抗疏健骨顆粒水提工藝研究

杜星，郭東艷，史傳道，王露，曹瑞

(陜西中醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712046)

摘要：目的優(yōu)化抗疏健骨顆粒水提工藝條件，為抗疏健骨顆粒劑的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。方法以β-蛻皮甾酮含量及出膏率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)正交試驗(yàn)篩選抗疏健骨顆粒最佳水提工藝。結(jié)果影響水提工藝各因素的作用主次為:C提取次數(shù)>B提取時(shí)間>A溶劑用量，最佳提取工藝條件是A2B2C3，即用10倍量水，提取3次,每次90 min。結(jié)論通過(guò)單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)選得到的抗疏健骨顆粒中牛膝、白術(shù)2味藥材的水提工藝條件穩(wěn)定可行。

關(guān)鍵詞：抗疏健骨顆粒；β-蛻皮甾酮；正交設(shè)計(jì)；提取工藝

DOI:10.13463/j.cnki.jlzyy.2015.01.022

中圖分類號(hào)：R284.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1003-5699(2015)01-0074-03

基金項(xiàng)目:陜西省科技廳資助項(xiàng)目(2012KTCL03-22)。

作者簡(jiǎn)介:杜星(1988-)，女，碩士研究生，主要從事中藥新制劑與新劑型研究。

收稿日期:(責(zé)任編輯：張瑞彬2014-08-06)

Study on the process of water extraction for Kangshu Jiangu Granules

DU Xing,GUO Dongyan,SHI Chuandao,WANG Lu,CAO Rui

(Shaanxi University of Chinese Medicine,Xianyang 712046,Shanxi Provincce,China)

Abstract：ObjectiveTo optimize water extraction method for Kangshu Jiangu Granules and lay a solid foundation for its further study.MethodsThe extracting method of Kangshu Jiangu Granule was optimized by orthogonal design,taking the extraction rate of β-ecdysterone and extract yield as indexes.ResultsThe factors that influence water extraction:C extraction times>B extraction time>A solvent consumption.The optimum extracting condition was A2B2C3:with the volume of 10 folds,extracting for 3 times,90mins one time.ConclusionThe optimum technology is stable and feasible for the extraction of Kangshu Jiangu Granules by orthogonal and single factor experiment.

Keywords:Kangshu Jiangu Granules;β-ecdysterone;orthogonal design;extraction process

抗疏健骨顆粒由淫羊藿、杜仲、牛膝、白術(shù)、丹參等藥物組成，具有補(bǔ)腎健脾、活血壯骨之功，主要用于脾腎兩虛、氣血瘀阻導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松癥。牛膝是我國(guó)常用中藥材之一，具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、通淋利尿、引血下行之功[1]。目前發(fā)現(xiàn)牛膝中的活性成分主要為皂苷、植物甾酮、多糖以及黃酮類和生物堿類物質(zhì)[2]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，牛膝具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗菌、子宮興奮、抗骨質(zhì)疏松等多種作用[3-6]。白術(shù)主要含揮發(fā)油、白術(shù)內(nèi)酯、白術(shù)多糖、苷類、氨基酸等成分，揮發(fā)油中的白術(shù)內(nèi)酯類成分是白術(shù)中比較有特征的成分，也是重要的活性成分[7]，另外蒼術(shù)酮不穩(wěn)定，在空氣中易氧化[8]。白術(shù)具有健脾益氣、調(diào)節(jié)胃腸功能、抗炎、抗腫瘤、抗氧化、延緩腎臟衰老等作用[9-11]。結(jié)合2味藥材所含化學(xué)成分的理化性質(zhì)及現(xiàn)代藥理研究結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)擬在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以β-蛻皮甾酮含量及出膏率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用4因素3水平的L9(34)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)水提工藝進(jìn)行優(yōu)化，為抗疏健骨顆粒的進(jìn)一步研究提供參考依據(jù)。

