■李艷嬌 白曉凱 張 敏 金英海 陳石婷 國傳福

（1.延邊大學，吉林延邊 133000；2.琿春市龍裕農業(yè)發(fā)展集團有限公司，吉林琿春 133300）

硒是人、動物以及植物體必不可少的微量元素之一，它對維持機體正常新陳代謝以及多種疾病的發(fā)生均相關，同時，硒是谷胱甘肽過氧化物酶的活性中心元素，具有抗氧化、延緩衰老，保護、修復細胞的作用，而且硒對增強肌體的免疫能力、抗病能力等方面均有顯著的影響。目前，對于補硒的方法大多數均是以無機硒（如亞硒酸鈉）化合物的狀態(tài)進行的，由于無機硒化合物具有毒性高、吸收率低的弊端，所以如何將無機硒轉化為有機硒，使微量元素的利用率提高、毒性降低也越來越受到國內外有關學者的關注。

目前對于將無機硒轉化為有機硒的方法有生物轉化與氨基酸結合、植物自然轉化法、微生物轉化法（如酵母菌硒）等。自20世紀70年代以來，國內外利用酵母菌將無機的微量元素轉化為有機的微量元素已有較多研究，對于利用乳酸菌為載體富集微量元素的文獻報道尚少。乳酸菌作為一種有益菌，不僅對食品的獨特風味方面有作用，而且對醫(yī)療保健作用方面也有明顯的效果，它可靠的安全性也已被消費者所認可，富硒乳酸菌作為有機硒的一個新來源，其潛在的發(fā)展前景非常廣闊。

隨著乳酸菌富硒技術的逐漸成熟，越來越多的學者開始尋找生產有機硒的其它方法。我國作為農業(yè)大國，農產品資源非常豐富，但對于農副產品的利用，提高其附加價值方面還比較薄弱。本試驗以乳酸菌發(fā)酵有機米糠富硒，將乳酸菌的某些功能特性與有機米糠中的營養(yǎng)相結合，同時將無機硒以微生物發(fā)酵的方法轉化為有機硒，開發(fā)新型飼料添加劑，以實現農副產品作為新型資源的突破，也將為農副產品在未來的發(fā)展中提供一條新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

由新鮮腌制的辣白菜中提取，所用辣白菜在延邊大學超市購買。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、牛肉粉10 g、酵母浸出粉5 g、磷酸氫二鉀（K2HPO4）2 g、檸檬酸三銨2 g、乙酸鈉2 g、葡萄糖20 g、硫酸鎂0.58 g、硫酸錳0.25 g、吐溫801 ml、蒸餾水1 000 ml，pH值6.2～6.4，121 ℃滅菌15 min。

MRS瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、牛肉粉10 g、酵母浸出粉5 g、磷酸氫二鉀（K2HPO4）2 g、檸檬酸三銨2 g、乙酸鈉2 g、葡萄糖20 g、硫酸鎂0.58 g、硫酸錳0.25 g、吐溫80 1 ml、瓊脂15 g、蒸餾水1 000 ml，pH值6.2～6.4，121 ℃滅菌15 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：有機米糠、營養(yǎng)液（MRS液體培養(yǎng)基）。

1.1.3 試劑

亞硒酸鈉（AR）、濃硝酸、高氯酸、濃硫酸、過氧化氫、甲苯；0.9%NaCl、40%氫氧化鈉溶液、5%氫氧化鈉溶液、2 mol/l甲酸溶液、0.5%3,3-二氨基聯苯胺溶液、5%乙二胺四乙酸二鈉溶液。

1.1.4 儀器

高壓滅菌鍋（HVA-85，日本Hirayama）、超凈工作臺（SW-CJ-1FD）、恒溫培養(yǎng)箱（MJ-150-Ⅰ，昆山 一恒儀器）、電熱鼓風干燥箱、冰凍離心機（SIEVA-2，德國HERMLE）、紫外可見分光光度計（UV759，上海佑科）、電子分析天平（MD100-2）。

1.2 方法

1.2.1 菌種的分離、純化

將泡菜汁用滅菌后的0.9%NaCl分別稀釋至10-1～10-6，然后分別進行平板涂布培養(yǎng)48 h，之后挑選具有乳酸菌菌落特征的單一菌落，采用劃線分離純化，純化若干次后，獲得單一菌種。如此純化若干次后，選取典型的菌落進行活化并擴繁培養(yǎng)。

