■ 劉清兵 曹啟猛 于躍芹 王 雷 蔣克勇 劉 梅 王寶杰 張維金 李燕翠

（1.青島科技大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，山東青島 266042；2.中國科學(xué)院實(shí)驗(yàn)海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266071；3.青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實(shí)驗(yàn)室海洋生物學(xué)與生物技術(shù)功能實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266071；4.秦皇島益爾生物推廣服務(wù)有限公司，河北秦皇島 066000）

魚粉蛋白質(zhì)含量高，適口性好，富含蛋氨酸、賴氨酸等必需氨基酸，而且含有豐富的礦物質(zhì)和維生素以及未知生長因子等，因此一直被作為水產(chǎn)飼料的主要蛋白質(zhì)來源。但是近幾年來，由于厄爾尼諾現(xiàn)象、海洋污染和過度捕撈等因素使得全球漁業(yè)自然資源的衰退，導(dǎo)致世界魚粉產(chǎn)量逐年下降。然而，隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)模的不斷迅速增長，對魚粉的需求量也大幅增加，這就使得全球魚粉的供應(yīng)日益緊張，價(jià)格不斷上升，市場競爭加劇，飼料成本也隨魚粉價(jià)格上升而加大。中國是世界上最大的魚粉使用國和進(jìn)口國，因此，研究開發(fā)能部分或者完全替代魚粉的新型蛋白源已成為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)必須面對和解決的問題。

替代魚粉的蛋白源主要有動物蛋白源和植物蛋白源兩大類。植物蛋白源是一種既經(jīng)濟(jì)又營養(yǎng)的蛋白源，如大豆制品、豌豆、棉籽餅粕、花生粕、菜粕等，具有來源廣、品質(zhì)穩(wěn)定、價(jià)格低廉和營養(yǎng)豐富等特點(diǎn)。使用植物蛋白源替代飼料中魚粉的研究已有大量的報(bào)道，楊奇慧等研究發(fā)現(xiàn)在魚粉含量為30%、粗蛋白質(zhì)含量為40%的南美白對蝦基礎(chǔ)飼料中，可以用10%的花生粕替代魚粉。何大慶等研究發(fā)現(xiàn)，可以用美國去皮豆粕替代南美白對蝦飼料中60%的魚粉。但植物蛋白源也有很多缺點(diǎn)，包括必需氨基酸缺失、蛋白質(zhì)含量偏低和抗?fàn)I養(yǎng)因子存在等，尤其是含有的抗?fàn)I養(yǎng)因子如蛋白酶抑制劑、各種凝集素、纖維素、抗原化合物等,長期使用會導(dǎo)致水產(chǎn)動物的生長受到抑制，有些會影響飼料中營養(yǎng)元素的利用使得蛋白質(zhì)利用率降低，有些則會影響飼料的適口性,有些會使水產(chǎn)動物生長速度降低，有些會提高水產(chǎn)動物的餌料系數(shù)，有些甚至?xí)顾a(chǎn)動物的肝臟、腸道產(chǎn)生病變。

20世紀(jì)60年代,Newey等首次提出了肽可以被完整吸收的證據(jù)，但是直到20世紀(jì)80年代，小肽能夠被完整吸收的觀點(diǎn)及其生理作用才引起人們重視，并且越來越多的科研人員對其進(jìn)行了相關(guān)研究，取得了許多成果。研究表明,蛋白質(zhì)在消化道內(nèi)的分解產(chǎn)物大部分是小肽（主要是二肽和三肽），小肽可以直接被機(jī)體完整吸收并被組織利用，并且小肽作為蛋白質(zhì)的主要分解產(chǎn)物,在氨基酸的消化、吸收和代謝中起著重要作用。在水產(chǎn)動物中,已有學(xué)者研究了小肽對凡納濱對蝦、西伯利亞鱘、異育銀鯽等生長性能和免疫能力的影響。