1實(shí)驗(yàn)材料

1.1材料牛膝(批號(hào)：130401)、白術(shù)(批號(hào)：121201)均購(gòu)于西安盛興中藥飲片有限責(zé)任公司，β-蛻皮甾酮對(duì)照品(供含量測(cè)定用，批號(hào):111638-200603，中國(guó)藥品生物制品檢定所)，乙腈、甲醇、甲酸為色譜純(Honeywell)，水為過(guò)濾后的娃哈哈純凈水。

1.2儀器安捷倫1260型高效液相色譜儀(G1329B型進(jìn)樣器,G1311C型四元泵，G4212B型二極管陣列檢測(cè)器，ChemStation for LC 3D systems)。METTLER TOLEDO(AL204)電子天平(萬(wàn)分之一)，Sartorius MC電子天平(十萬(wàn)分之一)。D101型電熱鼓風(fēng)干燥箱。

2方法與結(jié)果

2.1浸泡時(shí)間及吸水率的考察按處方比例稱取牛膝、白術(shù)，共54 g,加5倍量水進(jìn)行浸泡，至藥物完全浸透，濾去多余水分，藥渣稱重，記錄藥材吸水后的重量，計(jì)算吸水率。

表1　藥材吸水率試驗(yàn)結(jié)果( n=3)

結(jié)果表明，藥材的吸水率為71.4%，即在首次加水時(shí)應(yīng)多加1.0倍量。

2.2β-蛻皮甾酮含量測(cè)定

2.2.1色譜條件Thermo ODSC18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，流動(dòng)相為乙腈-水-甲酸(16∶84∶0.1)，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm，柱溫為室溫。

2.2.2對(duì)照品溶液的制備精密稱取β-蛻皮甾酮對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，即得。

2.2.3供試品溶液制備精密移取各樣品液10 mL，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分別精密吸取β-蛻皮甾酮對(duì)照品溶液(濃度0.1 mg/mL)1,2,4，6，8，10，12 μL，按上述色譜條件注入色譜儀，測(cè)定峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，β-蛻皮甾酮含量(μg)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算的回歸方程為：Y=1 668.2X+104.16，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9,β-蛻皮甾酮在0.1～1.2 μg之間線性關(guān)系良好。

2.2.5樣品測(cè)定精密吸取供試品溶液與對(duì)照品溶液各10 μL，依據(jù)2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。

2.3出膏率的測(cè)定精密吸取各濃縮定容至100 mL的樣品液10 mL,置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，于105 ℃烘箱內(nèi)干燥至恒重，至干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定重量。按下式計(jì)算出膏率。出膏率=[(浸膏重量×10)/藥材重量]×100%

2.4單因素試驗(yàn)

2.4.1提取時(shí)間考察按處方比例稱取牛膝、白術(shù)5份，每份54 g，分別加10倍量水煎煮1次，每次30，60，90，120，150 min，濾過(guò)，濃縮，定容至100 mL量瓶中。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　不同提取時(shí)間考察結(jié)果

2.4.2加水量考察按處方比例稱取牛膝、白術(shù)6份，每份54 g，分別加6，8，10，12，14，16倍量水，煎煮2次,每次90 min，濾過(guò)，合并濾液，濃縮，定容至100 mL量瓶中。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3　不同加水量考察結(jié)果

2.4.3提取次數(shù)考察按處方比例稱取牛膝、白術(shù)4份，每份54 g，加10倍量水分別提取1,2，3，4次，每次90 min，濾過(guò)，濃縮，分別定容至100 mL量瓶中。結(jié)果見(jiàn)表4。β-蛻皮甾酮含量在第1次時(shí)為57.94 μg/mL，第2次為16.58 μg/mL，第3次為6.31 μg/mL。由此可以看出，提取3次時(shí)已基本提取完全。

2.5正交試驗(yàn)優(yōu)選最佳水提工藝

2.5.1試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果[12-15]參照單因素設(shè)計(jì)試驗(yàn)

