非小細(xì)胞肺癌中VEGF-936C/T多態(tài)位點(diǎn)相關(guān)分析

楊桂香1，胡衛(wèi)盟2，齊迎松2

(1.河北省寬城滿族自治縣醫(yī)院，河北寬城067600

2.河北省承德市中心醫(yī)院，河北承德067000)

摘要：目的：檢測非小細(xì)胞肺癌患者血清中VEGF表達(dá)水平，探討其與非小細(xì)胞肺癌發(fā)生和發(fā)展的關(guān)聯(lián)性，并檢測其基因位點(diǎn)936C/T多態(tài)性與非小細(xì)胞肺癌的遺傳易感性。方法：運(yùn)用ELISA法及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-連接酶檢測反應(yīng)方法檢測80例非小細(xì)胞肺癌患者和80例健康體檢者外周血中VEGF的表達(dá)水平，對其基因位點(diǎn)936C/T多態(tài)分型進(jìn)行檢測，并分析與非小細(xì)胞肺癌的相關(guān)性。結(jié)果：非小細(xì)胞肺癌組VEGF表達(dá)水平顯著高于對照組，P=0.001(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；兩組間的基因型頻率(χ2=0.960，0.7500.05)和等位基因頻率(χ2=0.968，0.2500.05)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，基因型與非小細(xì)胞肺癌組的相關(guān)性分析(PTC=0.554，PTT=0.670，P>0.05)差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：VEGF在非小細(xì)胞肺癌中呈過表達(dá)狀態(tài)，且VEGF與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展具有相關(guān)性；但VEGF基因位點(diǎn)936C/T多態(tài)與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展并無明顯相關(guān)性。

關(guān)鍵詞：非小細(xì)胞肺癌;血管內(nèi)皮生長因子;單核苷酸多態(tài)性;遺傳易感

文章編號：1006-6233(2015)09-1559-05

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

肺癌是全球癌癥死亡的主要原因，約占全部惡性腫瘤死亡率的20%，其發(fā)生率和死亡率呈逐年上升趨勢，其中有80%為非小細(xì)胞肺癌[1]。研究發(fā)現(xiàn)，非小細(xì)胞肺癌惡性度高，預(yù)后差，易于早期轉(zhuǎn)移等生物學(xué)特性與血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)有關(guān)[2]。VEGF基因具有多態(tài)性，然而，在國內(nèi)關(guān)于VEGF基因單核苷酸多態(tài)性與肺癌發(fā)展關(guān)系的報(bào)道相對較少，本研究的目的是探討血清中VEGF表達(dá)水平及其基因位點(diǎn)936C/T多態(tài)與人群肺癌易感性的關(guān)系，進(jìn)而為非小細(xì)胞肺癌的早期風(fēng)險(xiǎn)性評估、早期診斷與預(yù)防以及相應(yīng)的治療等諸多方面提供依據(jù)。

1資料與方法

1.1臨床資料:選擇我醫(yī)院2010年9月至2012年5月經(jīng)病理確診的非小細(xì)胞肺癌患者80例，且患者無其它血管病變，采血前1周內(nèi)未經(jīng)過任何手術(shù)、放療、化療或免疫治療，其中男52例，女28例，年齡45～72歲，中位年齡55歲，按照世界衛(wèi)生組織肺癌分類標(biāo)準(zhǔn)：鱗癌32例，腺癌36例，大細(xì)胞癌8例，腺鱗癌4例。按照國際抗癌聯(lián)盟(UICC)第七版標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行TNM分期，其中Ⅰ期10例、Ⅱ期39例、Ⅲ期25例)，Ⅳ期6例。對照組為同期健康且排除其它血管病變疾病的體檢者80例，其中男54例，女26例，年齡35～76歲，平均52.6歲。所有標(biāo)本及臨床資料的收集均征得患者同意并簽署了知情同意書。

1.2主要儀器設(shè)備:BioRad450酶標(biāo)儀、Wizard基因組DNA純化試劑盒、東勝龍黑金剛EDC-810PCR儀、3730XL基因測序儀、Allegra25R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、Micro 17R微量臺(tái)式離心機(jī)、微量可調(diào)移液器、Taq酶、dNTP、Taq DNA ligase(上海捷瑞生物工程有限公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1血液標(biāo)本采集:符合入選標(biāo)準(zhǔn)的所有受檢者分別于清晨空腹?fàn)顟B(tài)下采肘靜脈血4mL于EDTA管中，在1h內(nèi)離心(3000r/min離心15min)，分離血清，取上清液(eppendorf離心管)，分裝保存于-20℃冰箱待測。VEGF血清水平測定采用ELISA法。

