■陳 棟 金秋燕

（青島理工大學(xué)環(huán)境與市政工程學(xué)院，山東青島 266033）

魚粉是魚飼料中的主要蛋白源，過度捕撈和不良?xì)夂蛑率故澜玺~粉的總產(chǎn)量逐步下降，而需求量又不斷加大，這種供需矛盾導(dǎo)致魚粉價(jià)格急劇上升[1]。而具有消化吸收率高、氨基酸組成好、價(jià)格低廉和資源豐富的大豆蛋白逐步成為首選替代品[2]。但大豆蛋白中富含大豆異黃酮，金雀異黃素、黃豆苷元和黃豆黃素是大豆異黃酮中含量最豐富的三種物質(zhì)，它們在不同大豆源中的濃度大約為619.1～2 367.9、539.5～1 737.7、291.5～600.8 μg/g[3]。在實(shí)際生產(chǎn)中，金雀異黃素和黃豆苷元在大豆?jié)饪s蛋白中檢出量最高可達(dá)到5 900和1 990 μg/g[4]，當(dāng)飼料中的50%魚粉完全被大豆?jié)饪s蛋白替代時(shí)，飼料中的金雀異黃素和黃豆苷元將分別接近3 000和1 000 μg/g。大豆異黃酮對魚類[5]、畜禽[6]和人類[7]均具有潛在的生物學(xué)作用。在畜禽中，黃豆苷元通常作為提高生殖性能、促進(jìn)生長和增強(qiáng)機(jī)體免疫力的綠色添加劑廣泛應(yīng)用于畜禽飼料中[8]；在魚類中，大豆異黃酮影響研究大多集中在用豆粉替代水產(chǎn)飼料中的魚粉后對魚類生長產(chǎn)生的間接影響上，而對魚類生長直接影響的研究報(bào)道比較少，研究結(jié)果之間的差異也比較大[9-12]。

與高等脊椎動(dòng)物相似，魚類生長的內(nèi)分泌調(diào)控模式也主要受到下丘腦-垂體-肝臟所組成的生長軸線的調(diào)控，即受到生長激素/胰島素樣生長因子軸(GH/IGF-I)的調(diào)控[13]。下丘腦分泌產(chǎn)生多種神經(jīng)內(nèi)分泌因子，調(diào)控腦垂體生長激素細(xì)胞合成并分泌GH，通過血液循環(huán)，GH與肝細(xì)胞表面的GHR結(jié)合，刺激肝細(xì)胞釋放IGF-I，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的增殖和生長[14]。因此，GH、GHR和IGF-I是反映魚類生長性能的重要指標(biāo)。

金雀異黃素是大豆異黃酮中含量最豐富、生物活性最強(qiáng)的一種物質(zhì)。因此，本文以含不同濃度金雀異黃素的餌料飼喂尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)幼魚，研究金雀異黃素對羅非魚生長性能的影響，并利用real-time PCR方法檢測其對GH/IGF-I生長軸中垂體GH、肝臟GHRs和肝臟IGF-I基因表達(dá)的影響，初步探討金雀異黃素對羅非魚生長的影響效應(yīng)，為推廣以豆粉為蛋白源的新型魚飼料提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 飼料原料與配方

以魚粉為主要蛋白源，魚油為脂肪源，小麥粉為糖源，制備4種等氮、等能的實(shí)驗(yàn)飼料（見表1），分別向基礎(chǔ)飼料中添加0、30、300 μg/g和3 000 μg/g的金雀異黃素（購自深圳市美荷生物技術(shù)有限公司）。配制飼料前，各種飼料原料經(jīng)粉碎機(jī)預(yù)先粉碎后過80目篩。按表1所示均勻混合，再與水和魚油充分混勻，然后用雙螺桿擠條機(jī)(華南理工大學(xué),F-26(Ⅱ)型)加工成型，45℃烘干至水分含量在10%左右。飼料破碎過篩，制備成1.5 mm×3.0 mm大小的顆粒，顆粒飼料密封保存，-20℃?zhèn)溆谩?/p>

表1 飼料組成及營養(yǎng)水平(干重)

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)管理

實(shí)驗(yàn)選用兩月齡的“新吉富”品系尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)幼魚，該魚購自國家級青島羅非魚良種場。實(shí)驗(yàn)前，將該魚用基礎(chǔ)飼料(Diet 1)喂食2周以適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)養(yǎng)殖環(huán)境，馴養(yǎng)結(jié)束后，羅非魚禁食24 h。挑選體格健壯、規(guī)格一致的羅非魚[(10.47±1.24)g]隨機(jī)分配于12個(gè)玻璃水族箱（50 L，4個(gè)實(shí)驗(yàn)處理組，每組3個(gè)重復(fù)），每箱15尾魚。每天上午9：00，下午4：00分2次投喂飼料，投餌量約為平均生物量的5%。投喂結(jié)束后1 h，清除殘餌及糞便。養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行8周，水溫26～30 ℃，溶解氧為6.9～7.1 mg/l，pH值7.4～7.8，14 h/10 h光暗比。