1.2.2 菌種的活化

挑取純化幾次后的單一菌落，將其接種于MRS液體培養(yǎng)基中，于37℃條件下培養(yǎng)24 h，之后將活化的菌種進行擴繁培養(yǎng)并測定吸光度，直至OD600nm為0.6，即得到種子液。

1.2.3 乳酸菌生長曲線的測定

將活化好的乳酸菌進行液體培養(yǎng)后，測定生長曲線，以確定亞硒酸鈉最適的添加時間。種子液以1%的接種量接入到MRS液體培養(yǎng)基中，裝液量為50 ml/150 ml，37℃靜止培養(yǎng)，采用比濁法，每個4 h測定乳酸菌液的OD600nm值，繪制生長曲線（見圖1）。

圖1 乳酸菌生長曲線

1.2.4 富集培養(yǎng)

根據需要將亞硒酸鈉配好滅菌備用。在超凈工作臺中將亞硒酸鈉溶液按不同量加入到滅菌好的MRS液體培養(yǎng)基中，混勻，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)一定時間。

1.2.5 發(fā)酵培養(yǎng)

將有機米糠進行分裝、滅菌備用。在超凈工作臺中將培養(yǎng)好的富硒乳酸菌液加到分裝好的有機米糠中，攪拌均勻，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.6 培養(yǎng)物的洗滌及分離

培養(yǎng)物→離心（25℃、4 000 r/min）20 min，傾去上清液→加入300 ml雙蒸水，攪拌均勻→離心（4 000 r/min）20 min，傾去上清液。如此反復幾次，將細胞表面的無機硒洗去。最后以4 000 r/min離心20 min獲得最終培養(yǎng)物。

1.2.7 測定方法

準確稱取0.1 g試樣，并加少量水潤濕樣品，然后加入消化液（雙氧水∶高氯酸∶硫酸=3∶3∶1），搖勻，置電爐上消化至終點（若消化不完全可稍冷后補加雙氧水繼續(xù)加熱消化至完全，此過程在通風櫥內完成）。冷卻至室溫后，繼續(xù)加5%EDTA-2Na溶液2 m1，搖勻，用40%氫氧化鈉于冷水浴中調pH值至中性，然后定容至100 m1，同法做空白溶液。

1.3 發(fā)酵條件的篩選

1.3.1 有機米糠添加量的篩選

將米糠添加量（22～46 g）以外的其它培養(yǎng)條件按培養(yǎng)基裝液量為60 ml，接種量3%，種齡16 h，培養(yǎng)溫度33℃對發(fā)酵培養(yǎng)基進行靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)36 h后，分別測定每個培養(yǎng)基的生物量，根據生物量來選擇合適的米糠添加量。

1.3.2 培養(yǎng)基裝液量的篩選

在已篩選好的有機米糠添加量的基礎上，接種量、種齡條件不變，將種子液接種于不同裝液量的發(fā)酵培養(yǎng)基中，溫度為33℃的條件下培養(yǎng)36 h，測定發(fā)酵培養(yǎng)中乳酸菌的生物量。

1.3.3 接種量的篩選

在發(fā)酵培養(yǎng)中分別接入不同接種量的種子液，在溫度為33℃的條件下培養(yǎng)36 h，測定乳酸菌生物量，選擇最適的接種量。

1.3.4 種齡的篩選

在上述條件基礎上，根據不同種齡的種子液對米糠的發(fā)酵情況，確定乳酸菌最佳的的菌種種齡。

1.3.5 培養(yǎng)時間的篩選

綜合篩選出的最佳發(fā)酵條件，將發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵時間設為24～60 h的梯度，在33℃條件下培養(yǎng)，確定最佳的培養(yǎng)時間。

1.3.6 培養(yǎng)溫度的篩選

將培養(yǎng)基在28、31、34、37、40 ℃條件下培養(yǎng)，根據乳酸菌的生物量確定最佳的培養(yǎng)溫度。

1.3.7 Na2SeO3添加量的篩選

我們已經根據米糠的發(fā)酵程度和乳酸菌的生物量確定了發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵的最佳條件。結合最佳的發(fā)酵條件，在培養(yǎng)基中添加不同量的亞硒酸鈉，最后由生物量及有機硒生產水平來選擇合適的亞硒酸鈉添加量。

2 結果與討論

2.1 有機米糠添加量對富硒乳酸菌生物量的影響

圖2 有機米糠添加量對富硒乳酸菌生物量的影響

由圖2可知，乳酸菌生物量隨著有機米糠添加量的增加而增加，當米糠加量為34 g時，生物量最高；米糠加量大于34 g時，隨著添加量的增加，培養(yǎng)基中更多的培養(yǎng)液被米糠利用，不能為乳酸菌的生長提供充足的營養(yǎng)，造成了乳酸菌生物量呈現下降的趨勢。因此在培養(yǎng)基中適宜的有機米糠添加量應為34 g。