赤金蛋白（Pure-Gold Peptide）T30是以禽血為主要原料，以酶解大豆蛋白為載體，采用生物酶工程技術(shù)制取的功能性蛋白肽。其原料經(jīng)過高壓滅菌預(yù)處理后進(jìn)行酶解、瞬間高溫滅菌、低溫干燥，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，使用安全。赤金蛋白T30中的生物活性肽及游離氨基酸（酸溶蛋白）絕對含量高于35%，其中小肽含量12%以上，且生產(chǎn)成本比魚粉低，對于循環(huán)經(jīng)濟(jì)和資源的高值化利用具有重要意義。

南美白對蝦學(xué)名凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)，別名凡納對蝦、白腳蝦等，其適應(yīng)能力強(qiáng)、雜食性、廣鹽性，具有生長速度快、肉質(zhì)鮮美、飼料利用效率高、加工出肉率高等優(yōu)點(diǎn)，養(yǎng)殖模式多樣，是我國最主要的對蝦養(yǎng)殖種類，其營養(yǎng)與飼料研究開發(fā)也是業(yè)內(nèi)關(guān)注的焦點(diǎn)。本文通過實(shí)驗(yàn)室及生產(chǎn)性養(yǎng)殖對比試驗(yàn)，測定分析生長指標(biāo)、營養(yǎng)成分、消化酶活力和血清免疫指標(biāo)等，研究赤金蛋白T30活性肽在南美白對蝦養(yǎng)殖中的營養(yǎng)與免疫功效，確定其最佳應(yīng)用技術(shù)，為其盡快應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)際提供指導(dǎo)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)采用的基礎(chǔ)飼料配方為煙臺大樂飼料有限公司生產(chǎn)的對蝦大棚專用飼料（按照養(yǎng)殖進(jìn)程分為0#、1#和2#料）?；A(chǔ)飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。

赤金蛋白T30由秦皇島益爾生物技術(shù)推廣服務(wù)有限公司所屬的大連益爾保成肽業(yè)有限公司提供。T30的肽分子量分布見表2，營養(yǎng)成分分析見表3。

表1 基礎(chǔ)飼料組成及營養(yǎng)水平（%）

表2 赤金蛋白T30肽分子量分布

表3 赤金蛋白T30營養(yǎng)成分分析（干物質(zhì)基礎(chǔ)）

基礎(chǔ)飼料配方中0#/1#料和2#料的魚粉用量分別為32%和30%，赤金蛋白T30分別替代基礎(chǔ)飼料配方中魚粉用量的15%和30%，即：0#/1#料中的使用量為4.8%和9.6%，2#料中的使用量為4.4%和8.8%。由于T30的粗蛋白含量與魚粉接近，故各魚粉替代組飼料的粗蛋白含量與對照組一致。

1.2 試驗(yàn)動物與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)動物為南美白對蝦優(yōu)質(zhì)一代蝦苗，試驗(yàn)初始體重為(0.155±0.01)g，放苗密度400尾/m2。試驗(yàn)地點(diǎn)為青島瑞滋海珍品發(fā)展有限公司的工廠化養(yǎng)殖車間，每個養(yǎng)殖池5 m×5 m，水深1.0～1.2 m。

分別以T30替代飼料配方中魚粉用量的15%（試驗(yàn)組B）和30%（試驗(yàn)組C）為試驗(yàn)組，以基礎(chǔ)飼料配方（試驗(yàn)組A）為對照組。將9個養(yǎng)殖池隨機(jī)分成3組，每組3個重復(fù)，每個養(yǎng)殖池中放養(yǎng)健康南美白對蝦苗10 000尾。