1.3 樣品收集與分析

養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，禁食24 h，將羅非魚用75 mg/l MS-222(Sigma,St.Louis,MO,USA)麻醉，用吸水紙輕輕地擦凈魚體上的水分，用直尺測量羅非魚的體長(cm)，精確至0.01 cm；用分析天平測量體重(g)，精確至0.01 g。而后，選取每組15尾魚中的8尾，用剪刀從泄殖孔開始沿腹腔解剖，取出下丘腦、垂體和肝臟等組織，用生理鹽水清洗后，液氮速凍，-80℃保存，用以提取RNA。

1.4 生長軸mRNA表達(dá)分析

將凍存的組織取出勻漿后，按照Trizol(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)試劑盒說明提取總RNA，根據(jù)OD260值計(jì)算RNA樣品濃度，以O(shè)D260/280比值判斷RNA的純度。在反轉(zhuǎn)錄前用DNase I(Promega,Madison,WI,USA)去除痕量的DNA。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Toyobo,Osaka)將總量為1 μg的RNA在20 μl的反應(yīng)體系中反轉(zhuǎn)錄成cDNA，而后向所得cDNA加入80 μl dH2O，稀釋5倍后保存于-20℃冰箱中備用。

根據(jù)Genebank中已經(jīng)發(fā)表的基因序列，使用Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)尼羅羅非魚GH、GHR1、GHR2、IGF-I以及內(nèi)參基因β-actin和18S rRNA等基因的引物(見表2)，用于real-time PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增在Eppendorf Mastercycler?ep realplex2(Eppendorf,Germany)real-time PCR儀中進(jìn)行，所使用的熒光劑為SYBR green mix kit(TaKaRa,Dalian,China)。20 μl的Real-time PCR反應(yīng)體系為10 μl SYBR?Premix Ex TaqTM II，0.4 μl ROX 參考染料，各0.4 μl的上下游引物(10 μmol/l),4 μl cDNA 樣品和 4.8 μl dH2O。反應(yīng)條件為：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。采用內(nèi)參基因的△Ct法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量，Ct值表示每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)基因的熒光信號達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)的所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。為了對反應(yīng)體系中的基因擴(kuò)增進(jìn)行均一化處理，使用β-actin和18S rRNA作為內(nèi)參基因，以兩個(gè)內(nèi)參基因Ct值的幾何平均數(shù)作為修正內(nèi)參基因的Ct值，目的基因表達(dá)值=log2(2Ct(修正內(nèi)參基因)-Ct(目的基因)+1)。

表2 熒光實(shí)時(shí)定量PCR引物序列

1.5 計(jì)算及數(shù)據(jù)分析

羅非魚的特定生長率、存活率、攝食率和飼料系數(shù)參照以下公式計(jì)算。

特定生長率(SGR，%/d)=100×(ln Wt-ln W0)/t；

存活率(%)=100×Nt/N0；

攝食率(FI，%BW/d)=100×Df/[(Wt+W0)/2×t)]；

飼料系數(shù)(FER)=(Wt-W0)/Df。

式中：Wt——終體重(g)；

W0——初始體重(g)；

Nt——試驗(yàn)?zāi)~尾數(shù)；

N0——試驗(yàn)初魚尾數(shù)；

Df——總投飼量(g)；

t——養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)時(shí)間(d)。

將所有數(shù)據(jù)表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)”，采用Spss16.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，采用Tukey's方法分析處理組和對照組數(shù)據(jù)之間的顯著性差異，其中P＜0.05為差異顯著；P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 金雀異黃素對羅非魚生長性能的影響(見表3)

表3 金雀異黃素對羅非魚生長性能的影響

由表3可見，8周后，對照組羅非魚平均體重為(43.75±1.64)g，當(dāng)向飼料中添加30、300 μg/g金雀異黃素時(shí)，羅非魚平均體重與對照組相比沒有顯著變化，而添加3 000 μg/g時(shí)，比對照組顯著降低，為(36.83±1.80)g(P＜0.05)。對照組羅非魚特定生長率為(2.52±0.07)%/d，30、300 μg/g飼料組羅非魚特定生長率與對照組相比無顯著變化，而3 000 μg/g飼料組顯著降低至(2.21±0.09)%/d(P＜0.05)。各處理組羅非魚的存活率、攝食率和飼料系數(shù)與對照組相比沒有顯著差異(P＞0.05)。

2.2 金雀異黃素對羅非魚垂體GH mRNA表達(dá)的影響(見圖1)

