金銀花與山銀花對致敏大鼠外周血單個核細(xì)胞的影響

李芳1,2，劉冰潔1,2，劉婧慧3，周軍1,2，畢宇安1,2，王振中1,2，蕭偉1,2*

(1.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司 中藥制藥過程新技術(shù)國家重點實驗室,江蘇 連云港 222001；

2.江蘇省企業(yè)院士工作站，江蘇 連云港 222001；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

摘要：目的免疫豚鼠獲取抗血清，觀察金銀花與山銀花中間體等對豚鼠的致敏性及其對大鼠外周血單個核細(xì)胞(PBMC)增殖的影響。方法金銀花和山銀花各中間體等免疫豚鼠并觀察豚鼠致敏情況，收集致敏后豚鼠血清，將其與大鼠PBMC細(xì)胞共孵育24 h，建立致敏細(xì)胞模型。金銀花與山銀花各中間體等與致敏細(xì)胞共培養(yǎng)24 h，CCK-8法檢測大鼠PBMC的增殖情況。結(jié)果金銀花中間體1、2發(fā)生豚鼠過敏反應(yīng)；山銀花中間體1、2發(fā)生豚鼠類過敏和過敏反應(yīng)；金銀花與山銀花中間體等均抑制體外培養(yǎng)的大鼠PBMC的增殖，但兩者相比金銀花抑制率偏低。結(jié)論參照熱毒寧注射液單味模擬藥物的制備工藝，金銀花對豚鼠的致敏性、對大鼠PBMC的抑制率低于山銀花。

關(guān)鍵詞：金銀花；山銀花；外周血單個核細(xì)胞

DOI:10.13463/j.cnki.jlzyy.2015.01.017

中圖分類號：R285.5文獻標(biāo)志碼： A

文章編號：1003-5699(2015)01-0057-04

基金項目:科技部重大新藥創(chuàng)制項目(2013ZX09402203)。

作者簡介:李芳(1980-)，女，碩士，從事藥理學(xué)及注射劑安全性評價研究。

收稿日期:(責(zé)任編輯：張瑞彬2014-08-15)

*通信作者:蕭偉，電話-(0518)85521956，電子信箱-wzhzh-nj@tom.com

Impact of Lonicera japonica and Lonicera confusa on PBMC of sensitized rat

LI Fang1,2,LIU Bingjie1,2,LIU Jinghui3,ZHOU Jun1,2,BI Yu’an1,2,WANG Zhenzhong1,2,XIAO Wei1,2*

(1.Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co.,Ltd.,State Key Laboratory of New Pharmaceutical Process for

Traditional Chinese Medicine,Lianyungang 222001,Jiangsu Province,China;

2.Enterprises Academician Workstations in Jiangsu Province,Lianyungang 222001,Jiangsu Province,China;

3.Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China)

Abstract：ObjectiveTo observe the sensitization of the guinea pig and multiplication of the rat PBMC after getting immunized guinea pig antiserum with the intermediates of Lonicera japonica and Lonicera confus.MethodsAfter observing the allergic reaction of the guinea pigs which were sensitized with the intermediates of Lonicera japonica and Lonicera confusa,the blood serum was collected,then the PBMC of rat was cultured with the blood serum for 24 hours and the cell sensitization model was built.The multiplication of the rat PBMC was detected by CCK-8 technique after the intermediates of Lonicera japonica and Lonicera confusa were cultured with the sensitized cell for 24 hours.ResultsThe one and two intermediates of Lonicera japonica were discovered allergy;The one and two intermediates of Lonicera confusa occurred anaphylactoid reaction and allergy in guinea pig;The intermediates of Lonicera japonica and Lonicera confusa both inhibited the proliferation of the rat PBMC.However,the inhibition rate of the intermediates of Lonicera japonica was lower compared with that of Lonicera confusa.ConclusionThe sensitization of Lonicera japonica in guinea pigs and inhibition ratio of rat PBMC were lower than those of Lonicera confuse with reference to the drug preparation technology of single simulation of Reduning Injection.