1.3.2基因組DNA的提取:上述血液標(biāo)本3000r/min離心15min，分離血細(xì)胞，取沉淀物。DNA的提取采用嚴(yán)格按照Wizard基因組DNA純化試劑盒的說明書進(jìn)行純化提取：取一只1.5mL無菌小離心管，加入900ul細(xì)胞裂解液；輕振血樣試管，直至徹底混勻，然后將血樣轉(zhuǎn)移至上述加有細(xì)胞裂解液的離心管中，顛倒混勻5～6次；室溫孵育10min(期間顛倒離心管2～3次混勻，一次)裂解紅細(xì)胞，13,000～16,000xg室溫離心20s；能將上清移棄干凈，剩余約10～20ul液體；重復(fù)上述操作，直到沉淀變白；使用渦旋振蕩器(Votex)劇烈混勻，直至白細(xì)胞重懸(10～15s)；向重懸細(xì)胞溶液中加入核裂解液，用移液槍頭吸放溶液5～6次裂解白細(xì)胞，若混合后可見細(xì)胞團(tuán)塊，則將溶液置于37℃孵育直至團(tuán)塊消散；向核裂解物中加入蛋白沉淀液100ul，用渦旋振蕩器劇烈振蕩10～20s；于16,000xg室溫離心3min；將其上清轉(zhuǎn)至裝有300ul室溫異丙醇的1.5mL干凈的離心管中；輕輕顛倒以混勻溶液，直至白色線狀DNA形成沉淀；于16,000xg室溫離心1min；棄去上清，加入與樣本量等體積的室溫70%乙醇，輕輕顛倒離心管數(shù)次清洗DNA沉淀和管壁，依照12步離心；使用巴斯德吸管或測序加樣槍頭小心吸走乙醇溶液，此時(shí)的DNA沉淀十分松弛，應(yīng)格外小心避免將DNA沉淀吸進(jìn)管中。將離心管倒置在干凈的吸水紙上，自然干燥10～15min；向離心管中加入DNA溶解液 (DNA RehydrationSolution)100ul；65℃孵育1h溶解 DNA。期間可輕彈管壁混勻溶液；2～8℃保存 DNA。

1.3.3SNP分型:采用聚合酶鏈?zhǔn)?連接酶檢測反應(yīng)方法對VEGF 基因位點(diǎn)936 C/T(rs3025039)進(jìn)行分型。上游引物為：AAACCTGAAATGAAGGAAGAG，下游引物：GTGGGTGGGTGTGTCTACAGG。TC探針：TTTTCATTCCCGGGCGGGTGACCCAGCAC，TT探針TTTTTTTCATTCCCGGGCGGGTGACCCAGCAT，TR探針：-P-GGTCCCTCTTGGAATTGGATTCGCCTTT-FAM-，擴(kuò)增目標(biāo)片段的長度是208bp。PCR反應(yīng)體系為15ul,94℃預(yù)變性3min，然后94℃變性15s，55℃退火15s，72℃延伸30s，共循環(huán)30次，最后72℃延伸3min。LDR反應(yīng)體系為10ul，94℃30s，56℃3min，循環(huán)30次進(jìn)行連接反應(yīng)，取1ul延伸產(chǎn)物，加8ul上樣loading，95度C變性3min，立即冰水浴，上測序儀。

2結(jié)果

2.1非小細(xì)胞肺癌組與對照組血清VEGF的表達(dá)水平:經(jīng)檢測VEGF血清水平符合正態(tài)分布，非小細(xì)胞肺癌組VEGF表達(dá)平均水平為211.75pg/mL，對照組為150.79pg/mL，非小細(xì)胞肺癌組VEGF表達(dá)水平顯著高于對照組通，P=0.001(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且非小細(xì)胞肺癌組平均水平明顯高于對照組,，證明VEGF可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有相關(guān)性。見表1。

表1　非小細(xì)胞肺癌組與對照組血清VEGF水平(pg/mL)

2.2VEGF-936C/T等位基因頻率的表達(dá):正常對照組VEGF-936C/T等位基因頻率經(jīng)遺傳平衡檢驗(yàn)，其分布符合Hardy-Weinberg定律(χ2=0.794，P>0.05),說明調(diào)查的正常群體具有代表性。VEGF-936C/T基因多態(tài)位點(diǎn)的分型結(jié)果如圖1所示。CC、TT、CT基因型在非小細(xì)胞肺癌組中分布頻率分別為65.0%、6.3%、28.7%，在對照組中分布頻率為70.0%、5.0%、25.0%，兩組間基因頻率分布差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.960，0.750

