■趙德志 傅永鋼 朱凌盈 于 菲 陳少澤

（寧波天邦股份有限公司，浙江寧波 315475）

蛋白質(zhì)是有機(jī)大分子，是由氨基酸組成的一類(lèi)化合物，是構(gòu)成機(jī)體組織、體細(xì)胞的基本成分，是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，是生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者。蛋白質(zhì)的種類(lèi)很多，性質(zhì)、功能各異，如果動(dòng)物飼料日糧中蛋白質(zhì)含量較少，飼料利用率就低，機(jī)體的生長(zhǎng)就會(huì)受限，體重下降；蛋白質(zhì)缺乏嚴(yán)重還會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物的繁殖機(jī)能紊亂等。

為了衡量動(dòng)物飼料的優(yōu)劣，蛋白質(zhì)含量首當(dāng)其沖成為評(píng)價(jià)飼料營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的直接指標(biāo)。又因?yàn)樵现写值鞍踪|(zhì)的含量與飼料中的蛋白質(zhì)含量存在線性關(guān)系，蛋白質(zhì)的含量決定飼料的品質(zhì)。為了嚴(yán)

把質(zhì)量關(guān)，原料中粗蛋白含量已成為飼料生產(chǎn)企業(yè)日常檢測(cè)工作中的必檢項(xiàng)目。到目前為止，由于沒(méi)有簡(jiǎn)便快捷的測(cè)量方法，各大公司仍然采用傳統(tǒng)的測(cè)量方法。但是傳統(tǒng)方法在消化過(guò)程中存在消化時(shí)間長(zhǎng)，操作過(guò)程比較繁瑣以及消化時(shí)間和消化溫度等因素影響消化率等問(wèn)題，致使實(shí)驗(yàn)存在成本高昂、效率低下等嚴(yán)重缺陷。為了縮短操作時(shí)長(zhǎng)，規(guī)避消化時(shí)間和消化溫度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，并從降低實(shí)驗(yàn)成本和提高實(shí)驗(yàn)效率的多重因素考慮。本實(shí)驗(yàn)選取棉粕和魚(yú)粉為樣品，以國(guó)標(biāo)法作對(duì)照，進(jìn)行相關(guān)研究，旨在簡(jiǎn)化樣品消化過(guò)程，提高消化率，提升蛋白質(zhì)的測(cè)定效率，為飼料行業(yè)快速測(cè)定各原料中粗蛋白的含量提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 原料

棉粕、魚(yú)粉（均為寧波余姚市售）。

1.1.2 儀器

AL204-1電子天平、粉碎機(jī)、40目分樣篩、250 ml三角瓶、250 ml消化管、移液管、10 ml量筒、滴定管、半自動(dòng)定氮儀。

1.1.3 試劑

濃硫酸、無(wú)水硫酸銅、硫酸鉀、氫氧化鈉（江蘇彤晟化學(xué)試劑有限公司）；硼酸、甲基紅、溴甲酚綠、乙醇、鹽酸、蔗糖、硫酸銨、酚酞試劑（國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 溶液的配制

混合催化劑：稱(chēng)取0.4 g無(wú)水硫酸銅和6 g硫酸鉀，研磨后混勻，備用。

氫氧化鈉溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)取40 g氫氧化鈉固體，將其加入到40 ml水中溶解，搖勻后，定容至100 ml，備用。

混合指示劑：將0.1 g甲基紅和0.5 g溴甲酚綠分別溶于100 ml無(wú)水乙醇中，搖勻后，按1∶1混勻待用。

硼酸吸收液：分別量取0.1%溴甲基綠乙醇溶液10 ml、0.1%甲基紅乙醇溶液7 ml和4%氫氧化鈉水溶液0.5 ml，將其加到1 000 ml的1%硼酸水溶液中，搖勻待用。

1.2.2 樣品的處理

將適量的棉粕和魚(yú)粉進(jìn)行粉碎后，準(zhǔn)確稱(chēng)取上述樣品各5組，每組兩份。一份按GB/T6432-1994進(jìn)行處理，另一份采用過(guò)氧化氫代替國(guó)標(biāo)法中的混合催化劑，不經(jīng)過(guò)消化爐消化的快速法處理。然后，將上述兩種處理樣品進(jìn)行氨的蒸餾。

1.2.3 氨的蒸餾

首先分別向盛有上述溶液的消化管內(nèi)分別滴加2滴指示劑（對(duì)照組加入混合指示劑，實(shí)驗(yàn)組加入酚酞指示劑），并向上述消化管中加入過(guò)量的氫氧化鈉溶液；接著將其安裝在半自動(dòng)定氮儀上，并將定氮儀的冷凝管末端要放入裝有25 ml硼酸吸收液的錐形瓶?jī)?nèi)，然后進(jìn)行蒸餾。蒸餾時(shí)間以吸收液體積達(dá)到150 ml時(shí)為宜。取下錐形瓶后，用蒸餾水沖洗冷凝管末端，并將洗液倒入錐形瓶?jī)?nèi)，最后進(jìn)行滴定。