1.3 試驗(yàn)管理

試驗(yàn)期內(nèi)，每天按照對蝦體重的8%～10%投料，每天喂4次，分別在06：00、10：00、16：00、20：00，并記錄投喂量、水溫、pH值、鹽度、溶氧等水質(zhì)參數(shù)。池內(nèi)安放餌料臺，投料1 h后，觀察對蝦攝食情況，及時(shí)調(diào)整投料量。每天觀察對蝦攝食、蛻殼、生長情況。試驗(yàn)用水為經(jīng)過沉淀、砂濾的海水，養(yǎng)殖期間每天早上排污并補(bǔ)充新鮮海水。試驗(yàn)期間連續(xù)充氧。定期測定水中氨氮、亞硝酸鹽含量。試驗(yàn)期間水溫為27.0～31.0 ℃，鹽度為30～32，溶解氧＞8.0 mg/l，pH值為7.8～8.3，氨氮含量＜0.30 mg/l，亞硝酸鹽含量＜0.20 mg/l。試驗(yàn)自放苗入池開始直至養(yǎng)殖結(jié)束，共計(jì)60 d。

1.4 樣品采集

每隔20 d自各試驗(yàn)池中隨機(jī)撈取南美白對蝦20尾，測量其體長、體重，并計(jì)算平均值。第60 d試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，于養(yǎng)殖池中隨機(jī)撈取南美白對蝦20尾，稱量每只蝦的體重和體長，取出肝胰臟后迅速放于液氮中保存，再轉(zhuǎn)移到-80℃超低溫冰箱中存放，以測定肝胰臟相關(guān)酶活力指標(biāo)。用2.5 ml注射器吸取1 ml抗凝劑，從圍心腔中抽取1 ml蝦血，將血液放置1.5 ml Eppendorf管中，4℃離心，吸取上清液進(jìn)行血清免疫指標(biāo)的測定。隨機(jī)取3只蝦，保存于-20℃冰箱中，用于蝦體成分分析。

1.5 生長指標(biāo)測定

試驗(yàn)期第20、40、60 d時(shí)，隨機(jī)取對蝦稱重并計(jì)算平均體重（精確到0.01 g），計(jì)算增重率和特定生長率；試驗(yàn)第60 d時(shí)，取樣計(jì)算飼料系數(shù)和成活率等。

增重率（WG，%）=100×(Wt-W0)/W0；

特定生長率（SGR，%/d）=100×[(lnWt-lnW0)]/t；

飼料系數(shù)（FCR）=FI/W；

成活率（SR，%）=100×FN/IN。

式中：Wt——試驗(yàn)結(jié)束時(shí)南美白對蝦的平均重量(g)；

W0——試驗(yàn)開始時(shí)南美白對蝦的平均重量(g)；

FI——試驗(yàn)期間蝦攝食飼料的干物質(zhì)總重量(g)；

W——對蝦的增重量(g)；

t——養(yǎng)殖時(shí)間(d)；

FN——試驗(yàn)結(jié)束時(shí)南美白對蝦尾數(shù)；

IN——試驗(yàn)開始時(shí)南美白對蝦尾數(shù)。

1.6 樣品分析

1.6.1 常規(guī)營養(yǎng)成分分析

分別采用烘干失重法(GB 5009.3-2010)、凱氏定氮法(GB 5009.3-2010)、索氏抽提法(GB/T 5009.3-2003)和高溫灼燒(GB 5009.4-2010)測定蝦體的水分、粗蛋白、粗脂肪和灰分。

1.6.2 肝胰臟消化酶活力的測定

從-80℃超低溫冰箱中取出肝胰臟樣品，轉(zhuǎn)移到4℃冰箱中，待其解凍后備用。準(zhǔn)確稱量肝胰臟0.5 g，然后按1∶4的質(zhì)量體積比加入預(yù)冷的PBS緩沖液，在冰浴條件下勻漿，在4℃下靜置4 h，然后4℃、8 000×g條件下離心30 min，所得上清液即為粗酶液。收集粗酶液分裝于1.5 ml離心管中，將其置于4℃冰箱中保存，并于24 h內(nèi)測完消化酶(脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶)活力。

采用G-250考馬斯亮藍(lán)染色法測定粗酶液蛋白濃度。消化酶的活力以比活力表示，定義為每克酶所具有的酶活力單位數(shù)，即酶單位/mg蛋白(U/mg蛋白)。