Keywords:Lonicera japonica;Lonicera confusa;PBMC

近年來，中藥注射劑研究取得良好進展，品種增多，療效更廣[1-3]。目前已上市的呼吸系統(tǒng)藥物如雙黃連注射液、清開靈注射液中，金銀花藥材出現(xiàn)頻率最高。金銀花作為常用中藥, 《中國藥典》1963年版首次收載[4],山銀花被2005年版藥典首次收載，其植物來源有3種[5]。2005年版藥典將金銀花與山銀花分列后，其檢驗項目并不能將兩種藥材完全區(qū)分開[6]。目前市場上將山銀花作為正品金銀花銷售的現(xiàn)象也很普遍，不良廠商采用山銀花冒充金銀花入藥以獲得高額利潤[7-8]。在實際應(yīng)用中，存在著金銀花與山銀花藥材混用的現(xiàn)象。因此，考察金銀花與山銀花的安全性顯得尤為重要[9]。

1實驗材料

1.1動物豚鼠，體質(zhì)量(300±20)g，雌雄各半，南京安立默科技有限公司提供，合格證號為SCXK(蘇)2010-0002。飼養(yǎng)室溫度為(23±2)℃，相對濕度在40%～70%，2次/d飼喂蔬菜，自由飲食飲水。Wistar大鼠，揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供，合格證號為SCXK(蘇)2012-0004。飼養(yǎng)室溫度為(23±2)℃，相對濕度在40%～70%，自由飲食飲水。

1.2試劑本實驗中的藥材金銀花和山銀花均經(jīng)康緣集團康濟大藥房主管中藥師吳舟鑒定為符合藥典規(guī)定的金銀花與山銀花。金銀花中間體1(水提液)、金銀花中間體2(醇沉液)、金銀花中間體3(過膜前中間體)、金銀花制劑(注射液),江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司提供，批號均為130906,規(guī)格為10 mL/支。山銀花中間體1(水提液1)、山銀花中間體2(醇沉液)、山銀花中間體3(過膜前中間體)、山銀花制劑(注射液)，江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司提供,批號均為140101，規(guī)格為10 mL/支。0.9%NaCl注射液，辰欣藥業(yè)股份有限公司提供，批號為1301158101，規(guī)格為100 mL：0.9 g。10%雞蛋清溶液：將5 mL蛋清以0.9%Nacl注射液10倍稀釋，現(xiàn)用現(xiàn)配。DMEM高糖培養(yǎng)基，gibco公司提供，批號為8113384，規(guī)格為500 mL/瓶。胎牛血清，gibco公司提供，批號為1122050，規(guī)格為500 mL/瓶。淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll-PaqueTMPREMIUM 1.084)，GE公司提供，批號為10070319，規(guī)格為100 mL/瓶。CCK-8細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒，貝博生物提供，批號為BB130041，規(guī)格為5000T。

1.3耗材與儀器設(shè)備96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，CORNING公司提供。infinite M200 PRO酶標(biāo)儀，購自TECAN公司。CO2培養(yǎng)箱，購自Thermo公司。C1028自動細(xì)胞計數(shù)儀,購自invitrogen公司。CKX41SF倒置顯微鏡,購自O(shè)LYMPUS公司。LD4-2A臺式低速離心機，購自湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司。SW-OJ-2FD超凈工作臺，購自蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。BXM-30R高壓蒸汽滅菌器，購自上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療器械。

2實驗方法[10-11]

2.1豚鼠致敏將30只雌雄各半的豚鼠稱重、標(biāo)號，隨機分組，每組3只，共10組,即陽性對照組(10%蛋清)、陰性對照組(0.9%氯化鈉)、金銀花中間體1(水提液)組、金銀花中間體2(醇沉液)組、金銀花中間體3(過膜前中間體)組、金銀花制劑(注射液)組、山銀花中間體1(水提液1)組、山銀花中間體2(醇沉液)組、山銀花中間體3(過膜前中間體)組、山銀花制劑(注射液)組。給藥方式如下：按組別依次腹腔注射10%蛋清、0.9%NaCl、金銀花中間體及制劑1.25 g生藥/kg和山銀花中間體及制劑1.46 g生藥/kg，以無菌方式進行操作，每隔1 d腹腔注射上述10種藥液，注射體積為0.5 mL/只，注射3次。致敏過程觀察豚鼠反應(yīng)。

2.2抗血清制備末次注射14 d后，豚鼠麻醉后以真空采血肝素抗凝管腹主動脈取血，3 000 r/min離心10 min后，吸取抗血清，按組別分別進行混合。將血清置56 ℃水浴中滅活30 min，0.22 μm過濾后-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3大鼠PBMC細(xì)胞分離培養(yǎng)[12-13]大鼠麻醉后，心臟取血4 mL至肝素管抗凝，用0.9%NaCl注射液將血液1∶1稀釋，混勻；另取一離心管，先加入4 mL淋巴細(xì)胞分離液，再將稀釋后的大鼠血液吸4 mL輕輕地疊加在分離液上面，離心機2 000 r/min離心15 min。離心完后將PBMC轉(zhuǎn)移到新試管中，滴加5 mL 0.9%NaCl注射液，輕洗細(xì)胞，離心機1 500 r/min離心5 min，洗2次。將細(xì)胞數(shù)量調(diào)整為1×106個/mL接種于96孔培養(yǎng)板,每孔100 μL。設(shè)9組，分別為:陰性對照組、金銀花中間體1組、金銀花中間體2組、金銀花中間體3組、金銀花制劑組、山銀花中間體1組、山銀花中間體2組、山銀花中間體3組、山銀花制劑組，每組5個復(fù)孔。