1.2.4 滴定

分別向上述吸收液中滴加3～5滴混合指示劑，用0.1 mol/l的標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液進(jìn)行酸堿中和滴定，滴定至吸收液顏色由藍(lán)綠色變成灰紅色為終點(diǎn)。記錄消耗的標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液的體積。

1.2.5 空白對(duì)照

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.2 g蔗糖作空白對(duì)照，按GB/T6432-1994進(jìn)行消化、蒸餾和酸堿滴定等，并記錄滴定消耗的標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液的體積。

1.2.6 粗蛋白的含量計(jì)算

結(jié)合空白對(duì)照，對(duì)棉粕和魚(yú)粉中的粗蛋白含量進(jìn)行計(jì)算。計(jì)算公式為：

式中：CP——粗蛋白；

v1——滴定空白時(shí)所需標(biāo)準(zhǔn)酸溶液體積(ml)；

v2——滴定樣品時(shí)所需標(biāo)準(zhǔn)酸溶液體積(ml)；

C——鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(mol/l)；

V——試樣分解液總體積(ml)；

v'——試樣分解液蒸餾用體積(ml)；

0.014 0——與1.00 ml鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液相當(dāng)?shù)牡馁|(zhì)量(g)；

M——試樣的質(zhì)量(g)。

1.2.7 精密度檢測(cè)

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.2 g的棉粕和魚(yú)粉粉末各3組，每組兩份，分別進(jìn)行快速法和國(guó)標(biāo)法測(cè)試粗蛋白含量，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行誤差分析，驗(yàn)證快速法的系統(tǒng)精密度。

1.2.8 換算系數(shù)的確定

精確稱(chēng)取不同質(zhì)量的棉粕和魚(yú)粉粉末各5組，每組兩份，質(zhì)量分別為0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 g，分組利用快速法和國(guó)標(biāo)法對(duì)所含粗蛋白進(jìn)行檢測(cè)，確定快速法和國(guó)標(biāo)法之間的線性關(guān)系即換算系數(shù)。

1.2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

隨機(jī)選取5個(gè)不同產(chǎn)地的棉粕和魚(yú)粉樣品，粉碎后，分別進(jìn)行國(guó)標(biāo)法和快速法檢測(cè)，求出兩種方法的比值，繪制趨勢(shì)圖。驗(yàn)證快速測(cè)定方法的縱向穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 棉粕中粗蛋白測(cè)試結(jié)果比較

通過(guò)預(yù)試驗(yàn)得知，當(dāng)樣品中的粗蛋白含量約為80 mg時(shí)，滴定終點(diǎn)所消耗的鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液在10 ml左右。為了便于操作，滴定結(jié)果更準(zhǔn)確，本試驗(yàn)按表1稱(chēng)取5組棉粕樣品，且每組兩份：一份用國(guó)標(biāo)法，另一份用快速法測(cè)定粗蛋白含量，記錄測(cè)量結(jié)果，并求出國(guó)標(biāo)法和快速法的比值及比值的RSD(%)。試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

表1 國(guó)標(biāo)法和快速法測(cè)定的粗蛋白含量及其比值(棉粕)

通過(guò)表1可以看出，國(guó)標(biāo)法測(cè)出的粗蛋白含量為56.65%左右，快速法測(cè)得的粗蛋白含量為33.03%以上。兩種方法的結(jié)果在數(shù)值上存在較大差距，通過(guò)計(jì)算和比較發(fā)現(xiàn)兩種結(jié)果的比值較穩(wěn)定，約為1.715，且比值的RSD僅為0.086%＜＜1%。說(shuō)明快速法雖然不能直接測(cè)出樣品中的粗蛋白含量，但是存在通過(guò)快速法和比值相結(jié)合計(jì)算出粗蛋白總含量的可能。

2.2 魚(yú)粉中粗蛋白測(cè)試結(jié)果比較

為了排除棉粕結(jié)果的偶然性，本次試驗(yàn)選取粗蛋白含量與棉粕相近的魚(yú)粉為原料，隨機(jī)稱(chēng)取約0.12 g的樣品5組，每組兩份：一份采用國(guó)標(biāo)法，一份采用快速法，結(jié)果如表2所示。

表2 國(guó)標(biāo)法和快速法測(cè)定的粗蛋白含量及其比值(魚(yú)粉)

通過(guò)表2可以發(fā)現(xiàn)，國(guó)標(biāo)法和快速法測(cè)出魚(yú)油中的粗蛋白含量同樣存在較大差距，且兩種方法測(cè)得的結(jié)果的比值與2.1節(jié)中的結(jié)果一致，且比值的RSD值為0.049%＜＜1%。說(shuō)明通過(guò)快速法與比值相結(jié)合計(jì)算樣品中粗蛋白總含量的快速方法具有一定的可行性。

