■李東霞 楊富裕 王雁萍 楊慧曉 郭琳娜 王 雨

（1.中國農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，北京 100193；2.鄭州大學離子束生物工程省重點實驗室，河南鄭州 450052；3.北京助爾生物科學研究院，北京 100085）

苜蓿（Medicago sativa L.）產(chǎn)草量高，營養(yǎng)豐富，是許多國家主要的飼料作物。隨著我國畜牧業(yè)的快速發(fā)展，苜蓿已成為不可替代的保障飼草[1]。國內(nèi)市場的優(yōu)質(zhì)苜蓿產(chǎn)品一直處于供不應求的狀態(tài)，苜蓿進口量逐年增加。自2012年中央推行“振興奶業(yè)苜蓿發(fā)展行動”以來，我國苜蓿種植面積迅速擴大，苜蓿產(chǎn)量也大幅度提高[2]。提高苜蓿貯存技術(shù)，改善苜蓿儲藏品質(zhì)，保障優(yōu)質(zhì)苜蓿產(chǎn)品飼喂家畜對我國畜牧業(yè)發(fā)展具有重要意義。

近年來，將青貯技術(shù)應用于苜蓿貯存在世界各地得到普遍的應用和推廣[3]。在青貯發(fā)酵過程中，乳酸菌發(fā)酵糖類產(chǎn)生有機酸及其它抑菌物質(zhì)，抑制不良菌群的繁殖，從而使飼草營養(yǎng)物質(zhì)得以保存[4-5]。為了提高青貯效果，各種乳酸菌添加劑被廣泛應用在青貯飼料的制作中，但是不同來源的乳酸菌對苜蓿這種飼草的適應性不同，進而會影響苜蓿青貯的效果[6-8]?？紤]到苜蓿自然附著的乳酸菌含量很少[9]，但在青貯過程中，適應其生存環(huán)境的乳酸菌會保留，與雜菌競爭養(yǎng)分進而大量繁殖。因此本研究以苜蓿自然青貯過程中存在的乳酸菌為篩選來源，以期從中找出適合苜蓿材料特點，抑菌活性強的菌株，為進一步研究開發(fā)針對苜蓿青貯的乳酸菌添加劑提供優(yōu)良菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 青貯樣品

選取河南省鄭州市郊區(qū)兩種紫花苜蓿品種：標桿，WL343。在初花期收割，室內(nèi)晾曬8 h后，用鍘刀鍘至段長2～3 cm，分別裝入10個聚乙烯袋，每袋100 g，用真空包裝機抽真空并封口。在青貯前及青貯第3、5、10、15、30、60 d時分別取樣進行乳酸菌的分離。

1.1.2 指示菌

枯草芽孢桿菌、藤黃微球菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特氏菌，均為鄭州大學離子束實驗室保存。

1.1.3 試劑及培養(yǎng)基

蛋白酶K、API 50 CH試劑條、MRS培養(yǎng)基、NA培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 青貯樣品中乳酸菌的分離及抑菌活性乳酸菌的篩選

將10 g青貯樣品加入到90 ml無菌水中，梯度稀釋后涂布于MRS固體培養(yǎng)基，30℃厭氧培養(yǎng)48 h后從中挑取單菌落，劃線純化2次，經(jīng)革蘭氏染色和過氧化氫酶試驗，挑出革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶陰性的菌株，通過牛津杯雙層平板法對從青貯材料中分離到的乳酸菌進行抑菌試驗[10]。

1.2.2 乳酸菌菌株抗菌活性物質(zhì)初步分析

試驗檢測了高抗菌活性乳酸菌菌株發(fā)酵上清液對溫度、pH值、蛋白酶的敏感性[11]。并通過高效液相色譜法分析培養(yǎng)24 h后乳酸菌發(fā)酵液中的主要有機酸成分，每株菌分別設三個重復。

1.2.3 乳酸菌的鑒定

根據(jù)乳酸菌生理生化特性、API 50碳源發(fā)酵結(jié)果以及16S rDNA序列分析對菌株進行鑒定[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 苜蓿青貯樣品中乳酸菌的分離