采用azacation（偶氮酪蛋白）水解法測定粗酶液的蛋白酶活力，蛋白酶活力單位定義為：30℃下，pH值7.2條件下，蛋白酶水解1%azocation的底物，將每分鐘OD值增加0.001所需要的酶量定義為一個酶活力單位。

采用3，5二硝基水楊酸（DNS）法測定粗酶液纖維素酶活力。纖維素酶活力單位（U）定義為：pH值7.2，在37℃條件下保溫30 min，纖維素酶分解0.5%CMC，將每分鐘OD值增加0.001所需要的酶量定義為一個酶活力單位。

采用3,5二硝基水楊酸（DNS）法測定粗酶液淀粉酶活力。淀粉酶活力（U）：pH值7.2，在37℃條件下保溫30 min，淀粉酶分解1%淀粉溶液，將每分鐘OD值增加0.001所需要的酶量定義為一個酶活力單位。

采用對硝基苯酚法測定粗酶液脂肪酶活力。本試驗(yàn)以對硝基苯磷酸脂（P-NPP）為底物測定粗酶液脂肪酶的活力。脂肪酶活力單位（U）：pH值7.2，在37℃條件下保溫10 min，脂肪酶水解對硝基苯磷酸酯（P-NPP），將每分鐘OD值增加0.001所需要的酶量定義為一個酶活力單位。

1.6.3 血清免疫指標(biāo)的測定

酸性磷酸酶(ACP)活力、堿性磷酸酶（AKP）活力、超氧化物歧化酶(SOD)活力和溶菌酶活力采用南京建成生物工程研究所的試劑盒進(jìn)行測定，具體測定方法按照說明書進(jìn)行。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(means±SE)”表示。先使用Microsoft Excel 2010進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，再采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，并結(jié)合最小顯著差數(shù)法（LSD法）進(jìn)行多重比較，判斷平均數(shù)之間的差異顯著性，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果分析

2.1 赤金蛋白T30替代魚粉對南美白對蝦生長指標(biāo)的影響

試驗(yàn)期間對蝦的生長測量結(jié)果見圖1。赤金蛋白T30替代飼料中不同比例魚粉對南美白對蝦生長性能的影響見表4。

圖1 不同飼料處理對南美白對蝦生長性能的影響

由圖1可以看出，在初始體重和體長相同的情況下，隨著飼養(yǎng)時(shí)間的增加，試驗(yàn)B組的體長和體重增加的最多，其次是C組，A組相對增加較少。

由表4可以看出，在初始體重相同的前提下，喂養(yǎng)20 d，B組的末體重、增重率、特定生長率顯著高于A組和C組(P＜0.05)；C組的末體重、增重率和特定生長率均高于A組，但差異性均不顯著（P＞0.05）。喂養(yǎng)40 d，B組的末體重顯著高于A組和C組(P＜0.05)，增重率B組顯著高于A組和C組(P＜0.05)，但A組和C組間差異不顯著（P＞0.05）；特定生長率B組＞A組＞C組，A組和B組、A組和C組間差異性不顯著（P＞0.05），B組和C組間差異性顯著(P＜0.05)。喂養(yǎng)60 d，B組的末體重、增重率、特定生長率最高，C組次之，A組最低，但三組間差異性不顯著（P＞0.05）；成活率B組＞A組＞C組，B組和A組間差異性不顯著（P＞0.05），但B組和A組與C組間差異性顯著(P＜0.05)。

表4 赤金蛋白T30替代魚粉對南美白對蝦生長指標(biāo)的影響

2.2 赤金蛋白T30替代魚粉對南美白對蝦蝦體成分的影響（見表5）

表5 赤金蛋白T30替代魚粉對南美白對蝦蝦體成分的影響(%)