表4　不同提取次數(shù)考察結(jié)果

結(jié)果，選擇加水量，提取時(shí)間，提取次數(shù)3個(gè)因素，每個(gè)因素選擇3個(gè)水平，按L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)，以出膏率、β-蛻皮甾酮含量的加和為綜合指標(biāo)篩選最佳提取工藝參數(shù)。因素水平表見(jiàn)表5。

表5　因素水平

2.5.1.1試驗(yàn)方法按處方比例稱取牛膝、白術(shù)9份，每份54 g,按照正交試驗(yàn)因素水平表安排用L9(34)正交表進(jìn)行提取，濾過(guò)，濾液濃縮并定容至100 mL量瓶中，備用。

2.5.1.2出膏率測(cè)定精密移取10 mL樣品液至已干燥恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，于105 ℃干燥12 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速稱重。按下式計(jì)算出膏率，結(jié)果見(jiàn)表6。出膏率=[浸膏重量×10/藥材重量]×100%。

2.5.1.3β-蛻皮甾酮含量測(cè)定按單因素項(xiàng)下供試品溶液制備方法，制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算β-蛻皮甾酮含量，結(jié)果見(jiàn)表6,方差分析結(jié)果見(jiàn)表7。綜合評(píng)分(OD)=0.4W1/Wmax1+0.6W2/Wmax2

表6　正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表7　正交試驗(yàn)方差分析

以綜合評(píng)分為考察指標(biāo)，由表6中極差R值大小顯示，各因素的作用主次為C(提取次數(shù))>B(提取時(shí)間)>A(溶劑用量)。表7方差分析結(jié)果表明：C因素各水平之間差異具有顯著性(P<0.05),A、B因素各水平之間差異無(wú)顯著性(P>0.05)。綜上所述最終提取工藝確定為：A2B2C3，即10倍量水提取3次，每次90 min。

2.5.2驗(yàn)證試驗(yàn)為了考察正交試驗(yàn)的結(jié)果是否具有重現(xiàn)性,進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。稱取以上2味藥材3份，每份108 g，按照優(yōu)選的工藝條件進(jìn)行提取，測(cè)定出膏率、β-蛻皮甾酮含量，結(jié)果見(jiàn)表8。

表8　驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明：該工藝條件合理可行，具重現(xiàn)性。

3討論

牛膝是一味補(bǔ)骨中藥，現(xiàn)代藥理研究結(jié)果表明，含牛膝的補(bǔ)骨中藥組方可減輕大鼠子宮重量，增加骨小梁密度、面積、總體積及密質(zhì)骨面積，減小骨髓腔面積[16]，從牛膝中提取的甾酮成分具有明顯的促進(jìn)促成骨細(xì)胞增長(zhǎng)的活性[17]，考慮到甾酮類成分為牛膝中的主要活性成分，因此在工藝篩選中以β-蛻皮甾酮含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)之一。筆者曾對(duì)白術(shù)中所含揮發(fā)油的含量進(jìn)行了預(yù)實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)果表明，白術(shù)中的揮發(fā)油含量過(guò)于偏低，采用水蒸汽蒸餾法提取白術(shù)揮發(fā)油，出油率僅為0.2%。有文獻(xiàn)報(bào)道白術(shù)水煎液可明顯促進(jìn)骨髓細(xì)胞增殖，增強(qiáng)機(jī)體免疫力[18]，綜合考慮到大生產(chǎn)及節(jié)約成本，本方中的白術(shù)考慮舍棄提取揮發(fā)油，直接水煎煮提取白術(shù)中的活性成分，并以出膏率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)之一。

本試驗(yàn)建立了β-蛻皮甾酮含量及出膏率的測(cè)定方法。通過(guò)正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)法優(yōu)選所得的最佳提取工藝為10倍量水提取3次，每次90min，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，該工藝條件合理可行，重現(xiàn)性較好。

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