表2　VEGF-936C/T基因型分布及等位基因頻率比較 n(%)

2.3VEGF-936C/T基因多態(tài)性與非小細(xì)胞肺癌遺傳易感的關(guān)系:在非條件邏輯回歸分析中，以CC基因型為參照，TC基因型與CC基因型比較，兩組間基因型分布無差異，(OR=1.24，95%CI =0.61～2.52， P>0.05)，TT基因型與CC基因型比較。兩組間分布無顯著差異，(OR=1.35，95%CI =0.61～2.520.34～5.29，P>0.05)。VEGF-936C/T基因多態(tài)性基因型與非小細(xì)胞肺癌的遺傳易感性并無顯著關(guān)聯(lián)。見表3。

圖1　VEGF-936C/T多態(tài)位點(diǎn)的分型結(jié)果圖

基因型對照組(n=80)No(%)非小細(xì)胞肺癌組(n=80)No(%) OR(95%CI) P值CC56(70.0)52(65.0)1.00TC20(25.0)23(28.7)1.24(0.61～2.52)0.554TT4(5.0)5(6.3)1.35(0.34～5.29)0.670

3討論

非小細(xì)胞肺癌是肺癌最常見的病理類型，肺癌發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移是致使患者死亡的首要原因[3]。大量的研究發(fā)現(xiàn)，新生毛細(xì)血管的形成是原發(fā)實(shí)體腫瘤細(xì)胞的增殖和生長、轉(zhuǎn)移的必須條件，有多種因素影響新生血管的形成，其中VEGF就是一種高度特異的血管調(diào)控因子，在新生血管的形成中起極其重要的作用[4]。大量的研究證實(shí)，高表達(dá)的VEGF能夠促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，而當(dāng)阻斷VEGF的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑時(shí)，腫瘤血管生成和腫瘤自身的生長將會(huì)受到影響[5]。

研究表明，VEGF在多種腫瘤組織中呈高表達(dá)狀態(tài)，并且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有密切的關(guān)聯(lián)性。VEGF是一種同型二聚體糖蛋白，其基因定位于染色體6p21.3，是一個(gè)14-kb的編碼區(qū)，具有8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子。VEGF基因中至少有30個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(SNPs)，目前有研究證實(shí)，其中有的位點(diǎn)與VEGF基因自身的表達(dá)具有相關(guān)性[6]。單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)936 C/T(rs3025039)是VEGF基因中最常見的多態(tài)位點(diǎn)，有學(xué)者報(bào)道，在對VEGF-936T多態(tài)位點(diǎn)分析進(jìn)行研究中發(fā)現(xiàn)，攜帶VEGF-936T多態(tài)位點(diǎn)者患乳腺癌的危險(xiǎn)性較低[7]，而Kammerer等學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，VEGF-936T基因多態(tài)性能促進(jìn)口腔鱗狀細(xì)胞癌的進(jìn)展[8]。VEGF基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)-2578C/A、-460C/T和+405C/G，參與了肺癌的發(fā)展，但關(guān)于VEGF936C/T基因多態(tài)性與肺癌的關(guān)系的研究較少，且對于VEGF936C/T與人群肺癌易感性的關(guān)聯(lián)仍存在爭議。

本研究對非小細(xì)胞肺癌患者及健康人群中血清VEGF表達(dá)水平進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示非小細(xì)胞肺癌組VEGF水平顯著高于健康對照組，兩者具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05)。不同分期間VEGF表達(dá)水平的比較，研究發(fā)現(xiàn)VEGF的水平隨著腫瘤分期有逐漸升高的趨勢，表明VEGF與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展具有相關(guān)性，且可用VEGF水平推測病情進(jìn)展情況。此外本研究通過對VEGF基因位點(diǎn)936C/T多態(tài)性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示兩組間基因型及等位基因差別并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；CC、TT、CT基因型在非小細(xì)胞肺癌組中分布頻率與正常對照組中分布頻率的比較結(jié)果顯示，兩組間基因頻率分布差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.960，0.7500.05具體值)。C和T等位基因差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.968，0.2500.05)。這與Liu等[9]學(xué)者的研究報(bào)道相一致。以CC基因型作參照，TC及TT基因型與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病無明顯相關(guān)。

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