由表5可以看出，隨著赤金蛋白T30替代魚粉比例的提高，蝦體粗蛋白含量顯著提高（P＜0.05），粗脂肪含量顯著降低（P＜0.05），水分含量降低但差異不顯著（P＞0.05），灰分含量B組和C組無顯著性差異（P＞0.05），但顯著高于A組（P＜0.05）。

2.3 赤金蛋白T30替代魚粉對南美白對蝦肝胰臟消化酶活力的影響(見表6)

表6 赤金蛋白T30替代魚粉對南美白對蝦肝胰臟消化酶活力的影響(U/mg prot)

由表6可知，各試驗(yàn)組南美白對蝦肝胰臟的蛋白酶活力、脂肪酶活力、纖維素酶活力差異不顯著（P＞0.05）。淀粉酶活力C組與B組顯著高于A組(P＜0.05)。

2.4 赤金蛋白T30替代魚粉對南美白對蝦血清免疫指標(biāo)的影響(見表7)

表7 赤金蛋白T30替代魚粉對南美白對蝦血清免疫指標(biāo)的影響

由表7可以看出，各試驗(yàn)組的酸性磷酸酶活力和溶菌酶活力差異不顯著（P＞0.05）；B組的堿性磷酸酶活力顯著高于A組和C組（P＜0.05）；B組的總超氧化物歧化酶活力均高于A組和C組，且和A組差異顯著（P＜0.05），和C組差異不顯著（P＞0.05），C組高于A組且差異不顯著（P＞0.05）。

3 討論

3.1 赤金蛋白T30替代魚粉對南美白對蝦生長指標(biāo)的影響

本試驗(yàn)結(jié)果表明，使用赤金蛋白T30替代飼料中適量的魚粉能改善南美白對蝦生長性能，包括提高南美白對蝦的增重率、特定生長率，提高成活率，降低飼料系數(shù)等。上述結(jié)果和使用小肽替代魚粉喂養(yǎng)青魚、銀鯽、西伯利亞鱘、南美白對蝦等的研究結(jié)果一致。赤金蛋白T30適宜替代魚粉用量為15%，對南美白對蝦的生長起到促進(jìn)作用，同時(shí)可降低飼料成本。但過多添加（30%）則會影響其生長并降低飼料轉(zhuǎn)化率，這可能是由于T30中氨基酸組成的平衡性與魚粉有所差異，雖然T30比植物蛋白源的氨基酸組成相對平衡，但其賴氨酸和蛋氨酸的含量低于魚粉中的含量。小肽的添加量越多，飼料中所含賴氨酸和蛋氨酸的量與使用魚粉的差異也越大，因此，飼料中必需氨基酸與非必需氨基酸間的比例差異越大，對生長可能產(chǎn)生一定抑制作用。另外，本試驗(yàn)中隨著飼養(yǎng)天數(shù)的增加，各試驗(yàn)組間的差異性變得不顯著，可能是由于對蝦養(yǎng)殖密度過高，規(guī)格增加后沒有及時(shí)疏苗所致。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，15%替代組的成活率與對照組相近，但是30%替代組的成活率偏低，可能是赤金蛋白T30替代了過多的魚粉，使得飼料中的營養(yǎng)平衡改變，未知生長因子含量偏低，從而影響南美白對蝦的生長和成活率。

3.2 赤金蛋白T30替代魚粉對南美白對蝦蝦體成分的影響

本試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著赤金蛋白T30替代魚粉用量的增加，南美白對蝦蝦體粗蛋白的含量呈上升趨勢，且差異顯著，這和劉沛等對青魚的研究結(jié)果不一致。隨著赤金蛋白T30替代魚粉用量的增加，南美白對蝦蝦體粗脂肪的含量呈下降趨勢，且差異顯著，這和徐奇友等對哲羅魚稚魚的研究結(jié)果一致。隨著赤金蛋白T30替代魚粉用量的增加，南美白對蝦蝦體灰分呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，且試驗(yàn)組與對照組間差異顯著，試驗(yàn)組間差異不顯著。隨著赤金蛋白T30替代魚粉用量的增加，南美白對蝦蝦體的水分含量差異不顯著。本試驗(yàn)中隨替代量的增加，蛋白質(zhì)含量上升，和其他人的研究不一致，其原因有待進(jìn)一步探究。脂肪含量隨著替代量的升高，呈下降趨勢，說明飼料中添加赤金蛋白T30有可能降低蝦體的脂肪沉積作用?？傮w而言，赤金蛋白T30替代魚粉后對蝦體營養(yǎng)起到了正面作用（高蛋白、低脂肪），對其他成分無顯著影響。