本試驗通過半選擇性MRS培養(yǎng)基，從不同青貯時間的苜蓿樣品中分離得到104株革蘭氏陽性,過氧化氫酶陰性的乳酸菌菌株。

2.2 乳酸菌的篩選

104株乳酸菌菌株其中有81株對4種指示菌均有不同程度的抑制作用，從中挑選出2株抑菌效果較強的菌株，分別是在青貯前分離到的菌株ZZU a10和青貯60 d分離到的菌株ZZU a200。表1顯示這兩株菌對指示菌均有很好的抑制效果。

表1 乳酸菌的抑菌活性

2.3 乳酸菌菌株抗菌活性物質(zhì)的初步分析

乳酸菌發(fā)酵上清液在不同處理下對指示菌的抑菌活性如表2所示，不同溫度對兩株菌的作用不同，ZZU a10的抑菌活性隨著溫度的升高呈現(xiàn)下降趨勢，而ZZU a200的抑菌活性并沒有受到溫度升高的影響；兩株乳酸菌的抑菌物質(zhì)對溫度的敏感性差別說明其抑菌物質(zhì)不同。在對兩株菌的發(fā)酵上清液調(diào)至不同pH值處理后發(fā)現(xiàn)兩株菌在酸性環(huán)境中均有較強的抑菌活性，且隨著pH值的升高，抑菌活性呈下降趨勢；但ZZU a200相對于ZZU a10對pH值更加敏感，其在發(fā)酵液pH值調(diào)至6.0時對四種指示菌的抑制作用完全消失，而ZZU a10在pH值8.0時依然有明顯抑菌活性；pH值敏感性差異進一步說明兩株菌的抑菌物質(zhì)不同，ZZU a10的抑菌物質(zhì)能夠耐受中性甚至弱堿性環(huán)境，而ZZU a200的抑菌活性只能在低pH值下發(fā)揮作用，推測ZZU a200的抑菌物質(zhì)主要是菌株代謝產(chǎn)生的有機酸。蛋白酶K處理結(jié)果顯示，其對ZZU a200的抑菌活性沒有影響，ZZU a10的抑制作用完全消失，說明ZZU a10發(fā)揮抑菌活性的物質(zhì)是對蛋白酶敏感的蛋白類物質(zhì)，推測是一種細菌素。

利用高效液相色譜法測定ZZU a10及ZZU a200發(fā)酵上清液中有機酸的含量，結(jié)果如表3所示，這兩株菌有機酸產(chǎn)物中均含有乳酸、乙酸成分，而且乳酸含量最多，其次是乙酸，ZZU a200的發(fā)酵液中還含有少量丙酸；兩株乳酸菌均沒有檢測到丁酸成分。ZZU a200的各種有機酸含量均顯著高于ZZU a10（P＜0.05）。

表2 乳酸菌的抑菌活性

表3 發(fā)酵液中有機酸的產(chǎn)量（mg/ml）

2.4 乳酸菌菌株鑒定

如表4所示，這兩株乳酸菌都是革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶陰性。ZZU a10為球菌，而ZZU a200為桿菌；兩株菌都能在3.0%(W/V)的NaCl濃度生長，ZZU a200甚至能夠耐受6.5%(W/V)的NaCl濃度。兩株菌均可以耐受10℃低溫，ZZU a200甚至可以耐受50℃的高溫。兩株菌可以耐受pH值4.0～9.0的范圍，ZZU a200在pH值3.0的酸性環(huán)境中依然可以良好生長。

表4 菌株形態(tài)及生理生化特性鑒定結(jié)果

由表5可知，菌株ZZU a10可以利用核糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖等17種碳源，對山梨醇、攏牛兒糖有微弱利用；菌株ZZU a200能夠利用的碳源較多，共24種，對鼠李糖、攏牛兒糖也有微弱利用。

將兩株乳酸菌測得的16S rDNA序列遞交到Gen-Bank，使用程序Blast來找尋與其有最大同源性的序列，并與檢測得到的標準菌株序列信息通過CLUSTAL W軟件比對。采用鄰接法構(gòu)建進化樹（neighborjoining method），如圖1及圖2所示，枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis被用作外圍菌株。

結(jié)合生理生化試驗，碳源發(fā)酵結(jié)果及16S rDNA序列結(jié)果分析，ZZU a10被鑒定為Enterococcus mundtii；ZZU a200被鑒定為Lactobacillus plantarum。