圖1 金雀異黃素對垂體GH基因表達(dá)水平的影響

如圖1所示，隨著金雀異黃素含量增加，羅非魚垂體GH mRNA水平逐步降低，3 000 μg/g組比對照組顯著降低(P＜0.05)，而30、300 μg/g組與對照組沒有顯著差異(P＞0.05)。

2.3 金雀異黃素對羅非魚肝臟GHR1、GHR2 mRNA表達(dá)的影響(見圖2～圖3)

圖2 金雀異黃素對肝臟GHR1基因表達(dá)水平的影響

如圖2、圖3所示，各處理組羅非魚肝臟GHR1 mRNA表達(dá)水平與對照組相比，沒有顯著差異(P＞0.05)，而隨著飼料中金雀異黃素添加量的增加，羅非魚肝臟GHR2 mRNA表達(dá)水平逐步降低，當(dāng)添加量為3 000 μg/g時(shí)，GHR2 mRNA表達(dá)水平比對照組顯著降低(P＜0.05)，而30、300 μg/g組GHR2 mRNA表達(dá)水平與對照組沒有顯著差異(P＞0.05)。

圖3 金雀異黃素對肝臟GHR2基因表達(dá)水平的影響

2.4 金雀異黃素對羅非魚肝臟IGF-I mRNA表達(dá)的影響(見圖4)

圖4 金雀異黃素對肝臟IGF-I基因表達(dá)水平的影響

如圖4所示，隨著飼料中金雀異黃素添加量的增加，羅非魚肝臟IGF-I mRNA表達(dá)水平呈現(xiàn)下降的趨勢，且當(dāng)添加量為3 000 μg/g時(shí)，IGF-I mRNA表達(dá)水平比對照組顯著降低(P＜0.05)，而30、300 μg/g組IGFI mRNA表達(dá)水平與對照組沒有顯著差異(P＞0.05)。

3 討論

本研究中配制的四組飼料蛋白質(zhì)含量均達(dá)到了45%，能夠滿足羅非魚對蛋白質(zhì)的營養(yǎng)需求[15]。目前，豆類產(chǎn)品中金雀異黃素最大含量大約為5 900 μg/g[4]，因此，當(dāng)用豆粉完全替代魚粉時(shí)，飼料中金雀異黃素的最高含量大約3 000 μg/g，所以本實(shí)驗(yàn)中金雀異黃素的最大添加量為3 000 μg/g。一些研究表明，豆粉中存在皂苷、寡糖、凝集素和蛋白酶抑制因子等諸多抗?fàn)I養(yǎng)因子[16]，這些因子會通過影響飼料的適口性而降低魚類的食欲，減少魚類的攝食量，進(jìn)而抑制魚類的生長[17]，所以本研究選擇直接向基礎(chǔ)飼料中添加不同濃度的金雀異黃素，進(jìn)而排除其它抗?fàn)I養(yǎng)因子的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，與對照組相比，各處理組羅非魚的攝食率和飼料系數(shù)均沒有顯著變化，羅非魚生長性能的差異主要是由不同濃度金雀異黃素的影響而產(chǎn)生的。

本研究表明，向飼料中添加較低濃度的金雀異黃素(0～300 μg/g)，羅非魚的生長沒有顯著變化，這一結(jié)果與許多研究結(jié)果基本一致，Rodriguez[18]和Catherine等[19]分別發(fā)現(xiàn)，500 μg/g的金雀異黃素對尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)和虹鱒魚(Oncorhynchus mykiss)的生長均沒有顯著影響，而Kinarm等[20]也觀察到750 μg/g的金雀異黃素對黃金鱸魚(Perca flavescens)的生長沒有顯著影響。而當(dāng)添加3 000 μg/g的金雀異黃素時(shí)，則顯著抑制了羅非魚幼魚的生長，其最終平均體重和特定生長率分別降低了15.82%和12.30%。與此類似，蔡英華[21]也發(fā)現(xiàn)，含金雀異黃素3 100 μg/g的飼料顯著抑制了牙鲆(Paralichthys olivaceus)的生長。張偉[5]觀察到，用金雀異黃素含量為7 200 μg/g的飼料飼喂異育銀鯽(Carassius auratus gibelio×Cyprinus carpio)時(shí)，其最終平均體重與對照組相比顯著降低了10.4%。但Pollack等[22]的研究卻表明，8 000 μg/g的金雀異黃素對條紋鱸魚(Morone chrysops)的生長沒有顯著影響。以上研究結(jié)果的較大差異可能與實(shí)驗(yàn)魚的種類、發(fā)育階段和魚的性別等因素相關(guān)。盡管金雀異黃素對魚類生長的抑制濃度在不同的研究中差別較大，但根據(jù)已有的研究結(jié)果可以看出，當(dāng)金雀異黃素的含量在mg/g水平時(shí)或許才對魚類的生長有潛在的抑制作用。