2.2 培養(yǎng)基裝液量對富硒乳酸菌生物量的影響

圖3 培養(yǎng)基裝液量對富硒乳酸菌生物量的影響

從圖3可以看出，裝液量對乳酸菌生物量的影響較顯著，隨著裝液量的增加生物量為先上升后下降的生長趨勢；培養(yǎng)基中營養(yǎng)液的裝液量為55 ml時，生物量最高；由于乳酸菌為厭氧菌，培養(yǎng)液的裝液量超過55 ml時，將會抑制乳酸菌的生長，因而導致生物量逐漸下降。

2.3 接種量對富硒乳酸菌生物量的影響

圖4 接種量對富硒乳酸菌生物量的影響

由圖4可以看出，接種量的大小對乳酸菌生物量的多少有直接的影響。隨著接種量的增加生物量逐漸增加，當接種量較大時（接種量大于9%），會造成乳酸菌生長過快，培養(yǎng)基中營養(yǎng)供應不足，使得乳酸菌不能夠充分的生長；接種量過小時（接種量小于9%），乳酸菌生長代謝的較慢，進而影響發(fā)酵的時間。

2.4 種齡對富硒乳酸菌生物量的影響

圖5所示，在0～16 h時，乳酸菌生物量與種齡呈正相關；當種齡為16～20 h時，乳酸菌的生長情況呈直線下降趨勢，生物量也迅速減少；在8～16 h時，乳酸菌生長最好，生物量最高。種齡少于8 h時，種子仍處于調整適應的階段；種齡大于16 h時，開始老化衰退。

2.5 培養(yǎng)時間對富硒乳酸菌生物量的影響

圖6所示，乳酸菌生物量隨著培養(yǎng)時間的增加而增加，且生長速度較快。當培養(yǎng)到48 h時，生物量最理想，為10.601 g/l；培養(yǎng)48 h后，生物量開始出現下降的趨勢，所以，培養(yǎng)時間應為48 h較合適。

圖5 種齡對富硒乳酸菌生物量的影響

圖6 培養(yǎng)時間對富硒乳酸菌生物量的影響

2.6 培養(yǎng)溫度對富硒乳酸菌生物量的影響

圖7 培養(yǎng)溫度對富硒乳酸菌生物量的影響

由圖7可以看出，隨著溫度的不斷升高乳酸菌生長的較為旺盛，生物量也隨之增加，當溫度達到37℃時，生物量最高；溫度大于37℃時，過高的溫度對乳酸菌的生長有抑制作用，生物量開始呈現下降趨勢。

2.7 Na2SeO3添加量對富硒乳酸菌生物量及有機硒生產水平的影響

從圖8可以看出，亞硒酸鈉的添加量對乳酸菌生物量和富硒效果均有影響。隨著培養(yǎng)基中硒濃度的增加，生物量出現逐漸下降的趨勢，相反的是富硒量呈現上升的趨勢。因為亞硒酸鈉具有一定的毒性，對乳酸菌的生長有抑制作用。

圖8 Na2SeO3添加量對富硒乳酸菌生物量及有機硒生產水平的影響

有機硒生產水平（mg/l）=富硒乳酸菌有機硒含量（mg/g）×發(fā)酵米糠乳酸菌生物量（g/l）

2.8 發(fā)酵米糠營養(yǎng)成分分析

表1 普通有機米糠與乳酸菌發(fā)酵有機米糠營養(yǎng)成分分析(%)

由表1可以看出，乳酸菌發(fā)酵的有機米糠營養(yǎng)成分與未發(fā)酵的普通米糠沒有顯著性差異。蛋白質和鈣的含量略有提高，但差異不顯著；其它營養(yǎng)成分均有不同程度的降低，差異不顯著(P＞0.05)。

3 結論

綜上所述，本試驗通過一系列的篩選條件，最終確定了乳酸菌發(fā)酵有機米糠富硒的最優(yōu)條件：有機米糠添加量34 g、培養(yǎng)基裝液量55 ml、接種量9%、種齡8～16 h、發(fā)酵時間48 h、發(fā)酵溫度37℃、亞硒酸鈉添加量100 mg/l，而且，在此條件下發(fā)酵有機米糠，乳酸菌的生物量可達9.94 g/l，有機硒的生產水平為7.46 mg/l。

（參考文獻12篇，刊略，需者可函索）