3 討論

在飼料中添加具有抑菌作用的乳酸菌除了能夠抑制雜菌的繁殖，降低飼料營養(yǎng)損失外，被家畜采食后還有助于維持腸道內(nèi)菌群平衡。乳酸菌抑制雜菌的方式主要是其代謝產(chǎn)物中含有抑菌物質(zhì)，包括有機酸及蛋白類細菌素等[13]。

表5 碳源發(fā)酵試驗結(jié)果

圖1 ZZU a10的16S rDNA序列系統(tǒng)進化樹

圖2 ZZU a200的16S rDNA序列系統(tǒng)進化樹

試驗結(jié)果顯示，ZZU a10的抑菌物質(zhì)主要為蛋白類物質(zhì)，且與前人報道的細菌素情況一致，推測是一類細菌素[14]。細菌素的抑菌效果受到許多因素的影響，如溫度、pH值等[11,15-16]。溫度過高會改變細菌素分子結(jié)構(gòu)，抑菌活性也會隨之降低，甚至喪失；研究表明，ZZU a10的抑菌物質(zhì)具有很好的熱穩(wěn)定性，在100℃處理30 min的條件下依然有抑菌效果。對pH值而言，細菌素發(fā)揮抑菌作用需要在適宜的pH值范圍內(nèi)，pH值過低或過高同樣會影響細菌素的結(jié)構(gòu)，引起抑菌活性的降低或喪失[17]。常見的細菌素Nisin在低pH值下有很強的抑菌活性,但在pH值高于7.0時活性喪失[18]。本實驗篩選到的ZZU a10產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)在pH值2.0～8.0范圍內(nèi)均有明顯的抑菌活性，說明其具有更廣的環(huán)境適應性。

研究表明，菌株ZZU a200發(fā)揮抑菌作用的主要成分為有機酸；有報道指出乳酸菌代謝產(chǎn)物中的有機酸對索氏志賀菌、大腸桿菌、沙門氏菌、單增生李斯特菌均有明顯抑制作用[19-20]。與之相似，ZZU a200對枯草芽孢桿菌、藤黃微球菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特氏菌有較強的抑制作用。實驗經(jīng)過高效液相色譜分析發(fā)現(xiàn)，ZZU a200有機酸含量豐富。有機酸的抑菌機理主要包括兩種，第一是有機酸可以降低其它雜菌細胞間質(zhì)的pH值，破壞其滲透壓體系，使得細胞消耗更多的能量來維持平衡，進而抑制雜菌的生長和繁殖；第二是酸性物質(zhì)破壞雜菌的細胞膜，進入其細胞內(nèi)，抑制某些大分子如DNA、RNA、蛋白質(zhì)或脂類的合成代謝，干擾雜菌體內(nèi)正常的生命活動，最終達到抑菌效果[21]。有研究表明，乳酸菌有機酸發(fā)揮抑菌作用具有較強的熱穩(wěn)定性，在100℃的處理后，依然保持處理前92%以上的抑菌效果[22-23]。本研究結(jié)果顯示，ZZU a200的發(fā)酵液在100℃處理30 min后能夠保持與處理前一樣的抑菌效果，說明該菌株能夠耐受高溫的環(huán)境發(fā)揮抑菌活性；且該菌株表現(xiàn)出良好的理化性質(zhì)，能夠耐受高溫（50℃）、高鹽（6.5%）濃度，可利用的碳源范圍廣泛，說明ZZU a200具有較強的生存適應性。其在苜蓿青貯中的添加效果有待進一步研究驗證。

4 結(jié)論

從苜蓿青貯過程中分離到104株乳酸菌并篩選到兩株具有高抗菌活性的菌株——ZZU a10及ZZU a200，ZZU a10被鑒定為Enterococcus mundtii，發(fā)揮抑菌活性的主要成分為蛋白類物質(zhì)，ZZU a200被鑒定為及Lactobacillus plantarum，發(fā)揮抑菌活性的主要成分為有機酸。兩株菌的抑菌物質(zhì)分別在pH值范圍、溫度范圍表現(xiàn)出廣泛的耐受性，菌株ZZU a200在不同的溫度、pH值、鹽濃度環(huán)境下還表現(xiàn)出較強的生存適應性。以上結(jié)果表明，這兩株菌在苜蓿飼料青貯中具有潛在應用價值。