魚類的生長主要受到GH/IGF-I生長軸線的調(diào)控[23]，GH和IGF-I是該軸線中的核心因子。在正常的環(huán)境條件下，魚類的生長狀況與體內(nèi)GH水平成正相關(guān)，處于快速生長期的羅非魚血漿中的GH含量顯著升高[24]。但在某些脅迫條件下，魚體的生長狀況與體內(nèi)的GH水平也可能成負(fù)相關(guān)。Fox等[25]將莫桑比克羅非魚禁食4周后，發(fā)現(xiàn)其最終平均體重和特定生長率均顯著降低，但血漿GH含量及垂體GH mRNA表達(dá)量卻顯著升高；尼羅羅非魚在含有久效磷農(nóng)藥的水中暴露3周后，其生長受到了顯著的抑制，但其GH水平卻顯著升高[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，羅非魚垂體GH mRNA的表達(dá)水平與羅非魚體生長狀況趨勢一致，均隨著金雀異黃素含量的增加而逐步降低，3 000 μg/g的金雀異黃素顯著抑制了垂體GH mRNA的表達(dá)，進(jìn)而抑制了魚體的生長。

IGF-I通過調(diào)控細(xì)胞代謝，促進(jìn)細(xì)胞的有絲分裂、分化而介導(dǎo)GH的促生長作用，與GH相比，魚體的生長狀況與IGF-I水平有更高的相關(guān)性。在不同的溫度條件下，尼羅羅非魚的最終平均體重與肝臟IGF-I mRNA表達(dá)量呈顯著正相關(guān)[27]。莫桑比克羅非魚禁食2周后，其最終平均體重和特定生長率均顯著下降，與此同時(shí)，其血漿IGF-I含量及肝臟IGF-I mRNA表達(dá)量也顯著降低[28]。而且，魚類垂體GH可以促進(jìn)肝臟IGF-I基因的表達(dá)，并能提高血漿IGF-I濃度[29]。本研究中，3 000 μg/g金雀異黃素顯著抑制了垂體GH mRNA的表達(dá)，這與肝臟IGF-I mRNA表達(dá)量和魚體生長狀況的變化趨勢一致，均是隨著金雀異黃素含量的增加而逐步降低，且3 000 μg/g飼料組比對照組顯著降低。因此，金雀異黃素可通過抑制垂體GH而抑制肝臟IGF-I的合成，進(jìn)而抑制羅非魚的生長。

GH與肝臟表面的GHR結(jié)合后，刺激肝細(xì)胞合成并分泌IGF-I，因此GHR對IGF-I有重要的調(diào)控作用，其表達(dá)水平在某種程度上能夠反映動(dòng)物的生長狀況。鄭艷研究表明，GHR2是介導(dǎo)GH促生長作用的主要因子，其對GH的親和力遠(yuǎn)高于GHR1[26]。本研究也發(fā)現(xiàn)，3 000 μg/g金雀異黃素顯著抑制了GHR2 mRNA的表達(dá)，而對GHR1 mRNA的表達(dá)沒有顯著影響。由此可見，由于GHR2表達(dá)量的下降引起了IGFI表達(dá)水平的降低，進(jìn)而抑制了羅非魚的生長。

具有雌激素活性物質(zhì)能夠影響魚類GHRs的表達(dá)。Lori(2009)研究表明，E2能夠顯著抑制雄性羅非魚GHR1和GHR2的表達(dá)；o,p’-DDE能夠顯著抑制GHR2的表達(dá)，而對GHR1表達(dá)沒有影響；七氯同樣能夠顯著抑制GHR2的表達(dá)，但對GHR1表達(dá)有顯著的促進(jìn)作用[30]。關(guān)于這些雌激素活性物質(zhì)調(diào)控GHRs表達(dá)的機(jī)理是通過與ERs結(jié)合還是通過影響甲狀腺激素或神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮作用目前還不清楚，有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

①30、300 μg/g金雀異黃素對羅非魚終末均重和特定生長率均未產(chǎn)生顯著影響，3 000 μg/g金雀異黃素顯著降低了羅非魚的生長，各處理組對羅非魚的攝食率和飼料系數(shù)均未產(chǎn)生顯著影響。

②隨著金雀異黃素含量的增加，羅非魚垂體GH和肝臟IGF-I mRNA表達(dá)量逐步降低，3 000 μg/g飼料組顯著降低。各處理組對羅非魚肝臟GHR1 mRNA表達(dá)量沒有顯著影響，3 000 μg/g飼料組顯著降低了GHR2 mRNA表達(dá)量。

③高濃度金雀異黃素可通過抑制尼羅羅非魚生長軸相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制魚類的生長。