2.4藥物對PBMC刺激性檢測細(xì)胞在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜后，棄上清，陰性對照組加入100 μL不含血清的DMEM，治療組每孔分別加入90 μL不含血清的DMEM和相應(yīng)組別的10 μL抗血清。37 ℃放置24 h，陰性對照組繼續(xù)加入100 μL無血清的DMEM，金銀花各組分別加入100 μL以無血清的DMEM稀釋的濃度分別為3.8 mg/mL的各組中間體與制劑，山銀花各組分別加入100 μL以不含血清的DMEM稀釋質(zhì)量濃度為4.4 mg/mL的各組制劑，孵育24 h，每孔加入20 μLCCK-8，作用4 h后，使用酶標(biāo)儀在450 nm處測定吸光度。按照公式計算細(xì)胞抑制率=[1-(藥物組OD值/對照組OD值)]×100%。

3實驗結(jié)果

3.1豚鼠致敏后類過敏及過敏反應(yīng)觀察陽性組、陰性組、金銀花中間體3組、金銀花制劑組、山銀花中間體3組、山銀花制劑組致敏時未發(fā)現(xiàn)豚鼠類過敏或過敏現(xiàn)象；山銀花中間體1組、山銀花中間體2組發(fā)生類過敏反應(yīng),且山銀花中間體2組豚鼠因類過敏反應(yīng)發(fā)生死亡；金銀花中間體1組、金銀花中間體2組、山銀花中間體1組、山銀花中間體2組致敏時均發(fā)生過敏反應(yīng)。見表1。

表1　致敏豚鼠類過敏及過敏反應(yīng)癥狀( n=3)

3.2金銀花與山銀花各制劑對致敏大鼠PBMC的影響見表2。

組 別A450抑制率/%陰性對照組1.42±0.05—金銀花中間體1(水提液)1.17±0.0317.4金銀花中間體2(醇沉液)1.13±0.0220.5金銀花中間體3(過膜前中間體)1.25±0.0211.7金銀花制劑(注射液)1.27±0.0310.9山銀花中間體1(水提液)1.12±0.0421.2山銀花中間體2(醇沉液)1.10±0.0422.8山銀花中間體3(過膜前中間體)1.24±0.0512.5山銀花制劑(注射液)1.25±0.0312.2

結(jié)果表明，陰性對照組對體外培養(yǎng)PBMC的增殖未見抑制作用，而金銀花與山銀花各組對體外培養(yǎng)PBMC的增殖有不同程度的抑制作用。金銀花中間體3、金銀花制劑組抑制率明顯低于金銀花中間體1、金銀花中間體2組;山銀花中間體3、山銀花制劑組抑制率顯著低于山銀花中間體1、山銀花中間體2組。雖然金銀花與山銀花各組均對體外培養(yǎng)的大鼠PBMC的增殖有抑制作用，但在相同工藝下金銀花制劑的抑制率偏低。

