.

[19] 胡慧敏，王欣慧. 產(chǎn)KPC型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的檢測與耐藥狀況分析[J]. 國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2014， 35（22）：3119-3120.

[20] 劉素玲，候鐵英，何啟勇，等. 肺炎克雷伯菌耐藥表型的分布及其耐藥性分析[J]. 中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2012， 22（17）：3694-3696.

[21] 趙曉杰，鄧麗華，施德仕，等. 碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌分子流行病學(xué)和耐藥基因分析[J]. 國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2015，36（11）：1530-1532.

[22] 葉相如，胡必杰，周春妹，等. 耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌感染與定植患者預(yù)后相關(guān)因素分析[J]. 中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2015，25（11）：2489-2491.

（收稿日期：2015-07-17）