2.3 精密度檢測(cè)

為了進(jìn)一步確定該方法的可行性，此次試驗(yàn)同時(shí)選取棉粕和魚(yú)粉作樣品，并精密稱(chēng)取0.200 0 g的上述樣品各3組，每組兩份，重復(fù)上述試驗(yàn)，確定方法的重現(xiàn)性和測(cè)量?jī)x器的精密度。結(jié)果如表3所示。

表3 快速法的系統(tǒng)精密度分析

從表3中可以看出，試驗(yàn)結(jié)果與2.1和2.2的結(jié)果一致，比值RSD值僅為0.052%。說(shuō)明快速法的系統(tǒng)精密度較高，且能夠利用該方法準(zhǔn)確計(jì)算出上述兩種原料中的粗蛋白含量。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

為了確定換算系數(shù)，試驗(yàn)選取不同質(zhì)量的棉粕和魚(yú)粉5組，并以快速法測(cè)定值為橫坐標(biāo)，國(guó)標(biāo)法為縱坐標(biāo)，繪制線性關(guān)系圖，結(jié)果如圖1所示。

圖1 兩種方法測(cè)得值的線性關(guān)系

從圖1中可以看出，棉粕和魚(yú)粉的五組數(shù)據(jù)的線性關(guān)系方程為：Y=1.715X-0.041，且R2=0.999 9。由R2值可以看出兩種方法的線性關(guān)系良好。通過(guò)線性方程式中X的系數(shù)可以得出兩種方法的換算系數(shù)為1.715，而且誤差僅為0.041%＜＜1%。說(shuō)明快速法和國(guó)標(biāo)法之間的換算系數(shù)穩(wěn)定可靠，能夠準(zhǔn)確用于上述兩種樣品的粗蛋白總量的計(jì)算。

2.5 檢測(cè)方法的穩(wěn)定性試驗(yàn)

為了探索快速法的適用范圍，驗(yàn)證檢測(cè)方法的橫向穩(wěn)定性，試驗(yàn)選取5種不同產(chǎn)地的棉粕（樣本1～5）和5種不同產(chǎn)地的魚(yú)粉(樣本6～10)，并對(duì)其轉(zhuǎn)換系數(shù)的穩(wěn)定性進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果如圖2所示，不同產(chǎn)地的棉粕和魚(yú)粉樣品的換算系數(shù)均勻分布在1.715的兩側(cè)，且波動(dòng)范圍在0.002以?xún)?nèi)。根據(jù)結(jié)果表明，快速法和國(guó)標(biāo)法之間的換算系數(shù)在測(cè)量不同產(chǎn)地的棉粕和魚(yú)粉樣品時(shí)波動(dòng)性較小、穩(wěn)定性較好，利用快速法和換算系數(shù)測(cè)定棉粕和魚(yú)粉中粗蛋白含量的方法可靠。

圖2 不同產(chǎn)地樣品的換算系數(shù)的穩(wěn)定性

3 小結(jié)

本試驗(yàn)首先利用快速法和繁瑣的國(guó)標(biāo)法分別對(duì)棉粕樣品的粗蛋白含量進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)兩種方法間的比值關(guān)系；其次，用粗蛋白含量略高的魚(yú)粉驗(yàn)證比值關(guān)系，并確定應(yīng)用快速法和比值結(jié)合計(jì)算樣品中粗蛋白總量的可能性；再次，利用棉粕和魚(yú)粉的綜合試驗(yàn)結(jié)果繪制回歸曲線，得出線性方程，確定其自變量X的系數(shù)即換算系數(shù)；最后，隨機(jī)選取5個(gè)不同產(chǎn)地的棉粕和魚(yú)粉做縱向穩(wěn)定試驗(yàn)，探究快速法對(duì)棉粕和魚(yú)粉粗蛋白的普遍適用性。經(jīng)過(guò)上述試驗(yàn)，最終獲得了一種測(cè)定棉粕和魚(yú)粉粗蛋白含量的快速方法。

試驗(yàn)結(jié)果表明:利用快速法和換算系數(shù)相結(jié)合，測(cè)定棉粕和魚(yú)粉粗蛋白含量的快速方法，有如下優(yōu)點(diǎn)：即以過(guò)氧化氫作催化劑，利用濃硫酸的放熱實(shí)現(xiàn)消化，且需時(shí)短、耗能少；其次，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性高、穩(wěn)定性好，能夠?yàn)轱暳系认嚓P(guān)行業(yè)快速檢測(cè)棉粕和魚(yú)粉中粗蛋白含量并出具準(zhǔn)確的檢測(cè)報(bào)告；同時(shí)，為相關(guān)物質(zhì)含量的測(cè)定提供了新思路，開(kāi)拓了新途徑。