4討論

急性過敏反應(yīng)中的主要類型是Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)，致敏原刺激機體產(chǎn)生IgE抗體,當(dāng)機體再次接觸相同致敏原時，吸附在肥大細(xì)胞等表面的IgE抗體與相應(yīng)的致敏原結(jié)合,引起肥大細(xì)胞脫顆粒釋放出組胺等過敏介質(zhì)。然而，許多藥物既不是抗原也不是半抗原，這些藥物進入人體內(nèi)，不經(jīng)過潛伏期，迅速發(fā)生與Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)相同的臨床表現(xiàn)，稱之為類過敏反應(yīng)。類過敏反應(yīng)引發(fā)的肥大細(xì)胞脫顆粒無需IgE介導(dǎo)，也無致敏過程,首次接觸致敏原即可引發(fā)類過敏癥狀[14-15]。根據(jù)制備工藝，本實驗中的金銀花和山銀花在過膜前的制劑極有可能含有大分子物質(zhì)，因此存在一定的致敏性。本實驗通過金銀花和山銀花共8個中間體及制劑對豚鼠進行致敏試驗，觀察其對豚鼠的致敏性,并制備相應(yīng)的抗血清。由于金銀花中間體1、金銀花中間體2只發(fā)生過敏反應(yīng),而山銀花中間體1、山銀花中間體2既有類過敏反應(yīng)也有過敏反應(yīng)發(fā)生，故而山銀花與金銀花相比安全性低。外周血單個核細(xì)胞包含淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞,龔超群等[16]在激光共聚焦顯微觀察實驗中發(fā)現(xiàn)PBMC細(xì)胞多數(shù)為T淋巴細(xì)胞。有研究[17]表明：在過敏性疾病，如紫癜的發(fā)生發(fā)展中有細(xì)胞免疫功能的減弱,T淋巴細(xì)胞數(shù)量減少和T淋巴細(xì)胞的抑制功能降低等現(xiàn)象。由于CCK-8法是用于測定細(xì)胞增殖或毒性實驗中活細(xì)胞數(shù)目的一種高靈敏度、無放射性的比色檢測法，故本實驗分離大鼠PBMC細(xì)胞后，以CCK-8細(xì)胞增殖和毒性檢測試劑盒觀察其對金銀花和山銀花中間體與制劑的敏感性。根據(jù)結(jié)果可知，金銀花與山銀花各組相應(yīng)的抗血清及制劑刺激后，金銀花和山銀花各組中間體與制劑活細(xì)胞數(shù)量與陰性組相比都減少，表明金銀花和山銀花有可能通過釋放某些抑制性因子進而對PBMC細(xì)胞的活化和增殖產(chǎn)生抑制作用。但以相同的生產(chǎn)工藝制備的中間體和制劑，金銀花對PBMC細(xì)胞的增殖抑制作用比山銀花要低。綜上所述，從豚鼠的致敏反應(yīng)觀察和對大鼠PBMC的刺激性試驗結(jié)果來看，參照熱毒寧注射液單味模擬藥物的制備工藝，金銀花的安全性要高于山銀花。

參考文獻：

[1]高穎,郭鵬,張靜澤.中藥注射劑的研究進展[J].武警醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2009,18(3):249-251.

[2]李黎明,金若敏,李小月.中藥注射劑類過敏反應(yīng)實驗研究進展[J].中藥藥理與臨床,2012,28(1):187-190.

[3]章海風(fēng),翟成凱,鄭艷澤.中藥注射劑致敏反應(yīng)的研究進展[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2010,16(10):204-206.

[4]國家藥典委員會.中國藥典:1部[S].北京:人民衛(wèi)生出版社,1963:168.

[5]國家藥典委員會.中國藥典:1部[S].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005:21-22.

[6]林永強,王淑華,徐麗華,等.金銀花與山銀花的鑒別方法研究[J].藥學(xué)研究,2013,32(2):69-71.

[7]王芳,高松.金銀花、山銀花藥理學(xué)研究現(xiàn)狀[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2013,15(4):237-239.

[8]鮑桂枝.金銀花與山銀花的性狀鑒別和藥理作用的區(qū)別[J].北方藥學(xué),2014,11(3):12.

[9]劉婧慧.金銀花與山銀花質(zhì)量評價及安全性對比研究[D].北京:北京中醫(yī)藥大學(xué),2014:46-52.

[10][Z]GPT 5-1,中藥、天然藥物免疫毒性(過敏性、光過敏反應(yīng))研究的技術(shù)指導(dǎo)原則[S].北京:國家食品藥品監(jiān)督管理局,2005:13.

[11]KORYAKINA A,FREY E,BRUEGGER P.Cryopreservation of human monocytes for pharmacopeial monocyte activation test[J].Journal of Immunological Methods,2014(405):181-191.

[12]谷勇.葛根素和清開靈注射液在清醒Beagle犬的類過敏反應(yīng)監(jiān)測及其機制探討[D].濟南:山東大學(xué)，2012:49.

[13]VK T,ML B,RR D,et al.Transcriptome profiling of peripheral blood cells identifies potential biomarkers for doxorubicin cardiotoxicity in a rat model[J].PLoS One,2012,7(11):1-14.

[14]程芳,史艷秋,劉兆平.藥物類過敏反應(yīng)生物標(biāo)志物探究[J].生命的化學(xué),2008,28(6):795-798.

[15]ROBINSON S,SIVANANDAN I.Anaphylactic and anaphylaetoid reaetions[J].Anaesth Intensi Ve Care Med,2004,5(9):298.

[16]龔超群,郜世雋,蔡繼業(yè),等.植物血凝素與金色葡萄球菌腸毒素刺激人外周血單個核細(xì)胞的比較研究[J].分析測試學(xué)報,2010,29(5):442-448.

[17]孫典清,柳堯花.過敏性紫癜與免疫[J].中國誤診學(xué)雜志,2003(32):203-204.