3.3 赤金蛋白T30替代魚粉對南美白對蝦肝胰臟消化酶活力的影響

本試驗(yàn)結(jié)果表明，赤金蛋白T30替代不同的魚粉用量，對南美白對蝦肝胰臟的蛋白酶活力和纖維素酶活力均無顯著影響。隨著替代比例的提高，淀粉酶活性顯著提高，并且兩個試驗(yàn)組和對照組有顯著差異，但兩試驗(yàn)組間沒有顯著差異。楊奇慧等研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用花生粕替代魚粉蛋白質(zhì)比例高于20%時(shí)，肝胰臟淀粉酶的活性顯著提高。隨著替代比例的提高，對蝦肝胰臟脂肪酶活性呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，赤金蛋白T30替代魚粉用量的15%時(shí)最高，這與張帆等研究使用豆粕替代魚粉對大黃魚消化酶活力影響一致。小肽的使用，可能會刺激水產(chǎn)動物消化酶的分泌，從而促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的消化與吸收，但與養(yǎng)殖對象、替代比例等密切相關(guān)，有待進(jìn)一步的研究。

3.4 赤金蛋白T30替代魚粉對南美白對蝦血清免疫指標(biāo)的影響

本試驗(yàn)結(jié)果表明，赤金蛋白T30替代不同的魚粉用量，對南美白對蝦血清中酸性磷酸酶和溶菌酶活力均無顯著影響，并且都呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。15%替代組的堿性磷酸酶活力顯著高于A組和C組，而C組的堿性磷酸酶活力高于A組但差異不顯著。ACP、AKP和溶菌酶是吞噬細(xì)胞殺菌的物質(zhì)基礎(chǔ)，能夠形成水解酶體系，破壞和消除侵入體內(nèi)的異物，起到機(jī)體防御的功能。結(jié)果表明，使用赤金蛋白T30替代魚粉用量的15%，可以誘導(dǎo)ACP、AKP和溶菌酶活力的增加，從而提高了機(jī)體的免疫功能。超氧化物歧化酶（SOD）可以催化超氧離子自由基進(jìn)行歧化反應(yīng)，減少自由基對機(jī)體的損害，是機(jī)體清除氧自由基的重要保護(hù)酶。本試驗(yàn)中15%替代組的SOD活力最高，且高于C組，說明適量的赤金蛋白T30可以提高SOD活力。

4 結(jié)論

赤金蛋白T30替代南美白對蝦配方中魚粉用量15%，提高了南美白對蝦的增重率、特定生長率，可以促進(jìn)南美白對蝦的生長，提高成活率、降低飼料系數(shù)。同時(shí)顯著提高了蝦體營養(yǎng)成分中粗蛋白的含量、顯著降低了脂肪含量，對蝦體營養(yǎng)具有一定改善作用。赤金蛋白T30替代魚粉用量15%，顯著提高了南美白對蝦肝胰臟淀粉酶的活力，對部分血清免疫指標(biāo)有顯著促進(jìn)作用。生產(chǎn)實(shí)際中用赤金蛋白T30替代部分魚粉，可大大降低飼料配方成本，緩解魚粉資源的不足，提升飼料使用效果。因此，可以用赤金蛋白T30替代南美白對蝦飼料中魚粉用量的15%。

（參考文獻(xiàn)27篇，刊略，需者可函索）